(NDAH),使pH发生变化的物质。因为H2O2有上述指示反应,所以常利用可以产生H2O2的始 发反应。 NAD(P)H在340nm处有光吸收,而NAD(P)没有,用紫外比色可以测定 NAD(P)H的 变化,所以产生或消耗NADP)H的反应也可作为指示反应。若没有适当的始发反应可以利用, 可在始发反应与指示反应之间加一个或两个中间反应 a.肌酸激酶的测定: 始发反应: ADP 机酸微酶 中间反应:ATP+葡萄糖匚6磷酸葡萄糖+ADP 指示反应:6-磷酸葡萄糖十NAD鬣6-磷酸葡萄糖酸+NADH 酶法测定甘油三酯 始发反应:甘油三酯甘油+脂肪酸 中间反应I:甘油+ATP甘酶甘油-3-磷酸+ADP 中间反应Ⅱ:ADP+PEP 丙削酸微酶 丙酮酸+ATP 指示反应:丙酮酸+NADH乳酸氢乳酸+NAD 11.22底物测定原理 1122.1平衡法 平衡法是测定酶反应达到平衡时的产物生成量。该法要考虑反应的平衡常数、达到平衡点所 需要的时间、所需的酶量和辅酶或辅反应物的量。设反应如下: s+cm,P+式中S代表待测底物,C是辅酶或辅反应物,P和Q是反应产物。 反应达到平衡时用掉的底物比例越高,测定的结果越精确。反应的平衡常数越大,辅酶或辅反应 物与底物的浓度比越大,平衡时用掉的底物就越多(表9.1)。 表9.1达到所述百分转化率所需的C:S0比率 百分转化率 (Co:So比率) 99.5% 200 5 99.9% 1000 200 100 20 平衡常数大时所需辅酶或辅反应物的量就少。在低Ks值时要求非常高的Co:So比率,但在 实际使用时,Co太高可能会不溶解,也可能会对酶产生抑制作用。在低Keq值时可以加入某种(NDAH)，使 pH 发生变化的物质。因为 H2O2 有上述指示反应，所以常利用可以产生 H2O2 的始 发反应。NAD(P)H 在 340nm 处有光吸收，而 NAD(P)＋没有，用紫外比色可以测定 NAD(P)H 的 变化，所以产生或消耗 NAD(P)H 的反应也可作为指示反应。若没有适当的始发反应可以利用， 可在始发反应与指示反应之间加一个或两个中间反应。 a. 肌酸激酶的测定： 始发反应： ＋ ADP 肌酸激酶 ———→ 肌酸 ＋ ATP 中间反应： ATP ＋ 葡萄糖 己糖激酶 ———→ 6-磷酸葡萄糖 ＋ ADP 指示反应：6-磷酸葡萄糖 ＋ NAD 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 ————————→ 6-磷酸葡萄糖酸 ＋ NADH b. 酶法测定甘油三酯： 始发反应： 甘油三酯 脂肪酶 ——→ 甘油 ＋ 脂肪酸 中间反应Ⅰ： 甘油 ＋ ATP 甘油激酶 ———→ 甘油-3-磷酸 ＋ ADP 中间反应Ⅱ： ADP ＋ PEP 丙酮酸激酶 ————→ 丙酮酸 ＋ ATP 指示反应： 丙酮酸 ＋ NADH 乳酸脱氢酶 ————→ 乳酸 ＋ NAD 11.2.2 底物测定原理 11.2.2.1 平衡法 平衡法是测定酶反应达到平衡时的产物生成量。该法要考虑反应的平衡常数、达到平衡点所 需要的时间、所需的酶量和辅酶或辅反应物的量。设反应如下： 式中 S 代表待测底物，C 是辅酶或辅反应物，P 和 Q 是反应产物。 反应达到平衡时用掉的底物比例越高，测定的结果越精确。反应的平衡常数越大，辅酶或辅反应 物与底物的浓度比越大，平衡时用掉的底物就越多(表 9.1)。 表 9.1 达到所述百分转化率所需的 C0 : S0 比率 百分转化率 Keq 1 5 10 20 （C0 : S0 比率） 99.0％ 100 20 10 1 99.5％ 200 40 20 5 99.9％ 1000 200 100 20 平衡常数大时所需辅酶或辅反应物的量就少。在低 Keq 值时要求非常高的 C0 : S0 比率，但在 实际使用时，C0 太高可能会不溶解，也可能会对酶产生抑制作用。在低 Keq 值时可以加入某种