壁细胞用胰酶消化收集离心;④将培养 细胞中加入1~10ml的冰冷的PBS 500g×5min离心,弃上清,重复一次 用一倍体积的消化液悬浮细胞;⑤如细 胞数<3×107,则加入消化液0.3ml:如 细胞数较多,则每108个细胞加入lml 消化液;⑥细胞移入带盖的离心管中 50℃消化12~18h;⑦加入等体积的酚/ 氯仿/异戊醇,混匀,1700g×10min离心 将上层液体移入一个新的离心管中,如 果离心后分层不明显,可再重复消化和 离心;如果离心后,交界面上有一白色 薄膜,再重复酚/氯仿/异戊醇抽提:⑧ 在上清液中加入1/2体积的75moL醋 酸氨,2倍体积的100%乙醇溶液,混匀 12000g离心。为防止大分子基因组 DNA的剪切,加入100倍体积的TE缓 冲反应24h以上,以除去有机溶剂和盐 不需进行步骤⑧;⑨用70%乙醇溶液洗 涤,晾干;溶于适量的TE中,DNA终 浓度为1mlml:⑩加0.1%SDSD和 lpg/ mI rNA酶,37℃孵育h,重复步 骤⑥、⑦。一般1g细胞可得2mg基因 组DNA 真核细胞RNA的分离提取 RNA是基因表达产物。RNA存在 于细胞质中,核糖体最多,细胞核内也 有,主要在核仁部位,线粒体等也有少 量。细胞中的RNA有以下几类分子组 成,rRNA(占细胞总RNA的80%~ 85%)、tRNA和核内小分子RNA(占 10~15%)、mRNA(占1~5%)。其 中mRNA是分子生物学主要的研究对 象。RNA提取工作要求很严,对研究 基因的转录调控、基因的克隆和表达 cDNA文库的构建具有重要作用 分离制备RNA是克隆基因,分析 基因表达以及建立CDNA文库的首要 步骤。从细胞中分离的RNA的质量至 关重要,其中关键是要获得高纯度的 具有充分长度的RNA分子,包括RNA 的纯度和完整性。RNA分离的关键因壁细胞用胰酶消化收集离心；④将培养 细胞中加入 1~10ml 的冰冷的 PBS， 500g×5min 离心，弃上清，重复一次、 用一倍体积的消化液悬浮细胞；⑤如细 胞数＜3×107，则加入消化液 0.3ml；如 细胞数较多，则每 108 个细胞加入 1ml 消化液；⑥细胞移入带盖的离心管中， 50℃消化 12～18h；⑦加入等体积的酚/ 氯仿/异戊醇，混匀，1700g×10min 离心， 将上层液体移入一个新的离心管中，如 果离心后分层不明显，可再重复消化和 离心；如果离心后，交界面上有一白色 薄膜，再重复酚/氯仿/异戊醇抽提；⑧ 在上清液中加入 1/2 体积的 7.5mol/L 醋 酸氨，2 倍体积的 100%乙醇溶液，混匀， 12000g 离心。为防止大分子基因组 DNA 的剪切，加入 100 倍体积的 TE 缓 冲反应 24h 以上，以除去有机溶剂和盐， 不需进行步骤⑧；⑨用 70%乙醇溶液洗 涤，晾干；溶于适量的 TE 中，DNA 终 浓度为 1ml/ml；⑩加 0.1%SDSD 和 1μg/ml RNA 酶，37℃孵育 1h，重复步 骤⑥、⑦。一般 1g 细胞可得 2mg 基因 组 DNA。 真核细胞 RNA 的分离提取 RNA 是基因表达产物。RNA 存在 于细胞质中，核糖体最多，细胞核内也 有，主要在核仁部位，线粒体等也有少 量。细胞中的 RNA 有以下几类分子组 成，rRNA（占细胞总 RNA 的 80%～ 85%）、tRNA 和核内小分子 RNA（占 10～15%）、mRNA（占 1～5%）。其 中 mRNA 是分子生物学主要的研究对 象。RNA 提取工作要求很严，对研究 基因的转录调控、基因的克隆和表达、 cDNA 文库的构建具有重要作用。 分离制备 RNA 是克隆基因，分析 基因表达以及建立 cDNA 文库的首要 步骤。从细胞中分离的 RNA 的质量至 关重要 ，其中关键是要获得高纯度的 具有充分长度的 RNA 分子，包括 RNA 的纯度和完整性。RNA 分离的关键因