了亲和素非特异性结合高的缺点 根据生物素与亲和素或链酶亲和素间特异性结合的属性,通过与偶联有荧光 素或特定的报道酶如碱性磷酸酶( alkaline phosphatase)或辣根过氧化物酶 ( horseradish peroxidase)相互作用,形成“靶核酸-探针-生物素-亲和素-报道酶 (或荧光素)”连接复合体。之后,通过检测荧光物质的存在或使报道酶发生水 解生色或化学发光反应而完成对目的核酸的检测。但是,由于生物素普遍存在于 生物体内,因此在 Souther、 Northern和原位杂交中造成本底升高。另外,生物 素化的探针可牢固地结合于尼龙膜上,也可造成本底升高。鉴于生物素的以上缺 点,促使人们去寻找特异性强于生物素的其它探针标记物, (2)地高辛:地高辛( digoxigenin,Dig)是一种类固醇半抗原分子,可以通过 连接臂被人工连接于dUTP上,如形成Dg- 11-dUTP,在酶学反应中可代替 dTTP掺入到探针中去。自然界中只有洋地黄类植物产生地高辛,所以相对来说, 以地高辛标记的探针在 Southern、 Northern和原位杂交中本底较低,它的特异性 优于生物素。地高辛标记的杂交复合体,可用与报道酶如碱性磷酸酶或辣根过氧 化物酶偶联的抗地高辛的抗体加以检测,如使报道酶发生水解生色或化学发光反 (3)荧光素:核酸探针可以直接用荧光素( fluorecein)标记,如罗丹明或FITC。 荧光素标记的探针系统,使用的是荧光素-12-dUTP或荧光素-12-UTP(也有用荧 光素-ll-dUTP或荧光素-11UTP)代替dTPP或TP在酶学反应中掺入到探针中 去,然后用连接有报道酶如碱性磷酸酶( alkaline phosphatase)或辣根过氧化物 酶( horserad ish peroxidase)的抗荧光素抗体检测。 (二)探针标记的方法 总体看来,核酸探针标记的方法有两大类:酶促法和光化学标记法。酶促法 是通过酶促反应预先将标记物标记在核苷酸分子上,常用的核酸探针标记的酶促 法有缺口平移法、PCR末端填补法、随机引物标记法和转录标记法等。光化学 标记法是将生物素的衍生物一连接有硝基苯叠氮的生物素一光敏生物素在UV 或强可见光(350nm)照射激发下,形成的一个芳香硝基中间化合物(氮宾)可 以非特异性地与DNA或RNA形成稳定的共价键而将生物素引入已经合成好的 核酸探针中,这样,标记有生物素的探针可以被亲和素标记的报道酶或荧光物质了亲和素非特异性结合高的缺点。 根据生物素与亲和素或链酶亲和素间特异性结合的属性，通过与偶联有荧光 素或特定的报道酶如碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）或辣根过氧化物酶 （horseradish peroxidase）相互作用，形成“靶核酸-探针-生物素-亲和素-报道酶 （或荧光素）”连接复合体。之后，通过检测荧光物质的存在或使报道酶发生水 解生色或化学发光反应而完成对目的核酸的检测。但是，由于生物素普遍存在于 生物体内，因此在 Southern、Northern 和原位杂交中造成本底升高。另外，生物 素化的探针可牢固地结合于尼龙膜上，也可造成本底升高。鉴于生物素的以上缺 点，促使人们去寻找特异性强于生物素的其它探针标记物。 （2）地高辛：地高辛(digoxigenin, Dig)是一种类固醇半抗原分子，可以通过 一连接臂被人工连接于 dUTP 上，如形成 Dig-11-dUTP，在酶学反应中可代替 dTTP 掺入到探针中去。自然界中只有洋地黄类植物产生地高辛，所以相对来说， 以地高辛标记的探针在 Southern、Northern 和原位杂交中本底较低，它的特异性 优于生物素。地高辛标记的杂交复合体，可用与报道酶如碱性磷酸酶或辣根过氧 化物酶偶联的抗地高辛的抗体加以检测，如使报道酶发生水解生色或化学发光反 应。 （3）荧光素：核酸探针可以直接用荧光素(fluorecein)标记，如罗丹明或 FITC。 荧光素标记的探针系统，使用的是荧光素-12-dUTP 或荧光素-12-UTP（也有用荧 光素-11-dUTP 或荧光素-11-UTP）代替 dTTP 或 TTP 在酶学反应中掺入到探针中 去，然后用连接有报道酶如碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）或辣根过氧化物 酶（horseradish peroxidase）的抗荧光素抗体检测。 （二）探针标记的方法 总体看来，核酸探针标记的方法有两大类：酶促法和光化学标记法。酶促法 是通过酶促反应预先将标记物标记在核苷酸分子上，常用的核酸探针标记的酶促 法有缺口平移法、PCR 末端填补法、随机引物标记法和转录标记法等。光化学 标记法是将生物素的衍生物—连接有硝基苯叠氮的生物素—光敏生物素在 UV 或强可见光（350nm）照射激发下，形成的一个芳香硝基中间化合物（氮宾）可 以非特异性地与 DNA 或 RNA 形成稳定的共价键而将生物素引入已经合成好的 核酸探针中，这样，标记有生物素的探针可以被亲和素标记的报道酶或荧光物质