(2)用解剂刀从键部开始将组织剖开，但勿使刀子接触病部，切至接近病部时将组织撕开。 (3)用灭菌的接种针或解剖刀在病部前缘（病键交接处）挑取一块病组织直接放在PD培 养基上，每 (二) 稀释分离法 此法适用于细菌性病害和大量产孢的真菌病害的病原分离，病原细菌一般都是用稀释分 离法分离。 】培养皿稀释分离法：取灭黄培皿三个，每个培养皿内加05m无茵水，根据成病组 织性质情况进行表面消毒（与分离病原真菌同）后，用灭菌的解削刀或钱子将组织，碎 加授动，静置数分钟，使组织中的细茵流入水中即成菌液。用灭菌的接种环从第 一培养皿 移一环菌液到第二培养皿中与水充分混合后，从中移一环到第三培养皿中与水充分混合。将 三角瓶中的培养基溶化后冷却到45℃左右，将培养基倒入第二、第三培养皿内（每皿约倒 10m)并使皿内的菌液与倒入的培养基充分混合，冷却后，将培养皿翻转，置于恒温箱内 培养。 平板划线分离法：取小块病组织 ,经表面消毒后 ,置于盛有0.5ml无菌水的培养皿内 用镊子把病组织撕碎，制成菌液。用已灭菌的接种环沾取少许菌液，在制好的培养基平板上 划线，先在平板上半边顺序划五条线，再将培养皿转90度，将接种环灭菌后，在第二条上 划五条垂直线，划线的目的是使细菌分开，以便得到单个菌体长成的菌落。划好线后，将培 养皿翻转，置于恒温箱内培养 (三)注意事项： 切取的分离组织材料不宜太大块，否则污染的机会多 2. 表面消毒力求彻底而又不至于杀死组织内的病原菌，故必须掌握好消毒时间的长短。 3.操作及接种过程中都要在酒精灯火旁进行。分离过程不要讲话、走动，否则容易污染。 三、 病原真菌和细菌的人工接种 用人工的方法使寄生物接触和侵入寄主并诱导引起发病称为人工接种。人工接种是柯制 氏证病律中一项最重要的步骤，对大多数病原鉴定工作来说，接种是必须的。此外，植物病 害接种技术在寄主范围和品种抗病性的测定、病原致病性的变异、病害的发生和流行条件研 究以及防治试验中都有着广泛的应用。 接种主要是让病原与寄主接触并促进其发生侵染。因此。传播方式不同的病害要用不同 的方法接种，常用的有 资酒、淋根、制造伤口后接菌以及使用带菌、 带毒的媒介昆虫等方法 (一)孢子悬浮液的配制： 病原真菌进行人工接种时要配制一定浓度的孢子悬浮液。比较粗略的方法是在载玻片上 加1滴孢子悬浮液，加盖玻片后在低倍镜下检查孢子数，然后将原来的孢子悬浮液适当稀释， 使每个视野中达到一定的所需要的孢子数目。比较精确的方法是计测每毫升悬浮液中孢子的 数目。常使用纽鲍尔(Neubau )血 计数 血球计数计是一块很厚的载玻片，在板的中 央部分刻有400个(25大格×16小格)小方 ，总面积为1平方毫米，小格的深度是0. 毫米，当加盖玻片后，即成一个体积为01立方毫米的空间。每个小方格的边长为0.05毫米 每小格的面积是0.0025平方毫米，所以加盖玻片后每小格的容积是0.00025立方毫米，它的 容积是1/4000000毫米 测数时，牛将盖玻片放在血球计数计上右刻度的位置，从盖破片的一加1滴话当稀 的孢子悬浮液（使每小格中只有5 个孢子)，在低倍镜下找到板上的方格后，转到高倍镜 下计算孢子数，统计四个角上的四个大格和中央一个大格（共5个大格即80个小格）的孢 子数，按下列式计算每毫升悬浮液中分生孢子数目： 3 3 （2）用解剖刀从键部开始将组织剖开，但勿使刀子接触病部，切至接近病部时将组织撕开。 （3）用灭菌的接种针或解剖刀在病部前缘（病键交接处）挑取一块病组织直接放在 PDA 培 养基上，每皿放 4 块。 （二） 稀释分离法 此法适用于细菌性病害和大量产孢的真菌病害的病原分离，病原细菌一般都是用稀释分 离法分离。 １. 培养皿稀释分离法：取灭菌培养皿三个，每个培养皿内加０.５ml 无菌水，根据感病组 织性质情况进行表面消毒（与分离病原真菌同）后，用灭菌的解剖刀或镊子将组织撕碎，略 加搅动，静置数分钟，使组织中的细菌流入水中即成菌液。用灭菌的接种环从第一培养皿中 移一环菌液到第二培养皿中与水充分混合后，从中移一环到第三培养皿中与水充分混合。将 三角瓶中的培养基溶化后冷却到４５℃左右，将培养基倒入第二、第三培养皿内（每皿约倒 10ml）并使皿内的菌液与倒入的培养基充分混合，冷却后，将培养皿翻转，置于恒温箱内 培养。 ２. 平板划线分离法：取小块病组织，经表面消毒后，置于盛有 0.5ml 无菌水的培养皿内， 用镊子把病组织撕碎，制成菌液。用已灭菌的接种环沾取少许菌液，在制好的培养基平板上 划线，先在平板上半边顺序划五条线，再将培养皿转 90 度，将接种环灭菌后，在第二条上 划五条垂直线，划线的目的是使细菌分开，以便得到单个菌体长成的菌落。划好线后，将培 养皿翻转，置于恒温箱内培养。 （三）注意事项： 1. 切取的分离组织材料不宜太大块，否则污染的机会多。 2. 表面消毒力求彻底而又不至于杀死组织内的病原菌，故必须掌握好消毒时间的长短。 3. 操作及接种过程中都要在酒精灯火旁进行。分离过程不要讲话、走动，否则容易污染。 三、 病原真菌和细菌的人工接种 用人工的方法使寄生物接触和侵入寄主并诱导引起发病称为人工接种。人工接种是柯赫 氏证病律中一项最重要的步骤，对大多数病原鉴定工作来说，接种是必须的。此外，植物病 害接种技术在寄主范围和品种抗病性的测定、病原致病性的变异、病害的发生和流行条件研 究以及防治试验中都有着广泛的应用。 接种主要是让病原与寄主接触并促进其发生侵染。因此。传播方式不同的病害要用不同 的方法接种，常用的有喷洒、淋根、制造伤口后接菌以及使用带菌、带毒的媒介昆虫等方法。 （一）孢子悬浮液的配制： 病原真菌进行人工接种时要配制一定浓度的孢子悬浮液。比较粗略的方法是在载玻片上 加 1 滴孢子悬浮液，加盖玻片后在低倍镜下检查孢子数，然后将原来的孢子悬浮液适当稀释， 使每个视野中达到一定的所需要的孢子数目。比较精确的方法是计测每毫升悬浮液中孢子的 数目。常使用纽鲍尔（Neubauer）血球计数计。血球计数计是一块很厚的载玻片，在板的中 央部分刻有 400 个（25 大格×16 小格）小方格，总面积为 1 平方毫米，小格的深度是 0.1 毫米，当加盖玻片后，即成一个体积为 0.1 立方毫米的空间。每个小方格的边长为 0.05 毫米， 每小格的面积是 0.0025 平方毫米，所以加盖玻片后每小格的容积是 0.00025 立方毫米，它的 容积是 1/4000000 毫米。 测数时，先将盖玻片放在血球计数计上有刻度的位置，从盖玻片的一侧加 1 滴适当稀释 的孢子悬浮液（使每小格中只有 5—6 个孢子），在低倍镜下找到板上的方格后，转到高倍镜 下计算孢子数，统计四个角上的四个大格和中央一个大格（共 5 个大格即 80 个小格）的孢 子数，按下列式计算每毫升悬浮液中分生孢子数目: