对于某些酶促反应过程中会产生H或减少H的反应来说,用、 1000DH单位的pH计测定反 应液的pH变化,或为保持pH不变而加入酸或碱,记录一段时间内加入的酸碱量。 3.2.52电位测定 在一些酶促氧化还原反应中,底物和产物具有不同的氧化还原电位,可用由一恒定微电流极 化的两个铂电极之间的电位差来测定电位变化 3.2.53电流测定 原理同上,以恒定电压的两个铂电极测电流变化。 3.26化学反应法( chemical reaction) 酶促反应一段时间后,取出一部分反应液,用化学方法分析底物或产物的量。如ACC的测 定:加HgCl2终止反应,加 NaOcI-NaOH混合液使ACC转化成乙烯,再用气相色谱测乙烯。 3.3酶的分离纯化 33.1酶分离纯化的一般原则 酶的分离纯化是酶学研究的基础,对于不同的研究内容需要不同纯度的酶制剂。因为酶是蛋 白质,所以分离纯化蛋白质的方法也都适用于酶的分离纯化。但酶又有特殊性,利用它们的特殊 性还可以设计出特殊的纯化方法。为了进行酶学研究,必须获得适量的酶。首先要选择适当的材 料,破碎细胞(酶存在于细胞外则不必破碎细胞)。若酶主要存在于某一细胞器中,应尽量分离 出该细胞器。纯化酶的过程中要注意保护酶的活性,每一步骤后都要测量酶活性及蛋白质浓度, 算出比活性、收率及纯化倍数。若某一步骤的收率或纯化倍数太低,说明该步骤不合适。酶纯化 般在低温条件下进行(0~4℃),但也有些酶有冷失活现象,如丙酮酸羧化酶在25℃下最稳定 低温下容易失活。有些酶虽然本身耐高温,但只要其没有冷失活现象,也应在低温下操作,这样 能抑制蛋白酶对目标酶的破坏作用。各种溶液(抽提液、萃取液、层析用液等)应该用缓冲液 pH应调到使酶最稳定的pH。若需要用到较酸或较碱的pH(如三氯乙酸沉淀),应尽量缩短时间 有机溶剂沉淀时也要尽量缩短时间,尽快除去有机溶剂。各种溶液中还可以加入酶保护剂,常用 的酶保护剂有巯基保护剂(巯基乙醇、谷胱甘肽GSH、二硫苏糖醇DII)、金属离子、EDIA、 辅酶等,有时还可加入甘油、牛血清白蛋白、明胶。 用于酶纯化的方法主要有:分级沉淀、柱层析、萃取、制备电泳等。3 对于某些酶促反应过程中会产生 H ＋或减少 H ＋的反应来说，用 1000 1 pH 单位的 pH 计测定反 应液的 pH 变化，或为保持 pH 不变而加入酸或碱，记录一段时间内加入的酸碱量。 3.2.5.2 电位测定 在一些酶促氧化还原反应中，底物和产物具有不同的氧化还原电位，可用由一恒定微电流极 化的两个铂电极之间的电位差来测定电位变化 3.2.5.3 电流测定 原理同上，以恒定电压的两个铂电极测电流变化。 3.2.6 化学反应法（chemical reaction） 酶促反应一段时间后，取出一部分反应液，用化学方法分析底物或产物的量。如 ACC 的测 定：加 HgCl2终止反应，加 NaOCl-NaOH 混合液使 ACC 转化成乙烯，再用气相色谱测乙烯。 3.3 酶的分离纯化 3.3.1 酶分离纯化的一般原则 酶的分离纯化是酶学研究的基础，对于不同的研究内容需要不同纯度的酶制剂。因为酶是蛋 白质，所以分离纯化蛋白质的方法也都适用于酶的分离纯化。但酶又有特殊性，利用它们的特殊 性还可以设计出特殊的纯化方法。为了进行酶学研究，必须获得适量的酶。首先要选择适当的材 料，破碎细胞（酶存在于细胞外则不必破碎细胞）。若酶主要存在于某一细胞器中，应尽量分离 出该细胞器。纯化酶的过程中要注意保护酶的活性，每一步骤后都要测量酶活性及蛋白质浓度， 算出比活性、收率及纯化倍数。若某一步骤的收率或纯化倍数太低，说明该步骤不合适。酶纯化 一般在低温条件下进行（0～4℃），但也有些酶有冷失活现象，如丙酮酸羧化酶在 25℃下最稳定， 低温下容易失活。有些酶虽然本身耐高温，但只要其没有冷失活现象，也应在低温下操作，这样 能抑制蛋白酶对目标酶的破坏作用。各种溶液（抽提液、萃取液、层析用液等）应该用缓冲液， pH 应调到使酶最稳定的 pH。若需要用到较酸或较碱的 pH（如三氯乙酸沉淀），应尽量缩短时间。 有机溶剂沉淀时也要尽量缩短时间，尽快除去有机溶剂。各种溶液中还可以加入酶保护剂，常用 的酶保护剂有巯基保护剂（巯基乙醇、谷胱甘肽 GSH、二硫苏糖醇 DTT）、金属离子、EDTA、 辅酶等，有时还可加入甘油、牛血清白蛋白、明胶。 用于酶纯化的方法主要有：分级沉淀、柱层析、萃取、制备电泳等