但在实际工作中,人们为了工作方便,往往对不同的酶使用不同的酶活单位。 3.2酶活性测定的主要方法 酶活性的测定应再最适酶反应条件下进行(温度、pH、离子强度、反应时间等),可测定反 应物的减少量或产物的生成量。随着反应的进行,底物减少,产物积累,会使得反应速度变慢。 因此,必须测定反应的初速度。通常以底物浓度的变化在起始浓度的5%以内的速度为初速度的 近似值。酶反应速度可用单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示,而酶反应速度又与酶 浓度密切相关 321分光光度法( spectrophotometry) 硝酸还原酶将NO3还原成NO2,NO2与加入的显色剂对一氨基苯磺酸和a一萘胺反应 生成玫瑰红色的偶氮化合物,在520nm处比色可测定产物的生成量。一些脱氢酶以NAD或 NADP为辅酶,NAD或NADP在340nm处光吸收很少,而其还原形式NADH和 NADPH在 340nm处光吸收较大,因此可以测定340nm处的光吸收变化来检 (乳酸脱氢酶) 测NADH和 NADPH的生成或减少,从而得知脱氢酶的活性 丙酮酸 乳酸 ADH NAD 对于一些底物或产物没有光吸收变化的酶反应,可以偶联一 个适当的酶,以原初反应的产物作为偶联酶的底物,而偶联酶的产物可用分光光度法测定 322旋光测定法( polarimetry) 若底物和产物的旋光性不同,可通过测定反应混合物的旋光性(方向和大小)变化来测定酶 活性。 3.23荧光法( fluorescence) 氧化态的黄素( flavin)化合物发出强烈的荧光,还原态失去荧光。NAD和NADP无荧光, 而NADH和 NADPH有460nmn蓝色荧光。荧光法灵敏度高 324同位素测定法 用放射性同位素标记底物,酶反应后分离产物,测产物的放射性强度。此法灵敏度高,但分 离产物较麻烦。若底物或产物中有一种是气体,就易于分离 325电化学方法( electrochemistry) 32.51pH测定2 高。 但在实际工作中，人们为了工作方便，往往对不同的酶使用不同的酶活单位。 3.2 酶活性测定的主要方法 酶活性的测定应再最适酶反应条件下进行（温度、pH、离子强度、反应时间等），可测定反 应物的减少量或产物的生成量。随着反应的进行，底物减少，产物积累，会使得反应速度变慢。 因此，必须测定反应的初速度。通常以底物浓度的变化在起始浓度的 5%以内的速度为初速度的 近似值。酶反应速度可用单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示，而酶反应速度又与酶 浓度密切相关。 3.2.1 分光光度法（spectrophotometry） 硝酸还原酶将 NO3－ 还原成 NO2－，NO2－ 与加入的显色剂对－氨基苯磺酸和α－萘胺反应 生成玫瑰红色的偶氮化合物，在 520nm 处比色可测定产物的生成量。一些脱氢酶以 NAD+或 NADP +为辅酶，NAD+或 NADP +在 340nm 处光吸收很少，而其还原形式 NADH 和 NADPH 在 340nm 处光吸收较大，因此可以测定 340nm 处的光吸收变化来检 测 NADH 和 NADPH 的生成或减少，从而得知脱氢酶的活性。 对于一些底物或产物没有光吸收变化的酶反应，可以偶联一 个适当的酶，以原初反应的产物作为偶联酶的底物，而偶联酶的产物可用分光光度法测定。 3.2.2 旋光测定法（polarimetry） 若底物和产物的旋光性不同，可通过测定反应混合物的旋光性（方向和大小）变化来测定酶 活性。 3.2.3 荧光法（fluorescence） 氧化态的黄素（flavin）化合物发出强烈的荧光，还原态失去荧光。NAD+ 和 NADP +无荧光， 而 NADH 和 NADPH 有 460nm 蓝色荧光。荧光法灵敏度高。 3.2.4 同位素测定法（isotope determination） 用放射性同位素标记底物，酶反应后分离产物，测产物的放射性强度。此法灵敏度高，但分 离产物较麻烦。若底物或产物中有一种是气体，就易于分离。 3.2.5 电化学方法（electrochemistry） 3.2.5.1 pH 测定