素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA 酶活性非常稳定,分布广泛,除细胞内 源性的RNA酶外,环境中也存在RNA 酶。因此在提取RNA时,应尽量创造 个无RNA酶的环境,包括去除外源 性RNA酶的污染和抑制内源性RNA酶 活性。主要是采用RNA酶的阻抑蛋白 RNasin和强力的蛋白质变形剂盐酸胍 或异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶,采 用焦碳酸二乙酯(DEPC)去除外源性 RNA酶。主要步骤为将细胞或组织进 行匀浆,目前用已知的最强的RNA酶 抑制剂异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸 钠、巯基乙醇联合抑制RNA酶,并使 核蛋白复合物解离,使RNA易于进入 无DNA的水相,容易被异丙醇浓缩 纯化RNA的方法比较多,有热酚法 氯化铯超离心法等。提取的RNA可以 用于核酸杂交、cDNA合成以及体外翻 译等。 具体操作方法包括:①特殊处理 所有玻璃器皿160~180℃高温干烤6h 以上,非耐高温器皿经0.1%DEPC液 浸泡后,经高温(15磅,20min)处理 灭活RNA酶,所用试剂均用DEPC水 配制,然后高压处理:②取组织 50~100mg,加08 ml triz冲洗匀浆器, 移入同一离心管,冰上静置5min:③加 02nl氯仿,充分震荡混匀,静置3min, 4℃,12000g×15min离心。弃沉淀;④ 取上清,加入0.5m异丙醇,颠倒混匀。 20℃静置2h,4℃,12000g×l0min离 心;⑤弃上清,取沉淀,加入lml75% 乙醇溶液,漂洗沉淀,4℃,7500g×5min 离心;⑥弃上清,沉淀真空干燥10min ⑦加40μDEPC溶液,充分溶解RNA ⑧取2山RNA溶解液,250倍稀释,紫 外分光光度计测定260nm、280nmOD 值,计算OD260OD280比值,如果比值 大于1.7,说明RNA纯度尚可。根据下 述公式计算RNA浓度:RNA浓度 (μg/pl)=OD2ox稀释倍数×40/1000 1%甲醛变性胶电泳观察RNA质 量,电泳槽及制胶板先用3%过氧化氢 浸泡过夜;制1%甲醛变性凝胶板:4.5μ素是尽量减少 RNA 酶的污染。但 RNA 酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内 源性的 RNA 酶外，环境中也存在 RNA 酶。因此在提取 RNA 时，应尽量创造 一个无 RNA 酶的环境，包括去除外源 性RNA酶的污染和抑制内源性 RNA酶 活性。主要是采用 RNA 酶的阻抑蛋白 RNasin 和强力的蛋白质变形剂盐酸胍 或异硫氰酸胍抑制内源性 RNA 酶，采 用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性 RNA 酶。主要步骤为将细胞或组织进 行匀浆，目前用已知的最强的 RNA 酶 抑制剂异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸 钠、巯基乙醇联合抑制 RNA 酶，并使 核蛋白复合物解离，使 RNA 易于进入 无 DNA 的水相，容易被异丙醇浓缩。 纯化 RNA 的方法比较多，有热酚法、 氯化铯超离心法等。提取的 RNA 可以 用于核酸杂交、cDNA 合成以及体外翻 译等。 具体操作方法包括：①特殊处理： 所有玻璃器皿 160～180℃高温干烤 6h 以上，非耐高温器皿经 0.1% DEPC 液 浸泡后，经高温（15 磅，20min）处理 灭活 RNA 酶，所用试剂均用 DEPC 水 配制，然后高压处理；②取组织 50~100mg，加 0.8ml Trizol 冲洗匀浆器， 移入同一离心管，冰上静置 5min；③加 0.2ml 氯仿，充分震荡混匀，静置 3min， 4℃，12000g×15min 离心。弃沉淀；④ 取上清，加入 0.5ml 异丙醇，颠倒混匀。 －20℃静置 2h，4℃，12000g×10min 离 心；⑤弃上清，取沉淀，加入 1ml 75% 乙醇溶液，漂洗沉淀，4℃，7500g×5min 离心；⑥弃上清，沉淀真空干燥 10min； ⑦加 40μl DEPC 溶液，充分溶解 RNA； ⑧取 2μl RNA 溶解液，250 倍稀释，紫 外分光光度计测定 260nm、280nmOD 值，计算 OD260/OD280 比值，如果比值 大于 1.7，说明 RNA 纯度尚可。根据下 述公式计算 RNA 浓度：RNA 浓度 （μg/μl）＝OD260×稀释倍数×40/1000。 1%甲醛变性胶电泳观察 RNA 质 量，电泳槽及制胶板先用 3%过氧化氢 浸泡过夜；制 1%甲醛变性凝胶板：4.5μl