上海中医药大学《实验中医学》教案(7) 课程名称实验中医学(理论部分)总学时数36 专业中医基础和中医临床专业授课教师方肇勤 内容实验中医学常用的实验研究方法及其在中医研时|16 究中的应用 本次1.掌握不同学科实验研究方法的特点和优势 课目2.掌握如何根据实验研究的要求选择实验研究方法(包括一种或几种方 的要法) 求|3.了解各学科的主要实验研究方法。 了解各学科实验研究方法在中医药研究中的应用, 5.了解了解各学科研究中医药学的现状。 本次第一节解剖学方法及其在中医研究中的应用 课的1.大体解剖学的主要方法 重点2.大体解剖学方法研究中医的现状。 难点第二节组织学方法及其在中医研究中的应用 1.组织学的主要研究方法。 2.组织学方法研究中医的现状 第三节电镜技术及其在中医研究中的应用 1.电子显微镜及电子显微术概况。 2.电子显微术研究中医的现状。 第四节生物化学方法及其在中医研究中的应用 1.生物化学的主要方法 2.生物化学方法研究中医的现状。 第五节生理学方法及其在中医研究中的应用 1.生理学的主要方法 生理学方法研究中医的现状 第六节免疫学方法及其在中医研究中的应用 1.免疫学的主要方法。 2.用免疫学方法研究中医的现状。 第七节核医学方法及其在中医研究中的应用 1.核医学的主要研究方法。 2.用核医学方法研究中医的现状。 第八节分子生物学方法及其在中医研究中的应用 1.分子生物学的主要技术和方法 2.用分子生物学方法研究中医的现状 次 的多媒体设备
上海中医药大学《实验中医学》教案（7） 课程名称 实验中医学（理论部分） 总学时数 36 专业 中医基础和中医临床专业 授课教师 方肇勤 内容 实验中医学常用的实验研究方法及其在中医研 究中的应用 时 数 16 本 次 课 目 的 要 求 1．掌握不同学科实验研究方法的特点和优势。 2．掌握如何根据实验研究的要求选择实验研究方法（包括一种或几种方 法）。 3．了解各学科的主要实验研究方法。 4．了解各学科实验研究方法在中医药研究中的应用。 5．了解了解各学科研究中医药学的现状。 本 次 课 的 重 点 难点 第一节 解剖学方法及其在中医研究中的应用 1．大体解剖学的主要方法。 2．大体解剖学方法研究中医的现状。 第二节 组织学方法及其在中医研究中的应用 1．组织学的主要研究方法。 2．组织学方法研究中医的现状。 第三节 电镜技术及其在中医研究中的应用 1．电子显微镜及电子显微术概况。 2．电子显微术研究中医的现状。 第四节 生物化学方法及其在中医研究中的应用 1．生物化学的主要方法。 2．生物化学方法研究中医的现状。 第五节 生理学方法及其在中医研究中的应用 1．生理学的主要方法。 2．生理学方法研究中医的现状。 第六节 免疫学方法及其在中医研究中的应用 1．免疫学的主要方法。 2．用免疫学方法研究中医的现状。 第七节 核医学方法及其在中医研究中的应用 1．核医学的主要研究方法。 2．用核医学方法研究中医的现状。 第八节 分子生物学方法及其在中医研究中的应用 1．分子生物学的主要技术和方法。 2．用分子生物学方法研究中医的现状。 本 次 课 的 应 用 教具 多媒体设备
第六节免疫学方法及其 在中医研究中的应用 (2学时) 第一段简要介绍了中医学有关免疫学的发展历史和贡献 第二段简要介绍了免疫学的定义、分化和与中医药继承和发展的关系 第一句化有定义的意义:“现代免疫的概念认为免疫是识别和排除抗原性异物的过 程,以维持机体的生理性平衡,在多数情况下对机体具有保护作用,如其功能发生异常,则 也可发生疾病。” 第三段进一步解释免疫的功能、功能紊乱的表现和与中医药的关系: 人体免疫功能主要有三种:免疫防御功能、自身稳定功能和免疫监视功能。” 1)免疫防御功能是指机体抵抗各种病原微生物并免除毒素的毒害作用,以及抵抗各 种异体抗原物质的侵袭能力,包括非特异性免疫和特异性免疫 2)自身稳定功能指机体清除自身衰老及伤亡的细胞,以利于组织细胞更新、维持内 环境平衡与稳定,亦即清除内源性抗原(类似内邪),以保生理功能的稳定性。 3)免疫监视功能是指在正常情况下,人体的T细胞能识别并杀伤体内经常出现的少 量异常细胞,包括癌细胞 第四段,阐述了章教授的观点: “正气能驱除外邪、内邪,维持人体健康,所以,免疫功能与其相似。正气是由肾脏 的先天精气、脾运化的水谷之气和肺吸入的清气构成,所以中医的肾、脾、肺三脏与免疫功 能关系也较大。”“正气与肺、脾、肾关系密切,肺、脾、肾的强弱决定正气盛衰。根据中医 理论,肾是根本,脾是化源,肺起敷布和辅助作用,就机体免疫功能而言,肾虚免疫功能损 害最重,脾虚次之,肺虚又次之,若慢性病久病失治,由轻而重,也多肺→脾→肾的规律发 展,从而说明了中医脏象学说与现代免疫学的联系。” 第五段讲“用免疫学方法研究中医的目的及意义”。 1)探讨有关中医理论。虚证一一免疫功能一般低下,且以细胞免疫功能较为明显 实证一一免疫功能有亢进趋势,具有较大理论和实际意义。 2)阐明中医治疗机理。一些中药能调节免疫功能:扶正固本药促进免疫功能:祛邪 药抑制免疫、防治过敏反应。今后的任务是进一步阐明其作用原理,提高疗效,并弄清其适 应症(这个观点十分重要,确实是中医药研究的方向之一) 3)发掘开发中药。发展促进免疫或抑制免疫中药,开发产品 4)中西医结合,发展中医学及免疫学。(介绍了两个观点:)(1)可将中医与免疫作 为中西结合的突破口。(2)弄清正气、内邪、外邪、虚证、实证与人体免疫功能、免疫系统、 抗原、免疫分子等免疫理论和实际的关系,将大大有利于中医学与免疫学的发展。 6.6.1免疫学的主要方法 介绍了几个定义 免疫学检测方法可分为体液免疫和细胞免疫测 (1)体液免疫测定主要利用抗原与相应抗体在体外发生特异性结合,并在一些辅助 因子参与下出现反应,从而用已知抗原或抗体来测知未知抗体或抗原。此外,尚包括检测体 液中的各种可溶性免疫分子,如补体、免疫球蛋白、循环复合物、溶菌酶等 (2)细胞免疫测定法是根据各种免疫细胞(T细胞、B细胞、K细胞、NK细胞及巨 噬细胞等)表面所具有的独特标志和产生的细胞因子等,测定各种免疫细胞及其亚群的数量 和功能,以帮助了解机体的细胞免疫水平 进而介绍了其延伸的内容“免疫学检测方法的应用范围越来越广泛,包括传染病、免 疫性疾病(免疫缺陷、自身免疫性疾病、变态反应、移植排斥反应)、肿瘤等领域,也可用 于微量蛋白、微量分泌激素、微量药物中抗原等的测定。中医中药的疗效及机理、某些中医
第六节 免疫学方法及其 在中医研究中的应用 （2 学时） 第一段简要介绍了中医学有关免疫学的发展历史和贡献。 第二段简要介绍了免疫学的定义、分化和与中医药继承和发展的关系。 第一句化有定义的意义：“现代免疫的概念认为免疫是识别和排除抗原性异物的过 程，以维持机体的生理性平衡，在多数情况下对机体具有保护作用，如其功能发生异常，则 也可发生疾病。” 第三段进一步解释免疫的功能、功能紊乱的表现和与中医药的关系： “人体免疫功能主要有三种：免疫防御功能、自身稳定功能和免疫监视功能。” 1）免疫防御功能是指机体抵抗各种病原微生物并免除毒素的毒害作用，以及抵抗各 种异体抗原物质的侵袭能力，包括非特异性免疫和特异性免疫。 2）自身稳定功能指机体清除自身衰老及伤亡的细胞，以利于组织细胞更新、维持内 环境平衡与稳定，亦即清除内源性抗原（类似内邪），以保生理功能的稳定性。 3）免疫监视功能是指在正常情况下，人体的 T 细胞能识别并杀伤体内经常出现的少 量异常细胞，包括癌细胞。 第四段，阐述了章教授的观点： “正气能驱除外邪、内邪，维持人体健康，所以，免疫功能与其相似。正气是由肾脏 的先天精气、脾运化的水谷之气和肺吸入的清气构成，所以中医的肾、脾、肺三脏与免疫功 能关系也较大。”“正气与肺、脾、肾关系密切，肺、脾、肾的强弱决定正气盛衰。根据中医 理论，肾是根本，脾是化源，肺起敷布和辅助作用，就机体免疫功能而言，肾虚免疫功能损 害最重，脾虚次之，肺虚又次之，若慢性病久病失治，由轻而重，也多肺→脾→肾的规律发 展，从而说明了中医脏象学说与现代免疫学的联系。” 第五段讲“用免疫学方法研究中医的目的及意义”。 1） 探讨有关中医理论。虚证——免疫功能一般低下，且以细胞免疫功能较为明显； 实证——免疫功能有亢进趋势，具有较大理论和实际意义。 2） 阐明中医治疗机理。一些中药能调节免疫功能：扶正固本药促进免疫功能；祛邪 药抑制免疫、防治过敏反应。今后的任务是进一步阐明其作用原理，提高疗效，并弄清其适 应症（这个观点十分重要，确实是中医药研究的方向之一）。 3） 发掘开发中药。发展促进免疫或抑制免疫中药，开发产品。 4） 中西医结合，发展中医学及免疫学。（介绍了两个观点：）（1）可将中医与免疫作 为中西结合的突破口。（2）弄清正气、内邪、外邪、虚证、实证与人体免疫功能、免疫系统、 抗原、免疫分子等免疫理论和实际的关系，将大大有利于中医学与免疫学的发展。 6．6．1 免疫学的主要方法 介绍了几个定义： 免疫学检测方法可分为体液免疫和细胞免疫测定。 （1）体液免疫测定主要利用抗原与相应抗体在体外发生特异性结合，并在一些辅助 因子参与下出现反应，从而用已知抗原或抗体来测知未知抗体或抗原。此外，尚包括检测体 液中的各种可溶性免疫分子，如补体、免疫球蛋白、循环复合物、溶菌酶等。 （2）细胞免疫测定法是根据各种免疫细胞（T 细胞、B 细胞、K 细胞、NK 细胞及巨 噬细胞等）表面所具有的独特标志和产生的细胞因子等，测定各种免疫细胞及其亚群的数量 和功能，以帮助了解机体的细胞免疫水平。 进而介绍了其延伸的内容“免疫学检测方法的应用范围越来越广泛，包括传染病、免 疫性疾病（免疫缺陷、自身免疫性疾病、变态反应、移植排斥反应）、肿瘤等领域，也可用 于微量蛋白、微量分泌激素、微量药物中抗原等的测定。中医中药的疗效及机理、某些中医
证型与免疫功能的关系、开发中药时的动物实验皆可以应用免疫学方法进行研究观察 在介绍具体方法的时候,请大家考虑,中医药研究如何应用。 6.6.1.1体液免疫检测法 讲抗原与抗体在体外结合反应的一些基本条件,和为什么叫“血清学反应”,以及其 应用领域 1.凝集反应。颗粒性抗原(细菌或红细胞等)与相应抗体特异性结合,在电解质参与 下形成肉眼可见的凝集物,称之为凝集反应。 凝集反应的原理是:抗原与抗体均带负电荷,又皆为亲水胶体,由于同种电荷的相互 排斥及其分子周围的水化膜而呈稳定的胶体溶液。当抗原与抗体特异性结合时,相应的极性 基团(羟基、氨基等)的相互吸附,破坏了水化膜,使亲水胶体变成了憎水胶体:加上存在 的电解质离子会中和一部分负电荷而使抗原抗体相互凝集,形成肉眼可见的凝集物。 )直接凝集反应。颗粒性抗原与相应抗体直接结合所产生的凝集现象,前者多为细 胞表面的结构成分,如细菌或红细胞的表面结构抗原。 (1)玻片法:多用于抗原的定性检测。将含有已知抗体的诊断血清与待测抗原(细 菌或红细胞)滴于玻片上混合并摇动,数分钟后出现肉眼可见的凝集物即为阳性反应。此 法简便快速,常用于鉴定细菌和血型。 (2)试管法:多用于抗体的定量检测。在试管中用生理盐水将待检血清作系列倍比 稀释,然后加入等量已知抗原,混匀、振荡后置37℃过夜,以观察凝集现象。凡最高稀释 度具有明显凝集现象者为该待测血淸的效价(或称滴度)。凝集效价表示血清中抗体的含量, 可根据有关抗体含量高低来辅助诊断或作流行病的调查,如诊断伤寒或副伤寒的肥达氏反 2)间接凝集反应。将可溶性抗原吸附于载体颗粒(如乳胶颗粒、红细胞等)的表面, 称之为致敏颗粒。当致敏颗粒与相应抗体结合,即可出现凝集现象。这个反应常用于测定细 菌性抗体、病毒性抗体、钩端螺旋体和梅毒螺旋体抗体及某些自身抗体(如抗核抗体、抗肾 抗体、抗甲状腺抗体等)。 根据凝集反应的原理,还有间接凝集抑制试验、反向间接凝集试验、协同凝集试验等。 2.沉淀反应。可溶性抗原(外毒素、血清、细菌培养的滤液、组织浸出液等)与相 应抗体特异性结合,在电解质参与下,形成沉淀物,称为沉淀反应。沉淀反应的抗原多为多 糖、类脂、蛋白质等 )单向扩散试验。这是一种抗原定量试验,是可溶性抗原在含抗体的琼脂介质中扩 散的沉淀反应。试验时,将已知抗体与融化的琼脂混匀倾注于平皿或玻片上。琼脂凝固后打 孔,孔内加入待检抗原,置湿盒于室温使其扩散,次日观察结果。由于抗体均匀地分布于琼 脂内,抗原从孔中向四周扩散,抗原抗体复合物在孔周围形成沉淀环。沉淀环的直径与孔中 抗原浓度成正比。如事先用不同浓度的已知标准抗原作单向琼脂扩散,并绘制成抗原浓度与 沉淀环直径的标准曲线,则可根据待检抗原孔的沉淀环直径从标准曲线查明其抗原含量。此 法常用于检测血清免疫球蛋白和补体各成分的含量 2〕双向扩散试验。这是可溶性抗原与抗体在琼脂介质中相互扩散的沉淀反应。将融 化的琼脂倾注于平皿或玻片上,琼脂凝固后打孔,抗原、抗体分别注入孔内,置湿盒内室温 过夜。如抗原与抗体相对应,两者相互扩散可在抗原、抗体孔间呈现清晰的白色沉淀线 对抗原与抗体只形成一条沉淀线,几对抗原与抗体则形成几条沉淀线。本法常用于 定性试验,如检测血清免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原等。 3)对流免疫电泳。对流电泳是一敏感快速的检测方法,即在电场作用下的双向免疫 扩散。在用pH86巴比妥缓冲液配制的琼脂板上挖出成对且平行的小孔,将琼脂板放入电 泳槽内,使琼脂板的两孔沿着电场方向,于负极侧的孔内加入抗原,于正极侧的孔内加入抗 体,通电后,抗原带负电荷向正极泳动,抗体分子虽也带负电荷,但受琼脂中电渗作用向负 极移动,抗原和抗体能较快集中在两孔之间的琼脂中形成免疫复合物的白色沉淀线。只需1 小时左右即可观察结果。此法常用于检测血清中的乙型肝炎表面抗原与甲胎蛋白等 3.中和试验。特异性抗体可抑制相应抗原物质的活性,抗体使相应抗原的毒性或传 染性消失的反应为中和试验。例如抗毒素中和外毒素的毒性,病毒的中和抗体可使病毒失去 感染性等。诊断风湿热的抗链球菌溶血毒素“O”试验也为一种中和试验。乙型溶血性链球
证型与免疫功能的关系、开发中药时的动物实验皆可以应用免疫学方法进行研究观察。” 在介绍具体方法的时候，请大家考虑，中医药研究如何应用。 6．6．1．1 体液免疫检测法 讲抗原与抗体在体外结合反应的一些基本条件，和为什么叫“血清学反应”，以及其 应用领域。 1. 凝集反应。颗粒性抗原（细菌或红细胞等）与相应抗体特异性结合，在电解质参与 下形成肉眼可见的凝集物，称之为凝集反应。 凝集反应的原理是：抗原与抗体均带负电荷，又皆为亲水胶体，由于同种电荷的相互 排斥及其分子周围的水化膜而呈稳定的胶体溶液。当抗原与抗体特异性结合时，相应的极性 基团（羟基、氨基等）的相互吸附，破坏了水化膜，使亲水胶体变成了憎水胶体；加上存在 的电解质离子会中和一部分负电荷而使抗原抗体相互凝集，形成肉眼可见的凝集物。 1）直接凝集反应。颗粒性抗原与相应抗体直接结合所产生的凝集现象，前者多为细 胞表面的结构成分，如细菌或红细胞的表面结构抗原。 （1）玻片法：多用于抗原的定性检测。将含有已知抗体的诊断血清与待测抗原（细 菌或红细胞） 滴于玻片上混合并摇动，数分钟后出现肉眼可见的凝集物即为阳性反应。此 法简便快速，常用于鉴定细菌和血型。 （2）试管法：多用于抗体的定量检测。在试管中用生理盐水将待检血清作系列倍比 稀释，然后加入等量已知抗原，混匀、振荡后置 37℃过夜，以观察凝集现象。凡最高稀释 度具有明显凝集现象者为该待测血清的效价（或称滴度）。凝集效价表示血清中抗体的含量， 可根据有关抗体含量高低来辅助诊断或作流行病的调查，如诊断伤寒或副伤寒的肥达氏反 应。 2）间接凝集反应。将可溶性抗原吸附于载体颗粒（如乳胶颗粒、红细胞等）的表面， 称之为致敏颗粒。当致敏颗粒与相应抗体结合，即可出现凝集现象。这个反应常用于测定细 菌性抗体、病毒性抗体、钩端螺旋体和梅毒螺旋体抗体及某些自身抗体（如抗核抗体、抗肾 抗体、抗甲状腺抗体等）。 根据凝集反应的原理，还有间接凝集抑制试验、反向间接凝集试验、协同凝集试验等。 2．沉淀反应。可溶性抗原（外毒素、血清、细菌培养的滤液、组织浸出液等）与相 应抗体特异性结合，在电解质参与下，形成沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应的抗原多为多 糖、类脂、蛋白质等。 1）单向扩散试验。这是一种抗原定量试验，是可溶性抗原在含抗体的琼脂介质中扩 散的沉淀反应。试验时，将已知抗体与融化的琼脂混匀倾注于平皿或玻片上。琼脂凝固后打 孔，孔内加入待检抗原，置湿盒于室温使其扩散，次日观察结果。由于抗体均匀地分布于琼 脂内，抗原从孔中向四周扩散，抗原抗体复合物在孔周围形成沉淀环。沉淀环的直径与孔中 抗原浓度成正比。如事先用不同浓度的已知标准抗原作单向琼脂扩散，并绘制成抗原浓度与 沉淀环直径的标准曲线，则可根据待检抗原孔的沉淀环直径从标准曲线查明其抗原含量。此 法常用于检测血清免疫球蛋白和补体各成分的含量。 2）双向扩散试验。这是可溶性抗原与抗体在琼脂介质中相互扩散的沉淀反应。将融 化的琼脂倾注于平皿或玻片上，琼脂凝固后打孔，抗原、抗体分别注入孔内，置湿盒内室温 过夜。如抗原与抗体相对应，两者相互扩散可在抗原、抗体孔间呈现清晰的白色沉淀线， 一对抗原与抗体只形成一条沉淀线，几对抗原与抗体则形成几条沉淀线。本法常用于 定性试验，如检测血清免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原等。 3）对流免疫电泳。对流电泳是一敏感快速的检测方法，即在电场作用下的双向免疫 扩散。在用 pH 8.6 巴比妥缓冲液配制的琼脂板上挖出成对且平行的小孔，将琼脂板放入电 泳槽内，使琼脂板的两孔沿着电场方向，于负极侧的孔内加入抗原，于正极侧的孔内加入抗 体，通电后，抗原带负电荷向正极泳动，抗体分子虽也带负电荷，但受琼脂中电渗作用向负 极移动，抗原和抗体能较快集中在两孔之间的琼脂中形成免疫复合物的白色沉淀线。只需 1 小时左右即可观察结果。此法常用于检测血清中的乙型肝炎表面抗原与甲胎蛋白等。 3．中和试验。特异性抗体可抑制相应抗原物质的活性，抗体使相应抗原的毒性或传 染性消失的反应为中和试验。例如抗毒素中和外毒素的毒性，病毒的中和抗体可使病毒失去 感染性等。诊断风湿热的抗链球菌溶血毒素“O”试验也为一种中和试验。乙型溶血性链球
菌能产生一种溶解人、兔红细胞的溶血毒素“O”,该毒素的溶血毒性可被抗溶血毒素“O” 抗体所中和而不出现溶血。试验时将病人血清与溶血毒素“O”混合,作用一段时间后加入 人红细胞,红细胞不被溶解为阳性反应,表示病人血清中存在抗溶血毒素“O”抗体。血清 抗体效价达400单位以上时提示患者曾感染乙型溶血性链球菌,有助于风湿热的诊断 4.免疫荧光法(荧光抗体法)。是应用荧光素染料(如异硫氰酸荧光黄等)来标记抗 体,但不影响其活性,此种抗体称荧光抗体。用已知种类的荧光抗体浸染待检的含有抗原的 细胞或组织切片,如有相应抗原存在,则抗原即与此种抗体发生特异性结合,形成复合物而 粘着在细胞上,不易洗脱,在荧光显微镜下成为发出荧光的可见物,可达到诊断或定位的目 直接法。将已知种类的荧光抗体加到待检标本上,作用半小时后,用缓冲液冲洗, 将未结合的荧光抗体全部洗去,干燥后在荧光显微镜下观察,如发现荧光表明标本中有相应 抗原存在,是为阳性。此法的优点是特异性高,可应用于早期检查病原,如细菌、病毒等 缺点是每检查一种抗原,必须制备与其相应的荧光抗体 2)间接法。先使未标记的已知抗体与待检抗原作用,如待检抗原与已知抗体相对应, 即发生特异性结合成复合物,再加入荧光标记的抗免疫球蛋白(或称抗抗体,能与抗体结合), 由于抗抗体与抗原抗体复合物中的抗体相结合,在荧光显微镜下即能见到荧光,是为阳性 5.酶联免疫吸附试验。本法的原理是利用酶(常用辣根过氧化物酶)标记的抗原或 抗体,以测定被检标本中有无相应的抗原或抗体。有间接法、双抗体法、竞争法三种。 现以间接法为例,简述其检测血清中抗体的基本过程。1)使已知可溶性抗原吸附于 固相载体(聚苯乙烯板凹孔、聚苯乙烯管等)上,孵育后冲洗去未吸附的抗原;2)加待检 血清并孵育,若血清中含有相应抗体,即与吸附的抗原结合,再行冲洗,去除未被结合的抗 体;3)加入酶标记抗球蛋白(抗抗体),使之与抗原抗体复合物上的抗体相结合,再洗涤去 除未吸附的酶标记抗球蛋白:4)加入酶作用底物(二氨基联苯胺,DAB),酶即能分解底 物并显色,用分光光度计检测其显色程度。颜色的深浅与标本中相应抗原或抗体的量成正比。 6.溶血空斑试验。详见7.13实验的论述。 7.免疫印迹技术。免疫印迹或免疫转印技术( immunoblotting或 Western blot)是在 Southern(1975)创建的DNA印迹术( Southern blotting)基础上发展起来的新型免疫生化 技术。其原理是应用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将蛋白质样品分离 后,通过转移电泳或直接印渍方式原位转印至固相介质上,并保持其原有的物质类型和生物 学活性不变,然后应用抗原抗体反应进行特异性检测。由于此项技术具有SDS-PAGE的高 分辨力和固相免疫测定的高度特异性和敏感性,方法简便易行,标本可以长期保存和便于比 较等优点。因此,问世十多年来经过不断改进,已广泛应用于生物学和医学领域,成为免疫 学、微生物学及其它生命科学常用的一种重要研究方法 6.6.1.2细胞免疫检测法 近代免疫学广泛采用了细胞生物学、免疫血清学、免疫标记、免疫组化等多方面技术, 不断发展和完善了一系列细胞免疫检测技术,用于检测各类免疫细胞的表面标志(包括抗原 及受体)、细胞的活化、增殖、吞噬、杀伤功能、各种细胞因子的活性或含量等方面。这些 技术为深入研究和认识机体免疫系统的生理、病理改变,阐明某些疾病的发病机制和临床诊 治提供了有用的手段。随着细胞免疫学的迅猛发展,时有新的细胞免疫检测技术出现。近年 来,新发展的项目集中在对有关细胞因子以及细胞受体方面的检测。在中医中药的研究方面, 近年来也得到广泛应用。 淋巴细胞转化试验。人类淋巴细胞在体外与特异性抗原(如结核菌素)或非特异 性有丝分裂原(如植物血凝素,PHA)等一起孵育,T细胞即被激活而向淋巴母细胞转化 T细胞转化过程可伴随有DNA、RNA、蛋白质的合成增加,最后导致细胞分裂。在光学显 微镜下可计数转化后的淋巴母细胞数,也可用氚标记的胸腺嘧啶核苷(H-TdR)掺入正在 分裂的淋巴细胞,用液闪测定仪来确定掺入量以确定淋巴细胞转化率。最近有一种不用同位 素,又可用仪器测量的淋巴细胞增殖反应的检查法,称为MIT检测法。MTT是一种甲氮唑 盐,它是细胞线粒体脱氢酶的底物,细胞内的酶可将MIT分解产生蓝黑色成分。该产物的 多少与活细胞数成正比,结果可用酶标仪(595m)测量光密度,作为MTT法的指标 2.E-花环法。人类T细胞表面有羊细胞受体(CD2)能与羊红细胞结合形成玫瑰花样 结构。即将分离液分离出的外周的单个核细胞悬液与羊红细胞在体外混合,经37℃培养5
菌能产生一种溶解人、兔红细胞的溶血毒素“O”，该毒素的溶血毒性可被抗溶血毒素“O” 抗体所中和而不出现溶血。试验时将病人血清与溶血毒素“O”混合，作用一段时间后加入 人红细胞，红细胞不被溶解为阳性反应，表示病人血清中存在抗溶血毒素“O”抗体。血清 抗体效价达 400 单位以上时提示患者曾感染乙型溶血性链球菌，有助于风湿热的诊断。 4. 免疫荧光法（荧光抗体法）。是应用荧光素染料（如异硫氰酸荧光黄等）来标记抗 体，但不影响其活性，此种抗体称荧光抗体。用已知种类的荧光抗体浸染待检的含有抗原的 细胞或组织切片，如有相应抗原存在，则抗原即与此种抗体发生特异性结合，形成复合物而 粘着在细胞上，不易洗脱，在荧光显微镜下成为发出荧光的可见物，可达到诊断或定位的目 的。 1）直接法。将已知种类的荧光抗体加到待检标本上，作用半小时后，用缓冲液冲洗， 将未结合的荧光抗体全部洗去，干燥后在荧光显微镜下观察，如发现荧光表明标本中有相应 抗原存在，是为阳性。此法的优点是特异性高，可应用于早期检查病原，如细菌、病毒等， 缺点是每检查一种抗原，必须制备与其相应的荧光抗体。 2）间接法。先使未标记的已知抗体与待检抗原作用，如待检抗原与已知抗体相对应， 即发生特异性结合成复合物，再加入荧光标记的抗免疫球蛋白（或称抗抗体，能与抗体结合）， 由于抗抗体与抗原抗体复合物中的抗体相结合，在荧光显微镜下即能见到荧光，是为阳性。 5．酶联免疫吸附试验。本法的原理是利用酶（常用辣根过氧化物酶）标记的抗原或 抗体，以测定被检标本中有无相应的抗原或抗体。有间接法、双抗体法、竞争法三种。 现以间接法为例，简述其检测血清中抗体的基本过程。1）使已知可溶性抗原吸附于 固相载体（聚苯乙烯板凹孔、聚苯乙烯管等）上，孵育后冲洗去未吸附的抗原；2）加待检 血清并孵育，若血清中含有相应抗体，即与吸附的抗原结合，再行冲洗，去除未被结合的抗 体；3）加入酶标记抗球蛋白（抗抗体），使之与抗原抗体复合物上的抗体相结合，再洗涤去 除未吸附的酶标记抗球蛋白；4）加入酶作用底物（二氨基联苯胺，DAB），酶即能分解底 物并显色，用分光光度计检测其显色程度。颜色的深浅与标本中相应抗原或抗体的量成正比。 6．溶血空斑试验。详见 7.13 实验的论述。 7．免疫印迹技术。免疫印迹或免疫转印技术（immunoblotting 或 Western blot）是在 Southern（1975）创建的 DNA 印迹术（Southern blotting）基础上发展起来的新型免疫生化 技术。其原理是应用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将蛋白质样品分离 后，通过转移电泳或直接印渍方式原位转印至固相介质上，并保持其原有的物质类型和生物 学活性不变，然后应用抗原抗体反应进行特异性检测。由于此项技术具有 SDS-PAGE 的高 分辨力和固相免疫测定的高度特异性和敏感性，方法简便易行，标本可以长期保存和便于比 较等优点。因此，问世十多年来经过不断改进，已广泛应用于生物学和医学领域，成为免疫 学、微生物学及其它生命科学常用的一种重要研究方法。 6．6．1．2 细胞免疫检测法 近代免疫学广泛采用了细胞生物学、免疫血清学、免疫标记、免疫组化等多方面技术， 不断发展和完善了一系列细胞免疫检测技术，用于检测各类免疫细胞的表面标志（包括抗原 及受体）、细胞的活化、增殖、吞噬、杀伤功能、各种细胞因子的活性或含量等方面。这些 技术为深入研究和认识机体免疫系统的生理、病理改变，阐明某些疾病的发病机制和临床诊 治提供了有用的手段。随着细胞免疫学的迅猛发展，时有新的细胞免疫检测技术出现。近年 来，新发展的项目集中在对有关细胞因子以及细胞受体方面的检测。在中医中药的研究方面， 近年来也得到广泛应用。 1．淋巴细胞转化试验。人类淋巴细胞在体外与特异性抗原（如结核菌素）或非特异 性有丝分裂原（如植物血凝素，PHA）等一起孵育，T 细胞即被激活而向淋巴母细胞转化。 T 细胞转化过程可伴随有 DNA、RNA、蛋白质的合成增加，最后导致细胞分裂。在光学显 微镜下可计数转化后的淋巴母细胞数，也可用氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入正在 分裂的淋巴细胞，用液闪测定仪来确定掺入量以确定淋巴细胞转化率。最近有一种不用同位 素，又可用仪器测量的淋巴细胞增殖反应的检查法，称为 MTT 检测法。MTT 是一种甲氮唑 盐，它是细胞线粒体脱氢酶的底物，细胞内的酶可将 MTT 分解产生蓝黑色成分。该产物的 多少与活细胞数成正比，结果可用酶标仪（595nm）测量光密度，作为 MTT 法的指标。 2．E-花环法。人类 T 细胞表面有羊细胞受体（CD2）能与羊红细胞结合形成玫瑰花样 结构。即将分离液分离出的外周的单个核细胞悬液与羊红细胞在体外混合，经 37℃培养 5～
10分钟后放4℃过夜,取细胞悬液计数,外周血淋巴细胞中约70%~80%淋巴细胞结成花环 即为T细胞,此法可用来分离T细胞。 3.T细胞亚群检测。参考7.14实验 4.细胞毒试验。T细胞、NK细胞、LAK细胞、TL细胞等对其靶细胞有直接的细 胞毒(杀伤)作用。常用的检测方法是5Cr(铬)释放法,将5Cr- Nacro4盐水溶液与靶细 胞(不同的细胞需不同的靶细胞,如NK细胞的靶细胞为K2),于37℃培养1小时左右, slCr即进入靶细胞,与胞浆结合,洗去游离的sCr后,即可得到sCr标记的靶细胞,将待 测细胞毒的细胞与sCr标记的靶细胞混合(比例约为501或100:1),靶细胞杀伤越多,释 放到上清液中的游离scr就越多,且不能再被其他细胞吸收,用γ射线测量仪检测上清液 中的cpm值,可计算出待检细胞杀伤活性高低。细胞毒的检测对肿瘤免疫有较大价值 5.巨噬细胞吞噬功能的测定。将中药(10%斑蝥)乙醇浸出液浸渍的滤纸(1cm2大 小)置于受试者前臂屈侧皮肤上,4~5小时后取下滤纸。48小时内皮肤局部可水泡,内含 巨噬细胞。取水泡液0.5m加鸡红细胞悬液001ml,37℃经30分钟后作涂片、染色与镜检, 计算吞噬百分率及每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的平均数。本试验有助于肿瘤病情及疗效的观 察 6.移动抑制试验。致敏淋巴细胞与其特异性抗原再次接触时,可以产生移动抑制因 子(MF)。这种因子可以抑制巨噬细胞和中性粒细胞的移动,使之定位于局部而増强其免 疫作用。本试验用来观察受检者淋巴细胞在体外受特异性抗原刺激后,有无MF产生,以 测定机体对某种抗原的特异性细胞免疫反应的功能 常用毛细管法做MF试验,将待测的白细胞悬液装入一端封闭的毛细管内,加入营养 液,37℃经24h观察结果。可看到巨噬细胞或白细胞自毛细管开口端向外移行,形成半圆形 的移行圈,若在营养液中加入一定浓度的特异性抗原,则细胞的移行圈显著缩小,通常用移 行抑制指数表示巨噬细胞或白细胞的抑制情况。 移动指数=加抗原后的巨噬细胞或白细胞移动面积/不加抗原的巨噬细胞或白细胞移 动面积 若移动指数明显小于1,表示机体对该抗原有特异性的细胞免疫作用。 7.时间分辨荧光测量技术。时间分辨荧光测量技术(time- resolved fluorometry,TrF) 是一项新型的超微量非放射性分析技术。该技术的敏感性和特异性与放射性核素测量技术相 仿,但无放射测量的弊端,故问世虽短,进展却极为迅速,有取代放射测量之势。其基本原 理是,当荧光标记用于免疫分析时,在适宜的条件下,其敏感性可高于核素。但由于被测生 物样品所用溶剂、溶质和存在的一些微粒等的散射光、荧光、磷光及化学发光等的干扰,加 之FITC等荧光物质的激发与发射光波长的重叠,背景干扰很大,致使荧光分析的敏感性可 比原有的下降1/100~1/1000。TrF则以镧系金属元素为示踪物,如Eu+(铕)、Tb3(铽) Sm3+(钐)等与有机螯合剂结合后,经紫外光激发,就能产生特征性的荧光。这种荧光不同 于传统荧光物质的发射光,其特点是:①半衰期长,为普通荧光的103~10°倍;② Stokes 位移较大:③激发光的波长范围较宽,利于提高激发能:;④发射荧光带窄,可降低背景荧光, 提高分辨率;尤其是镧系金属元素激发的荧光具有远较背景物质、普通荧光素所发荧光为长 的衰变时间,通过每次激发后,延缓一段时间再测量等步骤,能最大限度地排除自然本底短 寿命荧光及散射光的干扰 镧系的三价阳离子和蛋白质不能直接结合,故需借特殊螯合剂将常用Eu3等与抗原或 抗体相偶联,使之成为稳定的铕标记蛋白质络合物。一般采用氨基多羧酸衍生物作为双功能 螯合剂,其一端以氨基多羧酸基团通过配位键与Euμ3螯合,另一端经附加的异硫氢酸或重 氮等基团经共价键与抗原或抗体分子上的氨基偶联。这类螯合剂结合Eu3的能力很强,因 而铕标记的络合物比活性很高,利于提高TrF的敏感性 镧系离子-抗原或抗体络合后,在激发光作用下的能量转移较差,产生的荧光强度弱, 故测定前尚需进行增效处理。增效液β-二酮体、3-辛烷基磷化氢的氧化物(TOPO)和 Triton Ⅹ-100组成,pH为32。其作用机制是在酸性环境中,Eu-氨基多羧酸络合物极易解离,游 离的Eu可与增强液中的β-二酮体形成新的络合物。β-二酮体能高效地吸收激发光并能 转移给Eu3。 TritonⅩ-100系非离子型表面活性剂,能溶解脂溶性β-二酮体并形成微囊, 使Eu3与也能吸收β-二酮体转移能量的水分子隔离。TOPO则在Eu+周围形成协同配位 进一步降低配位层中水分子数,使隔离效果更佳。经上述处理后,荧光强度可增加百万倍
10 分钟后放 4℃过夜，取细胞悬液计数，外周血淋巴细胞中约 70%～80%淋巴细胞结成花环 即为 T 细胞，此法可用来分离 T 细胞。 3．T 细胞亚群检测。参考 7.14 实验。 4．细胞毒试验。Tc 细胞、NK 细胞、LAK 细胞、TIL 细胞等对其靶细胞有直接的细 胞毒（杀伤）作用。常用的检测方法是 51Cr（铬）释放法，将 51Cr-Na2CrO4 盐水溶液与靶细 胞（不同的细胞需不同的靶细胞，如 NK 细胞的靶细胞为 K562），于 37℃培养 1 小时左右， 51Cr 即进入靶细胞，与胞浆结合，洗去游离的 51Cr 后，即可得到 51Cr 标记的靶细胞，将待 测细胞毒的细胞与 51Cr 标记的靶细胞混合（比例约为 50:1 或 100:1），靶细胞杀伤越多，释 放到上清液中的游离 51Cr 就越多，且不能再被其他细胞吸收，用γ射线测量仪检测上清液 中的 cpm 值，可计算出待检细胞杀伤活性高低。细胞毒的检测对肿瘤免疫有较大价值。 5．巨噬细胞吞噬功能的测定。将中药（10%斑蝥）乙醇浸出液浸渍的滤纸（1cm2 大 小）置于受试者前臂屈侧皮肤上，4～5 小时后取下滤纸。48 小时内皮肤局部可水泡，内含 巨噬细胞。取水泡液 0.5ml 加鸡红细胞悬液 0.01ml，37℃经 30 分钟后作涂片、染色与镜检， 计算吞噬百分率及每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的平均数。本试验有助于肿瘤病情及疗效的观 察。 6．移动抑制试验。致敏淋巴细胞与其特异性抗原再次接触时，可以产生移动抑制因 子（MIF）。这种因子可以抑制巨噬细胞和中性粒细胞的移动，使之定位于局部而增强其免 疫作用。本试验用来观察受检者淋巴细胞在体外受特异性抗原刺激后，有无 MIF 产生，以 测定机体对某种抗原的特异性细胞免疫反应的功能。 常用毛细管法做 MIF 试验，将待测的白细胞悬液装入一端封闭的毛细管内，加入营养 液，37℃经 24h 观察结果。可看到巨噬细胞或白细胞自毛细管开口端向外移行，形成半圆形 的移行圈，若在营养液中加入一定浓度的特异性抗原，则细胞的移行圈显著缩小，通常用移 行抑制指数表示巨噬细胞或白细胞的抑制情况。 移动指数＝加抗原后的巨噬细胞或白细胞移动面积/不加抗原的巨噬细胞或白细胞移 动面积 若移动指数明显小于 1，表示机体对该抗原有特异性的细胞免疫作用。 7．时间分辨荧光测量技术。时间分辨荧光测量技术（time-resolved fluorometry, TrF） 是一项新型的超微量非放射性分析技术。该技术的敏感性和特异性与放射性核素测量技术相 仿，但无放射测量的弊端，故问世虽短，进展却极为迅速，有取代放射测量之势。其基本原 理是，当荧光标记用于免疫分析时，在适宜的条件下，其敏感性可高于核素。但由于被测生 物样品所用溶剂、溶质和存在的一些微粒等的散射光、荧光、磷光及化学发光等的干扰，加 之 FITC 等荧光物质的激发与发射光波长的重叠，背景干扰很大，致使荧光分析的敏感性可 比原有的下降 1/100～1/1000。TrF 则以镧系金属元素为示踪物，如 Eu3+（铕）、Tb3+（铽）、 Sm3+（钐）等与有机螯合剂结合后，经紫外光激发，就能产生特征性的荧光。这种荧光不同 于传统荧光物质的发射光，其特点是：①半衰期长，为普通荧光的 103～106 倍；②Stokes 位移较大；③激发光的波长范围较宽，利于提高激发能；④发射荧光带窄，可降低背景荧光， 提高分辨率；尤其是镧系金属元素激发的荧光具有远较背景物质、普通荧光素所发荧光为长 的衰变时间，通过每次激发后，延缓一段时间再测量等步骤，能最大限度地排除自然本底短 寿命荧光及散射光的干扰。 镧系的三价阳离子和蛋白质不能直接结合，故需借特殊螯合剂将常用 Eu3+等与抗原或 抗体相偶联，使之成为稳定的铕标记蛋白质络合物。一般采用氨基多羧酸衍生物作为双功能 螯合剂，其一端以氨基多羧酸基团通过配位键与 Eu3+螯合，另一端经附加的异硫氢酸或重 氮等基团经共价键与抗原或抗体分子上的氨基偶联。这类螯合剂结合 Eu3+的能力很强，因 而铕标记的络合物比活性很高，利于提高 TrF 的敏感性。 镧系离子-抗原或抗体络合后，在激发光作用下的能量转移较差，产生的荧光强度弱， 故测定前尚需进行增效处理。增效液β-二酮体、3-辛烷基磷化氢的氧化物（TOPO）和 Triton X-100 组成，pH 为 3.2。其作用机制是在酸性环境中，Eu3+ -氨基多羧酸络合物极易解离，游 离的 Eu3+ 可与增强液中的β-二酮体形成新的络合物。β-二酮体能高效地吸收激发光并能 转移给 Eu3+ 。Triton X-100 系非离子型表面活性剂，能溶解脂溶性β-二酮体并形成微囊， 使 Eu3+ 与也能吸收β-二酮体转移能量的水分子隔离。TOPO 则在 Eu3+ 周围形成协同配位， 进一步降低配位层中水分子数，使隔离效果更佳。经上述处理后，荧光强度可增加百万倍
最低探测限可达10-7mol,其敏感性甚至超过放射免疫法 8.细胞因子检测技术。细胞因子的检测,近年来在中医临床及实验室中已广泛应用 1)LL-2的检测。I2的测定,可应用于研究淋巴细胞的活性、免疫调节剂作用机制、 临床对肿瘤患者疗效观察以及预后的判断、中医中药的疗效及作用和机理的观察等,也可用 于中药对实验动物的免疫调节作用的观察 (1)ⅡL-2依赖T细胞株的增殖试验。这是目前公认的常规方法。系利用LL-2依赖T 细胞株(CILL-2)只能在含有IL-2的培养液中才能维持增殖,且其增殖幅度与Ⅱ-2含量在 一定范围内成正比的特性,通过ⅢH-TdR掺入法测得CnLL-2细胞的增殖程度,以推知培养 系统内所含的I1-2量 (2)活化淋巴细胞增殖试验。先以ConA刺激 BALB/c小鼠的脾脏细胞,经一定时间 后,从被刺激细胞中分离出淋巴母细胞。将待检的ⅡL-2样品加入淋巴母细胞悬液共同培养 适时加入H-TdR,再培养一段时间。收集细胞,测定H-ldR掺入量,可推知样品中I-2 的含量。该法可以不用IL-2依赖细胞株,但其实验重复性不如上法。 2)I-4的检测。有关I-4的报道,见于与IgE有关的变态反应性疾病的研究。检测 方法有B细胞增殖试验。取BALB品系小鼠的脾脏细胞,以CDC法去除T细胞,再将纯 化的B细胞与待检的Il-4样品共同孵育。适时加入H-TdR,再经培养后收集细胞,测定 H-TdR掺入量,推知样品I-4含量。 3)IL-6的检测。临床已将IL-6检测用于烧伤等应激状态下兔疫系统改变的观察,以 及判断多发性骨髓瘤患者病情轻重和预后等方面。现已建立的ⅡL-6检测方法为I-6依赖细 胞株増殖试验。该法以含I-6的待测标本与LL6依赖株(B细胞株等)共冋孵育,适时加 入H-TdR,再培养一定时间后,收集细胞,测定H-dR掺入量,推知标本内的IL-6含 量。近来有些实验室以四甲基偶氮唑蓝(MTT)替代放射性核素掺入细胞内,通过细胞内 线粒体酶的作用,可在细胞内形成蓝色颗粒,然后溶解细胞,以分光光度计测量培养液内蓝 色颗粒含量,以推测样品内的Ⅱ-6含量。 4)干扰素(TNF)的检测。TNF测定主要应用于炎症性疾病和感染性休克等机制的 研究,也用于对肿瘤患者预后判断及疗效考核。此外,检测器官移植者血浆与尿液内TNF 含量也可作为一种移植免疫生物学指标和排斥反应的早期指征。目前TNF检测方法是选取 原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株、小鼠纤维母细胞L29株等作为靶细胞,定量后与TNF标本共 同孵育。经一定时间后,用显微镜直接观察细胞活性,或以染料染色后鉴定细胞活性,计算 出细胞毒作用百分率。以50%细胞毒作用的效价作为TNF的抗瘤活性单位。也有在孵育后 的细胞培养液中加入MII,通过溶解细胞后,以比色法测定蓝色颗粒来推知TNF的活性单 5)肿瘤坏死因子(IFN)的检测。IN测定除可确定临床使用的IFN制剂的含量外 测定血清内IFN水平或测定受体PHA刺激后淋巴细胞产生IFN的水平,均可反映机体细胞 免疫的状态。临床研究发现,IFN的产生能力和血清含量与某些变态反应性疾病的发病机制 有一定联系,也与肿瘤的预后相关。此检测也可应用于中药诱生干扰素的能力,以测定中药 作用原理。 测定IFN的经典方法是细胞病变抑制法。该法系先将IFN标本与病毒的靶细胞(如 Wish细胞等)共同孵育一定时间,然后加入攻击病毒。再经一定时间培养,当未加IFN的 照内75%~100%的细胞出现病变,而未加病毒的细胞对照依然完好时,通过显微镜观察 细胞病变情况。此时,若与某一稀释度的IFN标本共育的细胞仍有50%左右不出现病变 则表示该稀释度标本内含有保护细胞的足够的IFN,该稀释度即为标本中含有的IFN效价。 9.细胞受体的检测。受体是细胞表面标志之一,通过对受体的检测,可以了解细胞 的功能,并为某些疾病的发病机制提供一定的理论依据。 1)补体受体(CR)。CR存在于许多细胞表面,在调节补体级联反应中起关键作用 并参与同细胞表面补体成分的结合。最常见的有CR1、CR2、CR3、CR4,它们存在于不同 的细胞上,分别识别不同的补体成分。如CR1可识别C3b和C4b,存在于人的红细胞、巨 噬细胞的B细胞上。CR1具有一系列不同的生物学活性,包括清除循环免疫复合物、对补 体系统的调节作用及识别补体覆盖的抗原等。CR2识别C3b,CR2和CR1在因子Ⅰ裂解灭 活的C3b(C3b)时有类似作用。CR3识别iC3b,主要存在于巨噬细胞上。CR4主要识别 C3dg
最低探测限可达 10-17mol，其敏感性甚至超过放射免疫法。 8．细胞因子检测技术。细胞因子的检测，近年来在中医临床及实验室中已广泛应用。 1）IL-2 的检测。IL-2 的测定，可应用于研究淋巴细胞的活性、免疫调节剂作用机制、 临床对肿瘤患者疗效观察以及预后的判断、中医中药的疗效及作用和机理的观察等，也可用 于中药对实验动物的免疫调节作用的观察。 （1）IL-2 依赖 T 细胞株的增殖试验。这是目前公认的常规方法。系利用 IL-2 依赖 T 细胞株（CTLL-2）只能在含有 IL-2 的培养液中才能维持增殖，且其增殖幅度与 IL-2 含量在 一定范围内成正比的特性，通过 3H-TdR 掺入法测得 CTLL-2 细胞的增殖程度，以推知培养 系统内所含的 IL-2 量。 （2）活化淋巴细胞增殖试验。先以 ConA 刺激 BALB/c 小鼠的脾脏细胞，经一定时间 后，从被刺激细胞中分离出淋巴母细胞。将待检的 IL-2 样品加入淋巴母细胞悬液共同培养， 适时加入 3H-TdR，再培养一段时间。收集细胞，测定 3H-TdR 掺入量，可推知样品中 IL-2 的含量。该法可以不用 IL-2 依赖细胞株，但其实验重复性不如上法。 2）IL-4 的检测。有关 IL-4 的报道，见于与 IgE 有关的变态反应性疾病的研究。检测 方法有 B 细胞增殖试验。取 BALB/c 品系小鼠的脾脏细胞，以 CDC 法去除 T 细胞，再将纯 化的 B 细胞与待检的 IL-4 样品共同孵育。适时加入 3H-TdR，再经培养后收集细胞，测定 3H-TdR 掺入量，推知样品 IL-4 含量。 3）IL-6 的检测。临床已将 IL-6 检测用于烧伤等应激状态下免疫系统改变的观察，以 及判断多发性骨髓瘤患者病情轻重和预后等方面。现已建立的 IL-6 检测方法为 IL-6 依赖细 胞株增殖试验。该法以含 IL-6 的待测标本与 IL-6 依赖株（B9 细胞株等）共同孵育，适时加 入 3H-TdR ，再培养一定时间后，收集细胞，测定 3H-TdR 掺入量，推知标本内的 IL-6 含 量。近来有些实验室以四甲基偶氮唑蓝（MTT）替代放射性核素掺入细胞内，通过细胞内 线粒体酶的作用，可在细胞内形成蓝色颗粒，然后溶解细胞，以分光光度计测量培养液内蓝 色颗粒含量，以推测样品内的 IL-6 含量。 4）干扰素（TNF）的检测。TNF 测定主要应用于炎症性疾病和感染性休克等机制的 研究，也用于对肿瘤患者预后判断及疗效考核。此外，检测器官移植者血浆与尿液内 TNF 含量也可作为一种移植免疫生物学指标和排斥反应的早期指征。目前 TNF 检测方法是选取 原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株、小鼠纤维母细胞 L929 株等作为靶细胞，定量后与 TNF 标本共 同孵育。经一定时间后，用显微镜直接观察细胞活性，或以染料染色后鉴定细胞活性，计算 出细胞毒作用百分率。以 50% 细胞毒作用的效价作为 TNF 的抗瘤活性单位。也有在孵育后 的细胞培养液中加入 MTT，通过溶解细胞后，以比色法测定蓝色颗粒来推知 TNF 的活性单 位。 5）肿瘤坏死因子（IFN）的检测。IFN 测定除可确定临床使用的 IFN 制剂的含量外， 测定血清内 IFN 水平或测定受体 PHA 刺激后淋巴细胞产生 IFN 的水平，均可反映机体细胞 免疫的状态。临床研究发现，IFN 的产生能力和血清含量与某些变态反应性疾病的发病机制 有一定联系，也与肿瘤的预后相关。此检测也可应用于中药诱生干扰素的能力，以测定中药 作用原理。 测定 IFN 的经典方法是细胞病变抑制法。该法系先将 IFN 标本与病毒的靶细胞（如 Wish 细胞等）共同孵育一定时间，然后加入攻击病毒。再经一定时间培养，当未加 IFN 的 对照内 75%～100% 的细胞出现病变，而未加病毒的细胞对照依然完好时，通过显微镜观察 细胞病变情况。此时，若与某一稀释度的 IFN 标本共育的细胞仍有 50% 左右不出现病变， 则表示该稀释度标本内含有保护细胞的足够的 IFN，该稀释度即为标本中含有的 IFN 效价。 9．细胞受体的检测。受体是细胞表面标志之一，通过对受体的检测，可以了解细胞 的功能，并为某些疾病的发病机制提供一定的理论依据。 1）补体受体（CR）。CR 存在于许多细胞表面，在调节补体级联反应中起关键作用， 并参与同细胞表面补体成分的结合。最常见的有 CR1、CR2、CR3、CR4，它们存在于不同 的细胞上，分别识别不同的补体成分。如 CR1 可识别 C3b 和 C4b，存在于人的红细胞、巨 噬细胞的 B 细胞上。CR1 具有一系列不同的生物学活性，包括清除循环免疫复合物、对补 体系统的调节作用及识别补体覆盖的抗原等。CR2 识别 C3b，CR2 和 CR1 在因子Ⅰ裂解灭 活的 C3b（iC3b）时有类似作用。CR3 识别 iC3b，主要存在于巨噬细胞上。CR4 主要识别 C3dg
在不同的疾病状态,CR的表达出现异常。如在胰岛素依赖型糖尿病中CRI表达降低, 而在系统性红斑狼疮中CRl则过度表达。 CR可用免疫粘附法(IAHA)检测。先在U形底%6孔板中加入不同稀释度的热凝聚 lgG,再加入豚鼠补体后置37℃孵育30min;再加1%红细胞悬液。室温Ih后出现凝集者为 CRI阳性。CR1亦可用荧光激活细胞分离器进行检测 2)IL-2R和血清可溶性I-2受体(SIL-2R)的检测。在免疫应答过程中,T细胞受抗 原递呈细胞递呈的抗原和分泌的I-1作用后,发生活化,在细胞膜表达LL-2R并分泌LL-2 因此,检测患者体内IL-2R+细胞数可提示T细胞的活化程度。近年来发现在某些疾病中, IL-2R表达异常,这种ⅡL-2R表达的变化可用于检测疾病的预后及考察药物的疗效。测定 IL-2R的一般采用免疫组化方法,可采用直接或间接免疫荧光染色来检测淋巴细胞表面的 Ⅱ-2R,也可用标有荧光素的特异性抗体染色细胞后用流式细胞仪进行检测。检测SIL-2R常 采用双抗体夹心的 ELISA方法。先用一种单抗包被96孔酶标板,再加入待测标本和兔抗鼠 的IgG酶结合物。加入底物后,在ELSA阅读仪上测其OD值。 6.6.2用免疫学方法研究中医的现状 0年代以来,经学者们分析认为中医正气与免疫功能有密切联系,因此有人主张 将之作为中西医结合的重要方向。临床在多方面研究了正虚与人体免疫功能的关系,观察到 虚证病人的免疫功能普遍下降,并发现扶正固本法可以改善其低下的免疫功能,以后也发现 祛邪法可以抑制亢进的免疫功能。陆续观察了多种免疫有关疾病,得到了类似的结果。进 步复制了虚证和实证动物模型,试验了多种中药复方及单味药的调节作用,目前已知多种中 药对多种免疫有关疾病的治疗作用与其对免疫调节作用有关。在研究过程中,已自当初的临 床病例的观察进入实验室多种指标的分析,并结合了动物试验,自复方的观察到单味药及有 效化学成分提取的分析,从整体进入细胞、分子和基因水平,应用了各种先进技术和仪器设 备,此方面工作对中医学和免疫学的发展起到极大的促进作用。 6.6.2.1临床研究 虚证及实证病人的免疫状态。 2.扶正与免疫。 3.祛邪与免疫。 6.6.2.2实验动物模型 6.6.2.3中药的免疫调节作用 扶正固本类中药。可能与下列因素有关:1)活化免疫细胞,2)激活巨噬细胞的 吞噬功能,3)促进细胞因子的分泌和活性,4)促进和调节体液免疫因素,5)改善骨髓造 血功能,6)改善神经一内分泌一免疫系统的网络关系。 2.祛邪类中药。可能与下列因素有关:1)调节T细胞Ts细胞的功能和比例,2)促 进巨噬细胞吞噬和销毁抗原的功能,3)提高了中和抗体的产生,4)抑制过敏递质的释放, 5)促使胸腺萎缩,6)改善了微循环和毛细血管通透性,7)调节了神经一内分泌和免疫系 统相互的作用 6.6.3用免疫学方法研究中的范例 主要介绍我校章育正等工作。 6.6.4展望 1.进一步阐明中医证治与免疫的关系 2.加强中药免疫调节作用的研究 3.学科互相渗透,加速发展 由于免疫学吸取了细胞生物学、生物化学、生物物理学和分子生物学等的实验方法, 所以目前用免疫学方法研究中医也已深入到分子水平和基因水平,除应用常规方法外,已采 用放射免疫、免疫酶标、免疫荧光、斑点杂交和印迹法等技术,应用了先进仪器设备如流式 细胞仪(FACS)、扫描电镜、免疫化学系统(lS)等,使方法学更趋标准化、准确化、现 代化。同时,当代免疫学已渗透到多种学科,产生了许多免疫学分支学科和交叉学科,如免 疫病理学、免疫遗传学、免疫药理学、神经免疫学、肿瘤免疫学、移植免疫学、生殖免疫学、 免疫酶学和行为免疫学等。中医中药的研究也逐渐涉及、应用到上述多个学科。可以预见
在不同的疾病状态，CR 的表达出现异常。如在胰岛素依赖型糖尿病中 CR1 表达降低， 而在系统性红斑狼疮中 CR1 则过度表达。 CR1 可用免疫粘附法（IAHA）检测。先在 U 形底 96 孔板中加入不同稀释度的热凝聚 IgG，再加入豚鼠补体后置 37℃孵育 30min；再加 1%红细胞悬液。室温 1h 后出现凝集者为 CR1 阳性。CR1 亦可用荧光激活细胞分离器进行检测。 2）IL-2R 和血清可溶性 IL-2 受体（SIL-2R）的检测。在免疫应答过程中，T 细胞受抗 原递呈细胞递呈的抗原和分泌的 IL-1 作用后，发生活化，在细胞膜表达 IL-2R 并分泌 IL-2。 因此，检测患者体内 IL-2R+细胞数可提示 T 细胞的活化程度。近年来发现在某些疾病中， IL-2R 表达异常，这种 IL-2R 表达的变化可用于检测疾病的预后及考察药物的疗效。测定 IL-2R 的一般采用免疫组化方法，可采用直接或间接免疫荧光染色来检测淋巴细胞表面的 IL-2R，也可用标有荧光素的特异性抗体染色细胞后用流式细胞仪进行检测。检测 SIL-2R 常 采用双抗体夹心的 ELISA 方法。先用一种单抗包被 96 孔酶标板，再加入待测标本和兔抗鼠 的 IgG-酶结合物。加入底物后，在 ELISA 阅读仪上测其 OD 值。 6．6．2 用免疫学方法研究中医的现状 自 70 年代以来，经学者们分析认为中医正气与免疫功能有密切联系，因此有人主张 将之作为中西医结合的重要方向。临床在多方面研究了正虚与人体免疫功能的关系，观察到 虚证病人的免疫功能普遍下降，并发现扶正固本法可以改善其低下的免疫功能，以后也发现 祛邪法可以抑制亢进的免疫功能。陆续观察了多种免疫有关疾病，得到了类似的结果。进一 步复制了虚证和实证动物模型，试验了多种中药复方及单味药的调节作用，目前已知多种中 药对多种免疫有关疾病的治疗作用与其对免疫调节作用有关。在研究过程中，已自当初的临 床病例的观察进入实验室多种指标的分析，并结合了动物试验，自复方的观察到单味药及有 效化学成分提取的分析，从整体进入细胞、分子和基因水平，应用了各种先进技术和仪器设 备，此方面工作对中医学和免疫学的发展起到极大的促进作用。 6．6．2．1 临床研究 1．虚证及实证病人的免疫状态。 2．扶正与免疫。 3．祛邪与免疫。 6．6．2．2 实验动物模型 6．6．2．3 中药的免疫调节作用 1．扶正固本类中药。可能与下列因素有关：1）活化免疫细胞，2）激活巨噬细胞的 吞噬功能，3）促进细胞因子的分泌和活性，4）促进和调节体液免疫因素，5）改善骨髓造 血功能，6）改善神经—内分泌—免疫系统的网络关系。 2．祛邪类中药。可能与下列因素有关：1）调节 TH 细胞 TS细胞的功能和比例，2）促 进巨噬细胞吞噬和销毁抗原的功能，3）提高了中和抗体的产生，4）抑制过敏递质的释放， 5）促使胸腺萎缩，6）改善了微循环和毛细血管通透性，7）调节了神经—内分泌和免疫系 统相互的作用。 6．6．3 用免疫学方法研究中的范例 主要介绍我校章育正等工作。 6．6．4 展望 1．进一步阐明中医证治与免疫的关系 2．加强中药免疫调节作用的研究 3．学科互相渗透，加速发展 由于免疫学吸取了细胞生物学、生物化学、生物物理学和分子生物学等的实验方法， 所以目前用免疫学方法研究中医也已深入到分子水平和基因水平，除应用常规方法外，已采 用放射免疫、免疫酶标、免疫荧光、斑点杂交和印迹法等技术，应用了先进仪器设备如流式 细胞仪（FACS）、扫描电镜、免疫化学系统（ICS）等，使方法学更趋标准化、准确化、现 代化。同时，当代免疫学已渗透到多种学科，产生了许多免疫学分支学科和交叉学科，如免 疫病理学、免疫遗传学、免疫药理学、神经免疫学、肿瘤免疫学、移植免疫学、生殖免疫学、 免疫酶学和行为免疫学等。中医中药的研究也逐渐涉及、应用到上述多个学科。可以预见
更深入地用免疫学方法来研究中医,不仅对中医学的发展且对兔疫学本身也将起着极大的推 动作用
更深入地用免疫学方法来研究中医，不仅对中医学的发展且对免疫学本身也将起着极大的推 动作用