中国兽药杂志 1998,32(4):9~12/叶雪平等 瓶,按常规法静置培养(以下称方瓶法) 表2几种病毒增殖方法的效率比较 1.4转管培养釆用200ml玻璃圆瓶,在 病毒滴度(以对数值表示) AD-1型单细胞旋转培养机上培养(以下称 培养 增殖量 方法 转管法 TClDse LDEa TCIDso LD5o TCIDso LDs 1.5细胞生物反应器微载体悬浮培养釆 方瓢法 75.32.62.3 用NBS细胞生物反应器,以GT2微载体为 转管法 载体(以下称反应器法),浓度为4~5mg/ 反应器法3,753.08.06.754.253.75 ml,细胞接入浓度为30~50万/m细胞吸 从表2可知,上述几种培养方法增殖病 附的后开始搅拌,搅拌速度为4rmn,空毒,以反应器最高与方瓶法相比较病毒滴 气饱和度为40%细胞培养液的pH为68度以 TCID法测定可增加1.65对数值, 70。细胞在微载体上长满单层后,以吸附LDn法测定可增加1.45对数值。 法接入病毒维持液的pH为74~76,第42.3几种疫苗生产工艺的经济效益比较 6d收获病毒。具体方法按文献进行。 以上几种培养方法增殖细胞和病毒后,在相 1.6疫苗的制备和敬价測定按文献所同条件下制备免疫保护率80%以上的细胞 述方法进行 2结果 疫苗,以生产周期、一次生产量、所需培养液 成本(199培养基、小牛血清、抗生素微载体 2.1纽胞增殖方法的效率比较在细胞和等)以及操作条件(包括加液进样、pH调节 培养液相同的条件下,我们比较了方瓶静置等)等指标进行分析比较结果详见表3 培养、旋转管培养和细胞生物反应器微载体 表3几种疫苗制备工艺的经济效益比较 悬浮培养增殖细胞的效率,结果详见表1。 生产1L疫苗所操作 制备工艺 生产量需培养液成本控 表1几种细胞增殖方法的效率比较 方瓶法14~180.3 76.00 人工 细胞生培养液 较静置 方法ym几100,10个)高(数 转管法14~181~1.516.48~23.92人工 反应器法14~1824~309.26~11.18自动 方瓶法002860.30.09512~1540~50 转管法.220 167~200 从表3可知,细胞生物反应器微载体培 反应器法281224960~120800~1000 养法制备疫苗,具有一次生产量大、单位产量 成本低、能自动控制、所化人力较少等优点 从表1可知反应器法增殖细胞,具有细本次实验只使用1,51L的细胞生物反应器 胞生长面积大、消耗的培养液少单位培养液若使用5L或以上的细胞反应器其一次性 细胞产量高的特点较方瓶法提高细胞产量产量可更高。因此以细胞生物反应器微载体 20~25倍。因此细胞生物反应器微载体悬浮培养法为基本生产工艺制备细胞疫苗完全 培养法增殖细胞是一种高效低耗的方法。 符合工厂化生产的要求 22病毒增殖方法的比较以这3种方法24细胞疫苗工厂化生产工艺流程在实 增殖细胞后将ZV8909毒株的病毒液接入验室制备细胞疫苗研究的基础上,应用细胞 细胞,经病毒增殖后,收获病毒培养液,以生物反应器微载体培养法增殖细胞和病毒为 TCIDSD和LD法测定接入前和病毒增殖后基本生产工艺制备细胞疫苗的工厂化生产工 的毒力测定结果列于表2(以对数值表示)。艺流程,以下图1表示。· 10· 中国兽药杂志 1998,32(4)9~12/叶雪平等 瓶 ,按常规法静置培养(以下称方瓶法)。 1.4 转 管培 养 采 用 200ml玻 璃 圆瓶 ,在 AD 1型单细胞旋 转培 养机上培养 (以下称 转管法)L2j。 1.5 细胞 生物 反 应 器微 载体 悬 浮 培 养 采 用 NBS细胞生物反应器 ,以 GT一2徽载体为 载体 (以下 称反应 器 法),浓 度 为 4~5mg/ ml,细 胞接 入浓 度 为 3O~50万 /ml。细 胞 吸 附 6h后开始搅拌 ,搅拌速度 为 40r/min,空 气饱和 度为 40 ,细胞培养液 的 pH 为 6.8 ~ 7.0。细 胞在 徽载 体上 长 满单 层后 ,以 吸附 法接入病毒 .维持液的 pH 为 7.4~7.6,第 4 ~ 6d收获病毒。具体方法按文献“进行。 1.6 疫苗 的制备和数价测定 按文献 所 述 方 法进 行 2 结 果 2.1 细胞增殖方法 的效 率比较 在细胞和 培养液相同的条件下 ,我们比较了方瓶静置 培养、旋转管培养和细胞生物反应器 徽载体 悬浮培养增殖细胞的效率,结 果详见表 1。 表 1 几种细胞增殖方 法的效率 比较 (m)(mZ/L)颦(10十)oM'tl 从表 l可知反应器法增殖细胞 ,具 有细 胞生长面积太、消耗的培养液少 、单位培养液 细胞产量高的特点 ,较方瓶法提 高细胞产量 20~25倍 因此细胞生物反应器徽载体悬浮 培养法增殖细胞是一种高效低耗的方法 。 2.2 病 毒 增 殖 方 法 的 比较 以这 3种方 法 增殖细胞后,将 ZV一8909毒株的病毒液接入 细胞 ,经病 毒增 殖 后 ,收获 病毒 培 养液 ,以 TCIDs。和 LDo法测定接入前和病 毒增 殖后 的毒力,测定结果列于表 2(以对数值表示 )。 表 2 几种病毒 增殖 方法 的效牢 比较 病 毒滴 度(以对数值表示) _二 二_ TCID~0LDE0TCID5。L 0TCID50Lifo 方 瓶}击 31 3.O 5.7 5.3 2.6 23 转管法 31 30 6.5 58 3.4 2.8 反 应 器 法 3 75 3 0 8.0 675 4.25 3.75 从表 2可知,上述几种培养方法增殖病 毒 ,以反应器最高,与方瓶法相 比较 ,病毒滴 度 以 TCID。法 测定 可 增 加 1.65对 数 值 , LD5。法测定可增加 1_45对数值。 2.3 几种疫苗 生产工艺的经济效 益比较 以上几种培养方 法增殖细胞和病毒后 ,在相 同条件下制 备免疫保 护率 8O 以上的细胞 疫苗 ,以生产周期 、一次生产量 、所需培养液 成本(199培养基、小牛血清、抗 生素、徽载体 等)以及操作 条件(包括 加液、进样、pH 调节 等)等指标进行分析比较 ,结果详见表 3。 表 3 几种疫苗制备工艺的经济效益比较 从表 3可知 ,细胞生物反应 器微载体培 养法制备疫苗 ,具有一次生产量大 、单位产量 成本 低、能 自动控制、所化人力较 少等优 点 本次实验只使 用 1.5L的细胞生物反应器 , 若使 用 5L或以上的细胞反应 器,其一次性 产量可更高 。因此以细胞生物反应器微载体 培养法为基本 生产工艺制备细胞疫苗 ,完全 符合工厂化生产的要求。 2.4 细胞疫苗工厂化生产工 艺流程 在实 验室制备细胞疫苗研究的基础上,应用细胞 生物反应器微载体培养法增殖细胞和病毒为 基本生产工艺制备细胞疫苗的工 厂化生产工 艺流程 ,以下图 1表示 。 维普资讯 http://www.cqvip.com