配制好的培养基必须经过灭菌后方能使用，培养基的灭菌一般是用高压蒸汽灭菌法（又 称湿热灭茵)。其原理是利用高压来提高蒸汽的温度，达到完全灭菌的目的。将要灭菌的培 养基、灭菌水等置于灭菌锅中， 一般锅中加入 4000毫升（不同的高压灭菌锅加水的 量不同)，密闭锅盖，打开排气活门，加热至锅内空气全部排除（可根据活门冲击的全部是 燕汽时来确定排气是否彻底)，即可关闭排气活门。锅内压力逐渐提高。当压力表指针达到 每平方时为15磅压力时（即1.1公斤/平方厘米，蒸汽温度相当于121℃）时，开始计算灭 均时间，一般液体培养基保持20一30分钟：固体培养基保持40一60分钟，然后停止加温。 略微打开排气活门 使蒸汽慢慢排出来 蒸汽全部 出后，即可打开锅盖，将培养基等取 出冷却。如需用固体斜面培养基，则将试管斜放在桌上冷却既成。 4.灭菌水的配制 量取10毫升的蒸馏水（或自来水）置试管中，加棉花塞后灭菌。 5,玻璃器皿的灭菌 培养用的玻璃器皿通常采用干热灭菌。方法是将需灭菌的器皿洗净擦干，用纸包好，或 放在金属盒内，置于干热灭菌箱（电烘箱）中，加温至165一175℃ 保持 小时后，即可 停加温。待温度逐渐下降到40℃以下，才能打开温箱取用，避免由于高温骤然下降而引起 玻璃器皿破裂。 二、 病原真菌和细菌的分离 分离就是用人工方法使某种病原微生物与寄主或与其它混杂的微生物分开来，即取得纯 的病原菌。病原菌的分离是柯赫氏证病定律中所要求的证病过程的一步，对于确定病原是必 须的。分离的方法很多，最为常用的是组织分离法和稀释分离法，其它方法都是对这两种基 本方法进行某些改变以适应特殊的病原和寄主。但不论何种分离方法，分离工作中的一切过 程和措施都是围绕着取得纯菌这一目的，因此必须排除和防止任何其它来源的微生物的污 染，应该在无菌条件下进行工作。最好是在分离室内的超净工作台上进行，如果没有分离三 和超净工作台，可在一间较小的空气静止的室内进行。分离前应把门窗关上，把工作台擦洗 干净，然后在台面铺一块湿毛巾。摆好工作用具，以便操作。 (一)组织分离法 1,叶片、细根组织内病原菌的分离 此法适用于分离病原物的菌丝生长于寄主组织内部的病害，大多数病原真菌可用此法 分离。组织分离的基本过程是在无菌条件下取一块感病组织放到培养基上培养。切取的组 ·般应位于病健交界处，以减少腐生菌的污染。因为腐生菌容易在生病很久已枯死或频死的 部分滋生。分离的具体法如下： (1)用清水洗净感病材料，用剪刀在病健交界处剪取0.3一0.5cm×0.3一05cm大小的组 Q-10h (2)先将剪下的分离组织置于 70%的 酒精中浸2一3秒钟，以抽气除去附在寄主组织表面 的气泡，使消毒剂能与寄主表面完全接触。 (3)然后将分离组织迅速移到0.1%升汞(HgC1)液中浸泡1一5分钟，进行表面消毒， 杀死组织表面的杂菌。 (4)经升汞水处理后的组织再移到无黄水中洗涤1一3次，除去残留的消毒剂」 将组织移到有PDA培养基平板的培养皿内 每均匀理4块组红 (5)分离完成后，贴上标签，注明病害名称、分离时期、分离者，然后放到25一28℃ 温度下培养。 2.肥厚多肉的组织内病原菌的分高 (1)用解剂刀沾试管内的酒精涂于病部附近，然后在酒精灯上烧去酒精，作表面消毒。2 配制好的培养基必须经过灭菌后方能使用，培养基的灭菌一般是用高压蒸汽灭菌法（又 称湿热灭菌）。其原理是利用高压来提高蒸汽的温度，达到完全灭菌的目的。将要灭菌的培 养基、灭菌水等置于灭菌锅中，一般锅中加入 2000－4000 毫升（不同的高压灭菌锅加水的 量不同），密闭锅盖，打开排气活门，加热至锅内空气全部排除（可根据活门冲击的全部是 蒸汽时来确定排气是否彻底），即可关闭排气活门。锅内压力逐渐提高。当压力表指针达到 每平方时为 15 磅压力时（即 1.1 公斤/平方厘米，蒸汽温度相当于 121℃）时，开始计算灭 均时间，一般液体培养基保持 20－30 分钟；固体培养基保持 40－60 分钟，然后停止加温。 略微打开排气活门，使蒸汽慢慢排出来。当蒸汽全部排出后，即可打开锅盖，将培养基等取 出冷却。如需用固体斜面培养基，则将试管斜放在桌上冷却既成。 ４. 灭菌水的配制 量取 10 毫升的蒸馏水（或自来水）置试管中，加棉花塞后灭菌。 ５. 玻璃器皿的灭菌 培养用的玻璃器皿通常采用干热灭菌。方法是将需灭菌的器皿洗净擦干，用纸包好，或 放在金属盒内，置于干热灭菌箱（电烘箱）中，加温至 165－175℃，保持 1 小时后，即可 停加温。待温度逐渐下降到 40℃以下，才能打开温箱取用，避免由于高温骤然下降而引起 玻璃器皿破裂。 二、 病原真菌和细菌的分离 分离就是用人工方法使某种病原微生物与寄主或与其它混杂的微生物分开来，即取得纯 的病原菌。病原菌的分离是柯赫氏证病定律中所要求的证病过程的一步，对于确定病原是必 须的。分离的方法很多，最为常用的是组织分离法和稀释分离法，其它方法都是对这两种基 本方法进行某些改变以适应特殊的病原和寄主。但不论何种分离方法，分离工作中的一切过 程和措施都是围绕着取得纯菌这一目的，因此必须排除和防止任何其它来源的微生物的污 染，应该在无菌条件下进行工作。最好是在分离室内的超净工作台上进行，如果没有分离室 和超净工作台，可在一间较小的空气静止的室内进行。分离前应把门窗关上，把工作台擦洗 干净，然后在台面铺一块湿毛巾。摆好工作用具，以便操作。 （一） 组织分离法 1．叶片、细根组织内病原菌的分离 此法适用于分离病原物的菌丝生长于寄主组织内部的病害，大多数病原真菌可用此法 分离。组织分离的基本过程是在无菌条件下取一块感病组织放到培养基上培养。切取的组织 一般应位于病健交界处，以减少腐生菌的污染。因为腐生菌容易在生病很久已枯死或濒死的 部分滋生。分离的具体法如下： （1）用清水洗净感病材料，用剪刀在病健交界处剪取 0.3—0.5cm×0.3—0.5cm 大小的组织 8—10 块。 （2）先将剪下的分离组织置于 70%的酒精中浸 2—3 秒钟，以抽气除去附在寄主组织表面 的气泡，使消毒剂能与寄主表面完全接触。 （3）然后将分离组织迅速移到 0.1%升汞（HgＣl）液中浸泡１—５分钟，进行表面消毒， 杀死组织表面的杂菌。 （4）经升汞水处理后的组织再移到无菌水中洗涤１—３次，除去残留的消毒剂。 将组织移到有ＰＤＡ 培养基平板的培养皿内，每皿均匀地摆 4 块组织。 （5）分离完成后，贴上标签，注明病害名称、分离时期、分离者，然后放到２５—２８℃ 温度下培养。 2. 肥厚多肉的组织内病原菌的分离 （1）用解剖刀沾试管内的酒精涂于病部附近，然后在酒精灯上烧去酒精，作表面消毒