王林,等.恒温扩増HPⅤ检测技术应用于子宫颈癌筛査的效果评价硏究 结果保持高度一致,灵敏度要高于GP5+/6+引 lial lesion,HISL),鳞状细胞癌( Squamous Cell 物,是一种可靠、有效的检测 HPV DNA的方法 Carcinoma,SCC)。 本研究通过比较 Iomega与HC2检测HR-HPV的4HPⅤVDNA检测 致性,以及以 INNO-LiPA结果为标准,评价Iso41主要仪器与试剂 ega检测HPV16和HPV18的准确性,探讨Iso 五通道荧光定量PCR检测系统(江苏中生方政 mega HPⅤ检测技术在宫颈癌及癌前病变筛查中的公司)、干式恒温器(江苏海门其林贝尔仪器公司)、 可行性及应用价值 omega HPV检测试剂盒(江苏中生方政公司); HC2检测系统(DML2000基因杂交信号放大仪、 材料与方法 旋涡振荡器、自动恒温加热仪)及HC2检测试剂盒 (德国 QIAGEN公司)、水浴锅(北京长风仪器公 1研究对象 司);杂交炉( Fisher Scientific公司)、96孔PCR热 本研究于2016年6月至8月在我国内蒙古地循环仪( Applied Biosystems9700)、 Auto-LiPA48 区招募2774例年龄在30~64岁之间、有性生活仪( Innogenetics)、 QIAamp96DNA提取试剂盒 史、宫颈完整、自愿接受筛查的非妊娠妇女,所有参(德国 QIAGEN公司)、 INNO-LIPA HPV基因扩 加本研究的妇女均签署知情同意书。研究方案经中增试剂盒( Innogenetics)。 国医学科学院肿瘤医院伦理委员会批准,批准文号42 Iomega检测 为15-146/1073。 吸取1ml存放在细胞保存液中的样本于离心 2标本采集与处理 管中,高速离心10min,再除去上清液,加入100d 由内蒙古杭锦旗妇幼保健院的妇科医生采用宫裂解液,充分混匀。放入干式恒温器(中生方政)中 颈细胞采样刷收集宫颈脱落细胞标本,分别保存于95℃加热15min。吸取2μl处理好的样本加入反 PreservCyt( ThinPrep, Hologic, Bedford,MA,应液中,加入阴、阳性质控。将反应管放置于五通道 USA)细胞保存液和样品转移培养基( Specimen荧光定量PCR检测系统(中生方政),设置恒温反应 Transport Medium,STM, QIAGEN,德国)中,前者程序:60℃,75min,每分钟相当于一个循环。同一 用于 Iomega检测和薄层液基细胞学诊断,后者用反应管中由检测仪器四种荧光检测通道(FAM、 于HC2检测。所有细胞学标本均运输至中国医学CY5、ROX、VIC),分别检测13种HR-HPV 科学院肿瘤医院中心实验室,进行盲法检测和诊断。HPⅥ16、HPV18及内参(人β血红蛋白基因),内参 3薄层液基细胞学诊断 用于评估样本质量及核酸扩增抑制因素。待检样本 对存放在 PreservCyt细胞保存液的标本进行在FAM、CY5、ROX荧光检测通道扩增过程中没有 预处理,将标本中的黏液、血液和炎症细胞与上皮细明显呈指数增长的荧光信号,内参在VIC荧光检测 胞分离,采用 ThinPrep2000系统全自动细胞检测通道循环值≤65min,判断为阴性;若FAM、CY5 制备仪制成直径为2cm的薄层细胞涂片,95%酒精ROX荧光检测通道循环值≤65min,内参在ⅤIC荧 固定并巴氏染色。细胞学玻片由中国医学院肿瘤医光检测通道扩增过程中有或没有明显呈指数增长的 院细胞学专家采用TBS( the Bethesda System)分级荧光信号,均判断为阳性。检测阈值为1000拷 系统进行细胞学分级诊断,即无上皮内病变(Nega贝/mL tive for Intraepithelial Lesion or Malignancy, 4.3 HC2 #e iAy NILM),意义未明确的非典型鳞状上皮细胞增生 分别吸取500山、1000d含有指示剂的裂解液加 ( Atypical Squarnous Cells of Undetermined Signif-入阳性校准品和阴性校准品中,65℃水浴45min进 ance,ASC-US),非典型腺上皮细胞( Atypical行裂解。吸取75μl裂解好的待测标本和阴、阳性对 Glandular cells,AGC),非典型鳞状细胞不除外高照加入微孔板中,每孔再加入25μ配好的高危型探 级鳞状上皮内病变( Atypical Squamous Cells,Can-针工作液,65℃孵育1h。将各孔液体转移至捕获孔 not Exclude High Grade Intmepithelial Lesion,中,振荡1h,弃掉液体。每孔加入75μ的Q05%叠 AsSC-H),低级别鳞状上皮内病变( Low Grade氮化钠缓冲溶液和碱性磷酸酶结合抗体,20℃~25℃ Squamous Intraepithelial Lesion,LISL),高级别鳞放置Q5h,弃掉液体,用洗液用力冲洗各孔6次,反 状上皮内病变( High Grade Squamous Intraepithe-转放置5min。每孔加入75山l荧光底物,置于DML 21994-2018ChinaAcademicJOurnalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.cnki.net结果保持 高 度 一 致，灵 敏 度 要 高 于 ＧＰ５＋／６＋ 引 物，是一 种 可 靠、有 效 的 检 测 ＨＰＶ ＤＮＡ 的 方 法。 本研究通过比较Ｉｓｏｍｅｇａ与 ＨＣ２检测 ＨＲ－ＨＰＶ 的 一致性，以及以ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ 结果为标准，评价Ｉｓｏ－ ｍｅｇａ检测 ＨＰＶ１６和 ＨＰＶ１８的 准 确 性，探 讨Ｉｓｏ－ ｍｅｇａＨＰＶ 检测技术在宫颈癌及癌前病变筛查中的 可行性及应用价值。 材料与方法 １ 研究对象 本研究于２０１６年６月至８月在我国内蒙古地 区招募２７７４ 例 年 龄 在 ３０～６４ 岁 之 间、有 性 生 活 史、宫颈完整、自愿接受筛查的非妊娠妇女，所有参 加本研究的妇女均签署知情同意书。研究方案经中 国医学科学院肿瘤医院伦理委员会批准，批准文号 为１５－１４６／１０７３。 ２ 标本采集与处理 由内蒙古杭锦旗妇幼保健院的妇科医生采用宫 颈细胞采样刷收集宫颈脱落细胞标本，分别保存于 ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（ＴｈｉｎＰｒｅｐ， Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ， ＵＳＡ）细 胞 保 存 液 和 样 品 转 移 培 养 基 （Ｓｐｅｃｉｍｅｎ ＴｒａｎｓｐｏｒｔＭｅｄｉｕｍ，ＳＴＭ，ＱＩＡＧＥＮ，德国）中，前者 用于Ｉｓｏｍｅｇａ检测和薄层液基细胞学诊断，后 者 用 于 ＨＣ２检测。所有细胞学标本均运输至中国医学 科学院肿瘤医院中心实验室，进行盲法检测和诊断。 ３ 薄层液基细胞学诊断 对存放在 ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ细胞保存液的标本进行 预处理，将标本中的黏液、血液和炎症细胞与上皮细 胞分离，采用 ＴｈｉｎＰｒｅｐ２０００系统全自动细胞检测 制备仪制成直径为２ｃｍ 的薄层细胞涂片，９５％酒精 固定并巴氏染色。细胞学玻片由中国医学院肿瘤医 院细胞学专家采用 ＴＢＳ（ｔｈｅＢｅｔｈｅｓｄａＳｙｓｔｅｍ）分级 系统进行细胞学分级诊断，即无上皮内病变（Ｎｅｇａ－ ｔｉｖｅ ｆｏｒ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｌｅｓｉｏｎ ｏｒ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ， ＮＩＬＭ），意义未明确的非典型鳞状 上皮细胞增生 （ＡｔｙｐｉｃａｌＳｑｕａｒｎｏｕｓＣｅｌｌｓｏｆＵｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄＳｉｇｎｉｆ－ ｉｃａｎｃｅ，ＡＳＣ－ＵＳ），非 典 型 腺 上 皮 细 胞 （Ａｔｙｐｉｃａｌ ＧｌａｎｄｕｌａｒＣｅｌｌｓ，ＡＧＣ），非 典 型 鳞 状 细 胞 不 除 外 高 级鳞状上皮内病变（ＡｔｙｐｉｃａｌＳｑｕａｍｏｕｓＣｅｌｌｓ，Ｃａｎ－ ｎｏｔ Ｅｘｃｌｕｄｅ Ｈｉｇｈ ＧｒａｄｅＩｎｔｍｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｌｅｓｉｏｎ， ＡＳＣ－Ｈ），低 级 别 鳞 状 上 皮 内 病 变 （Ｌｏｗ Ｇｒａｄｅ ＳｑｕａｍｏｕｓＩｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌＬｅｓｉｏｎ，ＬＩＳＬ），高 级 别 鳞 状上皮内 病 变（ＨｉｇｈＧｒａｄｅＳｑｕａｍｏｕｓＩｎｔｒａｅｐｉｔｈｅ－ ｌｉａｌＬｅｓｉｏｎ，ＨＩＳＬ），鳞 状 细 胞 癌 （Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＳＣＣ）。 ４ ＨＰＶＤＮＡ检测 ４．１ 主要仪器与试剂 五通道荧光定量 ＰＣＲ检测系统（江苏中生方政 公司）、干式恒温器（江苏海门其林贝尔仪器公司）、 ＩｓｏｍｅｇａＨＰＶ 检 测 试 剂 盒 （江苏中生方政 公 司）； ＨＣ２检 测 系 统（ＤＭＬ２０００基因杂交信号放大仪、 旋涡振荡器、自动恒温加热仪）及 ＨＣ２检测试剂盒 （德国 ＱＩＡＧＥＮ 公 司）、水 浴 锅 （北 京 长 风 仪 器 公 司）；杂交炉（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公 司）、９６孔 ＰＣＲ 热 循环仪（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ９７００）、Ａｕｔｏ－ＬｉＰＡ４８ 仪（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＱＩＡａｍｐ９６ ＤＮＡ 提 取 试 剂 盒 （德国 ＱＩＡＧＥＮ 公 司）、ＩＮＮＯ－ＬｉＰＡ ＨＰＶ 基 因 扩 增试剂盒（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）。 ４．２ Ｉｓｏｍｅｇａ检测 吸取１ｍｌ存放在细胞保存液中的样本于离心 管中，高速离心１０ｍｉｎ，再除 去 上 清 液，加 入１００ ! ｌ 裂解液，充分混匀。放入干式恒温器（中生方政）中 ９５℃加热１５ｍｉｎ。吸 取２μｌ处理好的样本加入反 应液中，加入阴、阳性质控。将反应管放置于五通道 荧光定量 ＰＣＲ检测系统（中生方政），设置恒温反应 程序：６０℃，７５ｍｉｎ，每分钟相当于一个循环。同 一 反应管中由检测仪器四种荧光检 测通道 （ＦＡＭ、 ＣＹ５、ＲＯＸ、ＶＩＣ），分 别 检 测 １３ 种 ＨＲ－ＨＰＶ、 ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及内参（人β血红蛋白基因），内参 用于评估样本质量及核酸扩增抑制因素。待检样本 在 ＦＡＭ、ＣＹ５、ＲＯＸ 荧光检测通道扩增过程中没有 明显呈指数增长的荧光信号，内参在 ＶＩＣ荧光检测 通道循环值≤６５ｍｉｎ，判断 为 阴 性；若 ＦＡＭ、ＣＹ５、 ＲＯＸ荧光检测通道循环值≤６５ｍｉｎ，内参在 ＶＩＣ荧 光检测通道扩增过程中有或没有明显呈指数增长的 荧光信 号，均 判 断 为 阳 性。检 测 阈 值 为 １０００ 拷 贝／ｍＬ。 ４．３ ＨＣ２检测 分别吸取５００! ｌ、１０００! ｌ含有指示剂的裂解液加 入阳性校准品和阴性校准品中，６５℃水浴４５ｍｉｎ进 行裂解。吸取７５μｌ裂解好的待测标本和阴、阳性对 照加入微孔板中，每孔再加入２５μｌ配好的高危型探 针工作液，６５℃孵育１ｈ。将各孔液体转移至捕获孔 中，振荡１ｈ，弃掉液体。每孔加入７５μｌ的０．０５％叠 氮化钠缓冲溶液和碱性磷酸酶结合抗体，２０℃～２５℃ 放置０．５ｈ，弃掉液体，用洗液用力冲洗各孔６次，反 转放置５ｍｉｎ。每孔加入７５μｌ荧光底物，置于 ＤＭＬ ４期 王林，等．恒温扩增 ＨＰＶ 检测技术应用于子宫颈癌筛查的效果评价研究 · ９９４ ·