10分钟后放4℃过夜,取细胞悬液计数,外周血淋巴细胞中约70%~80%淋巴细胞结成花环 即为T细胞,此法可用来分离T细胞。 3.T细胞亚群检测。参考7.14实验 4.细胞毒试验。T细胞、NK细胞、LAK细胞、TL细胞等对其靶细胞有直接的细 胞毒(杀伤)作用。常用的检测方法是5Cr(铬)释放法,将5Cr- Nacro4盐水溶液与靶细 胞(不同的细胞需不同的靶细胞,如NK细胞的靶细胞为K2),于37℃培养1小时左右, slCr即进入靶细胞,与胞浆结合,洗去游离的sCr后,即可得到sCr标记的靶细胞,将待 测细胞毒的细胞与sCr标记的靶细胞混合(比例约为501或100:1),靶细胞杀伤越多,释 放到上清液中的游离scr就越多,且不能再被其他细胞吸收,用γ射线测量仪检测上清液 中的cpm值,可计算出待检细胞杀伤活性高低。细胞毒的检测对肿瘤免疫有较大价值 5.巨噬细胞吞噬功能的测定。将中药(10%斑蝥)乙醇浸出液浸渍的滤纸(1cm2大 小)置于受试者前臂屈侧皮肤上,4~5小时后取下滤纸。48小时内皮肤局部可水泡,内含 巨噬细胞。取水泡液0.5m加鸡红细胞悬液001ml,37℃经30分钟后作涂片、染色与镜检, 计算吞噬百分率及每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的平均数。本试验有助于肿瘤病情及疗效的观 察 6.移动抑制试验。致敏淋巴细胞与其特异性抗原再次接触时,可以产生移动抑制因 子(MF)。这种因子可以抑制巨噬细胞和中性粒细胞的移动,使之定位于局部而増强其免 疫作用。本试验用来观察受检者淋巴细胞在体外受特异性抗原刺激后,有无MF产生,以 测定机体对某种抗原的特异性细胞免疫反应的功能 常用毛细管法做MF试验,将待测的白细胞悬液装入一端封闭的毛细管内,加入营养 液,37℃经24h观察结果。可看到巨噬细胞或白细胞自毛细管开口端向外移行,形成半圆形 的移行圈,若在营养液中加入一定浓度的特异性抗原,则细胞的移行圈显著缩小,通常用移 行抑制指数表示巨噬细胞或白细胞的抑制情况。 移动指数=加抗原后的巨噬细胞或白细胞移动面积/不加抗原的巨噬细胞或白细胞移 动面积 若移动指数明显小于1,表示机体对该抗原有特异性的细胞免疫作用。 7.时间分辨荧光测量技术。时间分辨荧光测量技术(time- resolved fluorometry,TrF) 是一项新型的超微量非放射性分析技术。该技术的敏感性和特异性与放射性核素测量技术相 仿,但无放射测量的弊端,故问世虽短,进展却极为迅速,有取代放射测量之势。其基本原 理是,当荧光标记用于免疫分析时,在适宜的条件下,其敏感性可高于核素。但由于被测生 物样品所用溶剂、溶质和存在的一些微粒等的散射光、荧光、磷光及化学发光等的干扰,加 之FITC等荧光物质的激发与发射光波长的重叠,背景干扰很大,致使荧光分析的敏感性可 比原有的下降1/100~1/1000。TrF则以镧系金属元素为示踪物,如Eu+(铕)、Tb3(铽) Sm3+(钐)等与有机螯合剂结合后,经紫外光激发,就能产生特征性的荧光。这种荧光不同 于传统荧光物质的发射光,其特点是:①半衰期长,为普通荧光的103~10°倍;② Stokes 位移较大:③激发光的波长范围较宽,利于提高激发能:;④发射荧光带窄,可降低背景荧光, 提高分辨率;尤其是镧系金属元素激发的荧光具有远较背景物质、普通荧光素所发荧光为长 的衰变时间,通过每次激发后,延缓一段时间再测量等步骤,能最大限度地排除自然本底短 寿命荧光及散射光的干扰 镧系的三价阳离子和蛋白质不能直接结合,故需借特殊螯合剂将常用Eu3等与抗原或 抗体相偶联,使之成为稳定的铕标记蛋白质络合物。一般采用氨基多羧酸衍生物作为双功能 螯合剂,其一端以氨基多羧酸基团通过配位键与Euμ3螯合,另一端经附加的异硫氢酸或重 氮等基团经共价键与抗原或抗体分子上的氨基偶联。这类螯合剂结合Eu3的能力很强,因 而铕标记的络合物比活性很高,利于提高TrF的敏感性 镧系离子-抗原或抗体络合后,在激发光作用下的能量转移较差,产生的荧光强度弱, 故测定前尚需进行增效处理。增效液β-二酮体、3-辛烷基磷化氢的氧化物(TOPO)和 Triton Ⅹ-100组成,pH为32。其作用机制是在酸性环境中,Eu-氨基多羧酸络合物极易解离,游 离的Eu可与增强液中的β-二酮体形成新的络合物。β-二酮体能高效地吸收激发光并能 转移给Eu3。 TritonⅩ-100系非离子型表面活性剂,能溶解脂溶性β-二酮体并形成微囊, 使Eu3与也能吸收β-二酮体转移能量的水分子隔离。TOPO则在Eu+周围形成协同配位 进一步降低配位层中水分子数,使隔离效果更佳。经上述处理后,荧光强度可增加百万倍,10 分钟后放 4℃过夜，取细胞悬液计数，外周血淋巴细胞中约 70%～80%淋巴细胞结成花环 即为 T 细胞，此法可用来分离 T 细胞。 3．T 细胞亚群检测。参考 7.14 实验。 4．细胞毒试验。Tc 细胞、NK 细胞、LAK 细胞、TIL 细胞等对其靶细胞有直接的细 胞毒（杀伤）作用。常用的检测方法是 51Cr（铬）释放法，将 51Cr-Na2CrO4 盐水溶液与靶细 胞（不同的细胞需不同的靶细胞，如 NK 细胞的靶细胞为 K562），于 37℃培养 1 小时左右， 51Cr 即进入靶细胞，与胞浆结合，洗去游离的 51Cr 后，即可得到 51Cr 标记的靶细胞，将待 测细胞毒的细胞与 51Cr 标记的靶细胞混合（比例约为 50:1 或 100:1），靶细胞杀伤越多，释 放到上清液中的游离 51Cr 就越多，且不能再被其他细胞吸收，用γ射线测量仪检测上清液 中的 cpm 值，可计算出待检细胞杀伤活性高低。细胞毒的检测对肿瘤免疫有较大价值。 5．巨噬细胞吞噬功能的测定。将中药（10%斑蝥）乙醇浸出液浸渍的滤纸（1cm2 大 小）置于受试者前臂屈侧皮肤上，4～5 小时后取下滤纸。48 小时内皮肤局部可水泡，内含 巨噬细胞。取水泡液 0.5ml 加鸡红细胞悬液 0.01ml，37℃经 30 分钟后作涂片、染色与镜检， 计算吞噬百分率及每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的平均数。本试验有助于肿瘤病情及疗效的观 察。 6．移动抑制试验。致敏淋巴细胞与其特异性抗原再次接触时，可以产生移动抑制因 子（MIF）。这种因子可以抑制巨噬细胞和中性粒细胞的移动，使之定位于局部而增强其免 疫作用。本试验用来观察受检者淋巴细胞在体外受特异性抗原刺激后，有无 MIF 产生，以 测定机体对某种抗原的特异性细胞免疫反应的功能。 常用毛细管法做 MIF 试验，将待测的白细胞悬液装入一端封闭的毛细管内，加入营养 液，37℃经 24h 观察结果。可看到巨噬细胞或白细胞自毛细管开口端向外移行，形成半圆形 的移行圈，若在营养液中加入一定浓度的特异性抗原，则细胞的移行圈显著缩小，通常用移 行抑制指数表示巨噬细胞或白细胞的抑制情况。 移动指数＝加抗原后的巨噬细胞或白细胞移动面积/不加抗原的巨噬细胞或白细胞移 动面积 若移动指数明显小于 1，表示机体对该抗原有特异性的细胞免疫作用。 7．时间分辨荧光测量技术。时间分辨荧光测量技术（time-resolved fluorometry, TrF） 是一项新型的超微量非放射性分析技术。该技术的敏感性和特异性与放射性核素测量技术相 仿，但无放射测量的弊端，故问世虽短，进展却极为迅速，有取代放射测量之势。其基本原 理是，当荧光标记用于免疫分析时，在适宜的条件下，其敏感性可高于核素。但由于被测生 物样品所用溶剂、溶质和存在的一些微粒等的散射光、荧光、磷光及化学发光等的干扰，加 之 FITC 等荧光物质的激发与发射光波长的重叠，背景干扰很大，致使荧光分析的敏感性可 比原有的下降 1/100～1/1000。TrF 则以镧系金属元素为示踪物，如 Eu3+（铕）、Tb3+（铽）、 Sm3+（钐）等与有机螯合剂结合后，经紫外光激发，就能产生特征性的荧光。这种荧光不同 于传统荧光物质的发射光，其特点是：①半衰期长，为普通荧光的 103～106 倍；②Stokes 位移较大；③激发光的波长范围较宽，利于提高激发能；④发射荧光带窄，可降低背景荧光， 提高分辨率；尤其是镧系金属元素激发的荧光具有远较背景物质、普通荧光素所发荧光为长 的衰变时间，通过每次激发后，延缓一段时间再测量等步骤，能最大限度地排除自然本底短 寿命荧光及散射光的干扰。 镧系的三价阳离子和蛋白质不能直接结合，故需借特殊螯合剂将常用 Eu3+等与抗原或 抗体相偶联，使之成为稳定的铕标记蛋白质络合物。一般采用氨基多羧酸衍生物作为双功能 螯合剂，其一端以氨基多羧酸基团通过配位键与 Eu3+螯合，另一端经附加的异硫氢酸或重 氮等基团经共价键与抗原或抗体分子上的氨基偶联。这类螯合剂结合 Eu3+的能力很强，因 而铕标记的络合物比活性很高，利于提高 TrF 的敏感性。 镧系离子-抗原或抗体络合后，在激发光作用下的能量转移较差，产生的荧光强度弱， 故测定前尚需进行增效处理。增效液β-二酮体、3-辛烷基磷化氢的氧化物（TOPO）和 Triton X-100 组成，pH 为 3.2。其作用机制是在酸性环境中，Eu3+ -氨基多羧酸络合物极易解离，游 离的 Eu3+ 可与增强液中的β-二酮体形成新的络合物。β-二酮体能高效地吸收激发光并能 转移给 Eu3+ 。Triton X-100 系非离子型表面活性剂，能溶解脂溶性β-二酮体并形成微囊， 使 Eu3+ 与也能吸收β-二酮体转移能量的水分子隔离。TOPO 则在 Eu3+ 周围形成协同配位， 进一步降低配位层中水分子数，使隔离效果更佳。经上述处理后，荧光强度可增加百万倍