2.3.2不对称 PCR (asymmetric PCR) Gyllensten和 Erlich改进了 PCR方案。在扩增循环中引入 不同引物浓度,由此得到单链 DNA。一般采用50~-100:1比 例的引物浓度,在最初10~15 个循环中主要产物还是双链 DNA,但当低浓度引物被消耗 尽后,高浓度引物介导的PCR 反应就会产生大量单链DNA (single strand dNa, ssdNA (图2-12-5)。分离此扩增产物 中的sDNA可用原引物或第三 条内部引物直接测序。 2.3.3反向PCR( I nverse Inverse-(D)-PCR a DNA with a region of known sed and flanked by restriction sites A within re gions of unknown sequence b. Digestion with enzyme a cleaves the DNA c Ligation of the linear fragments to generate circular DNA molecules 反 d. Digestion with B opens the circular 向 DNA to recreate linear fragments where the unknown sequence is now flanked by portions of the known sequent R 的 e PCR using primers designed from the known sequence generates PRpe用 wo known sequence converged 则 at restriction site A 可 对 个已知的DNA片段两侧的未知 序列进行扩增和研究。选择已知 序列内部没有切点的限制酶对 此段DNA进行酶切,连接形成2.3.2 不对称 PCR(asymmethic PCR) Gyllensten 和 Erlich 改进了 PCR 方案。在扩增循环中引入 不同引物浓度，由此得到单链 DNA。一般采用 50~100∶1 比 例的引物浓度，在最初 10~15 个循环中主要产物还是双链 DNA，但当低浓度引物被消耗 尽后，高浓度引物介导的 PCR 反应就会产生大量单链 DNA （single strand DNA，ssDNA） （图 2-12-5）。分离此扩增产物 中的 ssDNA 可用原引物或第三 条内部引物直接测序。 2.3.3 反向 PCR (inverse P C R ) 反 向 P C R 的 应 用 则 可 以 对 一 个已知的 DNA 片段两侧的未知 序列进行扩增和研究。选择已知 序列内部没有切点的限制酶对 此段 DNA 进行酶切，连接形成