上海中医药大学 《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案(2) 课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数48 专业中医基础和中医临床专业 授课教师方肇勤、管冬元、潘志强 内质粒转化大肠杆菌、阳性菌落扩增、质粒小量制备时12 容 本 次掌握质粒转化大肠杆菌理论与技术。 目掌握阳性菌落扩增,质粒小量制备理论与技术。 求 本次课的重点难 质粒转化大肠杆菌技术 涂皿鉴定技术 阳性克隆扩增技术。 点少量质粒制备技术 次质粒转化大肠杆菌实验及有关仪器设备 课的应用教具 的阳性菌落扩增,质粒小量制备实验及有关仪器设备
上海中医药大学 《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（2） 课程名称 分子生物学技术在中医药研究中的应用 总学时数 48 专业 中医基础和中医临床专业 授课教师 方肇勤、管冬元、潘志强 内 容 质粒转化大肠杆菌、阳性菌落扩增、质粒小量制备 时 数 12 本 次 课 目 的 要 求 掌握质粒转化大肠杆菌理论与技术。 掌握阳性菌落扩增，质粒小量制备理论与技术。 本 次 课 的 重 点 难 点 质粒转化大肠杆菌技术。 涂皿鉴定技术。 阳性克隆扩增技术。 少量质粒制备技术。 本 次 课 的 应 用 教 具 质粒转化大肠杆菌实验及有关仪器设备。 阳性菌落扩增，质粒小量制备实验及有关仪器设备
实验26 质粒转化大肠杆菌 该实验主要有两个用途: 1.重组质粒的鉴定。当质粒的重组或其它载体重组后,通常会发生质粒的重组失败 包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选,把重组成功的质粒找出来。在目前常用的质粒和 其它载体中含有相应的抗生素抗性基因,一旦重组成功,质粒环化(包括自身环化),抗生 素抗性基因表达,被转化的大肠杆菌便具备抗相应抗生素的能力,可以含该抗生素的培养基 中生长传代,不然,重组失败,大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡 2.为扩增质粒和其它载体作准备。由于大肠杆菌繁殖快,在适宜的条件下繁殖一代 仅需要20~30分钟,而且常用质粒可以在大肠杆菌中达到几百个拷贝,因此,通过对转化成 功的大肠杆菌培养,可以在短时内极大地扩增目的质粒。(作为分子生物学用大肠杆菌,是 经过实验室改造过的工程菌。) 原理 本实验通过CaCl2对特定的大肠杆菌处理,制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克 超螺旋质粒DNA,如一些插入目的DNA片段的重组质粒,产生5×10°~2×107个转化的菌 落。当质粒与这些大肠杆菌混合后,质粒粘附在大肠杆菌的表面,在42℃的温度时,大肠 杆菌出现热休克,质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后,加入LB培 养液,于37℃振动培养可使细菌复苏,并且表达质粒编码的抗生素抗性基因,提高转化效 率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代,形成菌落 实验准备(略) 实验步骤 自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌,插入湿冰中溶解约15分钟,轻轻混匀。吸取50ul 移入1.5ml管,并立刻将细菌放回-70℃冰箱。 细菌 0 ul DNA 5 ul 轻轻混匀,静置冰上30分钟 于42℃水浴中热休克细菌45秒,迅速移入湿冰中,静置2分钟,加入9ulLB培养 液,放入37℃恒温箱摇床,225rpm摇晃培养1小时。分别取50ud和100udl涂于两只含氨卞 青霉素的LB琼脂平板皿上,待干燥后,倒置,存放于37℃的培养箱中过夜。 次日,检查各培养皿中是否出现菌落。 实验结果 转化成功,培养皿中可见散在的菌落,其中加入100u培养液的培养皿中的菌落数约 为50u培养液培养皿的 转化失败,培养皿上无菌落,或菌落布满如苔样,后者提示可能是抗生素浓度不够或 失效。 注意事项 1.本实验采用的质粒含氨卞青霉素的抗性基因,因而采用含氨卞青霉素琼脂板作选 择。常用的抗性基因还有四环素、金霉素等,要求明确以准备适宜的抗生素板。 2.整个实验须严格按照无菌操作要求进行,由于琼脂板含有抗生素,所以当实验环 境干净者,可以直接放在普通实验台上操作 3.接种环或自制玻璃涂棒在煤气灯上消毒后,须冷后方可涂皿。对于那些缺少实验 室经验的研究人员,我们建议采用成L型的自制玻璃涂棒,这样由于L型的下端与琼脂板 的接触面大,不易将琼脂板划破
实验 26 质粒转化大肠杆菌 该实验主要有两个用途： 1．重组质粒的鉴定。当质粒的重组或其它载体重组后，通常会发生质粒的重组失败， 包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选，把重组成功的质粒找出来。在目前常用的质粒和 其它载体中含有相应的抗生素抗性基因，一旦重组成功，质粒环化（包括自身环化），抗生 素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抗相应抗生素的能力，可以含该抗生素的培养基 中生长传代，不然，重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。 2．为扩增质粒和其它载体作准备。由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代 仅需要 20~30 分钟，而且常用质粒可以在大肠杆菌中达到几百个拷贝，因此，通过对转化成 功的大肠杆菌培养，可以在短时内极大地扩增目的质粒。（作为分子生物学用大肠杆菌，是 经过实验室改造过的工程菌。） 原 理 本实验通过 CaCl2 对特定的大肠杆菌处理，制备感受态的细菌。这些细菌可使每微克 超螺旋质粒 DNA，如一些插入目的 DNA 片段的重组质粒，产生 5×106~2×107 个转化的菌 落。当质粒与这些大肠杆菌混合后，质粒粘附在大肠杆菌的表面，在 42℃的温度时，大肠 杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的空隙进入菌体内。随后，加入 LB 培 养液，于 37℃振动培养可使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效 率。转化成功的大肠杆菌可以在相应抗生素培养皿中传代，形成菌落。 实验准备（略） 实验步骤 自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入湿冰中溶解约 15 分钟，轻轻混匀。吸取 50ul 移入 1.5ml 管，并立刻将细菌放回-70℃冰箱。 细菌 50 ul DNA 5 ul 轻轻混匀，静置冰上 30 分钟。 于 42℃水浴中热休克细菌 45 秒，迅速移入湿冰中，静置 2 分钟，加入 900ul LB 培养 液，放入 37℃恒温箱摇床，225rpm 摇晃培养 1 小时。分别取 50ul 和 100ul 涂于两只含氨卞 青霉素的 LB 琼脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于 37℃的培养箱中过夜。 次日，检查各培养皿中是否出现菌落。 实验结果 转化成功，培养皿中可见散在的菌落，其中加入 100ul 培养液的培养皿中的菌落数约 为 50ul 培养液培养皿的一倍。 转化失败，培养皿上无菌落，或菌落布满如苔样，后者提示可能是抗生素浓度不够或 失效。 注意事项 1．本实验采用的质粒含氨卞青霉素的抗性基因，因而采用含氨卞青霉素琼脂板作选 择。常用的抗性基因还有四环素、金霉素等，要求明确以准备适宜的抗生素板。 2．整个实验须严格按照无菌操作要求进行，由于琼脂板含有抗生素，所以当实验环 境干净者，可以直接放在普通实验台上操作。 3．接种环或自制玻璃涂棒在煤气灯上消毒后，须冷后方可涂皿。对于那些缺少实验 室经验的研究人员，我们建议采用成 L 型的自制玻璃涂棒，这样由于 L 型的下端与琼脂板 的接触面大，不易将琼脂板划破
4.培养皿在皿底作标记,写明内容、日期、操作者等,倒置放入培养箱。 5.感受态大肠杆菌的制备 (1)在无污染的条件下,用LB扩增大肠杆菌,并离心收集 (2)4℃条件下,用0.1mol/ L CaCl2重悬沉淀,再离心沉淀,以洗去LB培养液。 (3)4℃条件下,用0.1 mol/L CaCl2重悬沉淀,分装备用。大约50m的LB培养液的 大肠杆菌,溶于2ml的CaCl2中(每mlLB培养液大约含10成活的大肠杆菌,LB培养的 菌落要求划皿约16-20小时的菌落)。 实验27阳性单菌落扩增与小量DNA制备 目的 1.为进一步鉴定重组质粒提供适量的质粒DNA。 排除自身环化。鉴定方法主要有 )PCR法及其利弊。采用载体两端的引物进行PCR,一旦插入成功,则可以在电 泳的凝胶中见到与插入片段分子量大小一致的PCR产物。 (2) Southern blot法及其利弊。将培养皿上的菌落转移到硝酸纤维素膜上,变性、固 定,以插入片段为探针作 Southern blot。重组成功者,在相应的菌落位置上可以见到放射自 显影的黑点,培养皿上对应的菌落即为重组成功者 (3)酶切鉴定法及其利弊 2.提供一定数量的DNA以满足一些实验,比如1)测序、2)准备杂交用的探针。这 便是本实验的两个主要目的 有关微型真空柱和离心柱的利弊。原理与本实验近似,区别在于DNA的回收不是采 用酒精沉淀,而痕量乙醇,这将妨碍一些对乙醇敏感的酶的活性,使后续的工作困难 原理 挑选单一菌落,培养扩増。离心收集扩増了的大肠杄菌,用碱性液裂解细菌,再经酸 性溶液形成钾-SDS-蛋白质-膜复合物,离心后,此复合物与细菌染色体DNA、高分子量的 RNA得到沉淀,而细菌中小分子量的质粒DNA溶于上清之中。上清经乙醇沉淀后,得到质 实验准备(参考教材) Falcon2070管/B培养液/黄吸头照片 含阳性菌落的培养皿4种情况照片。 实验步骤 1.第一天(通常为下午) 从琼脂平板上挑取单一菌落,接种到 Falcon管内的5mLB培养液(含氨卞青霉素) 中。放入37℃恒温摇床,225-250rpm剧烈摇晃培养过夜(O/N) 2.第二天(通常上午开始) (1)吸取1.5ml培养液,移入 Eppendorf管中,台式离心机室温下14万转离心2分 钟,弃上清,重复一至二次,以取得较大的沉淀。剩余培养液存入4℃冰箱 (2)弃上清,加入10u溶液I,盖上盖,剧烈震荡(可以将管底抵于试管架面上, 划15下),充分浮悬细胞沉淀,置-20℃冰箱内5分钟 (3)自冰箱中取出试管,加入200u溶液Ⅱ,轻轻颠倒混匀,放于冰上5分钟 (4)加入150u溶液Ⅲ,轻轻颠倒混匀,放于冰上15分钟 (5)放入台式离心机,室温下14万转离心3分钟,将上清移入一新的 Eppendorf管, 加入lml100%乙醇,混匀,放入-20℃冰箱5分钟 6)自冰箱中取出试管,迅速移入4℃环境下的台式离心机,14万转离心5分钟
4．培养皿在皿底作标记，写明内容、日期、操作者等，倒置放入培养箱。 5．感受态大肠杆菌的制备： （1）在无污染的条件下，用 LB 扩增大肠杆菌，并离心收集。 （2）4℃条件下，用 0.1 mol/L CaCl2 重悬沉淀，再离心沉淀，以洗去 LB 培养液。 （3）4℃条件下，用 0.1 mol/L CaCl2 重悬沉淀，分装备用。大约 50ml 的 LB 培养液的 大肠杆菌，溶于 2ml 的 CaCl2 中（每 ml LB 培养液大约含 108 成活的大肠杆菌，LB 培养的 菌落要求划皿约 16-20 小时的菌落）。 实验 27 阳性单菌落扩增与小量 DNA 制备 目 的 1．为进一步鉴定重组质粒提供适量的质粒 DNA。 排除自身环化。鉴定方法主要有： （1）PCR 法及其利弊。采用载体两端的引物进行 PCR，一旦插入成功，则可以在电 泳的凝胶中见到与插入片段分子量大小一致的 PCR 产物。 （2）Southern blot 法及其利弊。将培养皿上的菌落转移到硝酸纤维素膜上，变性、固 定，以插入片段为探针作 Southern blot。重组成功者，在相应的菌落位置上可以见到放射自 显影的黑点，培养皿上对应的菌落即为重组成功者。 （3）酶切鉴定法及其利弊。 2．提供一定数量的 DNA 以满足一些实验，比如 1）测序、2）准备杂交用的探针。这 便是本实验的两个主要目的。 有关微型真空柱和离心柱的利弊。原理与本实验近似，区别在于 DNA 的回收不是采 用酒精沉淀，而痕量乙醇，这将妨碍一些对乙醇敏感的酶的活性，使后续的工作困难。 原 理 挑选单一菌落，培养扩增。离心收集扩增了的大肠杆菌，用碱性液裂解细菌，再经酸 性溶液形成钾-SDS-蛋白质-膜复合物，离心后，此复合物与细菌染色体 DNA、高分子量的 RNA 得到沉淀，而细菌中小分子量的质粒 DNA 溶于上清之中。上清经乙醇沉淀后，得到质 粒 DNA。 实验准备（参考教材） Falcon 2070 管/LB 培养液/黄吸头照片。 含阳性菌落的培养皿 4 种情况照片。 实验步骤 1．第一天（通常为下午） 从琼脂平板上挑取单一菌落，接种到 Falcon 管内的 5ml LB 培养液（含氨卞青霉素） 中。放入 37℃恒温摇床，225-250 rpm 剧烈摇晃培养过夜（O/N）。 2．第二天（通常上午开始） （1）吸取 1.5ml 培养液，移入 Eppendorf 管中，台式离心机室温下 1.4 万转离心 2 分 钟，弃上清，重复一至二次，以取得较大的沉淀。剩余培养液存入 4℃冰箱。 （2）弃上清，加入 100ul 溶液 I，盖上盖，剧烈震荡（可以将管底抵于试管架面上， 划 15 下），充分浮悬细胞沉淀，置-20℃冰箱内 5 分钟。 （3）自冰箱中取出试管，加入 200ul 溶液 II，轻轻颠倒混匀，放于冰上 5 分钟。 （4）加入 150ul 溶液 III，轻轻颠倒混匀，放于冰上 15 分钟。 （5）放入台式离心机，室温下 1.4 万转离心 3 分钟，将上清移入一新的 Eppendorf 管， 加入 1ml 100％乙醇，混匀，放入-20℃冰箱 5 分钟。 （6）自冰箱中取出试管，迅速移入 4℃环境下的台式离心机，1.4 万转离心 5 分钟
小心弃去上清,倒置试管于纸巾上流尽乙醇, (⑦)加入300uTE和2 ul RNase,重浮悬沉淀,放试管于37℃的水浴中温育30分钟。 (8)加入3 NaaC34ul,混匀,加入lml预冷的100%乙醇,-20℃存放5分钟。 (9)自冰箱中取出试管,迅速移入4℃环境下的台式离心机,14万转离心5分钟 弃去上清。 (10)加入lml预冷的75%乙醇,迅速移入4℃环境下的台式离心机,14万转离心 10分钟,弃去上清 (11)旋转真空干燥10分钟。于冰上,溶解沉淀于20ul水中。 实验结果 通常可获得3~5 UlNA。 注意事项 1.在培养箱温度不够稳定等因素的影响下,有时隔夜后没有菌落形成,此时不必急 于怀疑实验失败。建议再倒置培养一些时候,比如等到中午,或更晚一些时候,培养皿上会 出现菌落 2.挑取菌落必须是单菌落,而不是那些融合的菌落。如果培养皿上的菌落全部融合, 则建议重新划板培养,直至有单菌落为止。不然一旦混有不同的菌落,可能会给以后的实验 带来麻烦。 3.离心要求平衡。方法是保证离心机转子对面两侧的试管孔内有含有相等数量的离 心物和试管,使两侧平衡。如果仅有一个离心管,则要求对面放置另一根相同规格的离心管 管内加入与样品数量相等的水。具体方法可以参考生化有关书籍。 4.DNA的离心通常采用14万转的转速,10分钟的时间,这足以满足沉淀DNA的 要求 5.沉淀DNA或RNA离心时,应把 Eppendorf管盖的连接蒂指向外侧,以保证离心 后沉淀位于管底靠连接蒂的一侧,当DNA或RNA量少至难以辨认时,吸取上清之际,可 避免吸头触及这一区域把所需沉淀吸起 6.室温下,DNA沉淀容易浮起,所以整个操作过程应保持在4℃环境下进行,手指 持试管上部,切勿接触试管底部 7.吸取上清时动作要轻而快,加入75%乙醇时,应将乙醇沿管壁轻轻加入,以免将 沉淀冲起 8.通常,实验对RNA污染不是有严格要求的话,比如做酶切鉴定的话,实验的7、8、 9步骤可以免去。这样可以提高实验速度。我们的实验将兔去这些步骤。 9.离心后大肠杆菌的裂解物会黏附于管壁和浮于离心液表面,为避免大肠杆菌的裂 解物堵塞吸头,可以一面将吸头推出气体,一面插入表面含有大肠杆菌的裂解物的离心液
小心弃去上清，倒置试管于纸巾上流尽乙醇。 （7）加入 300ul TE 和 2ul RNase，重浮悬沉淀，放试管于 37℃的水浴中温育 30 分钟。 （8）加入 3M NaAC 34ul，混匀，加入 1ml 预冷的 100％乙醇，-20℃存放 5 分钟。 （9）自冰箱中取出试管，迅速移入 4℃环境下的台式离心机，1.4 万转离心 5 分钟， 弃去上清。 （10）加入 1ml 预冷的 75％乙醇，迅速移入 4℃环境下的台式离心机，1.4 万转离心 10 分钟，弃去上清。 （11）旋转真空干燥 10 分钟。于冰上，溶解沉淀于 20ul 水中。 实验结果 通常可获得 3~5ugDNA。 注意事项 1．在培养箱温度不够稳定等因素的影响下，有时隔夜后没有菌落形成，此时不必急 于怀疑实验失败。建议再倒置培养一些时候，比如等到中午，或更晚一些时候，培养皿上会 出现菌落。 2．挑取菌落必须是单菌落，而不是那些融合的菌落。如果培养皿上的菌落全部融合， 则建议重新划板培养，直至有单菌落为止。不然一旦混有不同的菌落，可能会给以后的实验 带来麻烦。 3．离心要求平衡。方法是保证离心机转子对面两侧的试管孔内有含有相等数量的离 心物和试管，使两侧平衡。如果仅有一个离心管，则要求对面放置另一根相同规格的离心管， 管内加入与样品数量相等的水。具体方法可以参考生化有关书籍。 4．DNA 的离心通常采用 1.4 万转的转速，10 分钟的时间，这足以满足沉淀 DNA 的 要求。 5．沉淀 DNA 或 RNA 离心时，应把 Eppendorf 管盖的连接蒂指向外侧，以保证离心 后沉淀位于管底靠连接蒂的一侧，当 DNA 或 RNA 量少至难以辨认时，吸取上清之际，可 避免吸头触及这一区域把所需沉淀吸起。 6．室温下，DNA 沉淀容易浮起，所以整个操作过程应保持在 4℃环境下进行，手指 持试管上部，切勿接触试管底部。 7．吸取上清时动作要轻而快，加入 75％乙醇时，应将乙醇沿管壁轻轻加入，以免将 沉淀冲起。 8．通常，实验对 RNA 污染不是有严格要求的话，比如做酶切鉴定的话，实验的 7、8、 9 步骤可以免去。这样可以提高实验速度。我们的实验将免去这些步骤。 9．离心后大肠杆菌的裂解物会黏附于管壁和浮于离心液表面，为避免大肠杆菌的裂 解物堵塞吸头，可以一面将吸头推出气体，一面插入表面含有大肠杆菌的裂解物的离心液