移液器,冷冻高速离心机,台式髙速离心机,水浴锅,陶瓷硏钵,50m离 心管(有盖)及5m和1.5m离心管,弯成钩状的小玻棒。 三、试剂 1、提取缓冲液I:100 mmol/ tris:Cl,pH8.0,20 mmOl/L EDTA,500 mmol/L NaCl. 1.5% SDS 2、提取缓冲液Ⅱ:l86g葡萄糖,6.9g二乙基二硫代碳酸钠,60gPVP,240ul 巯基乙醇,加水至300ml。 3、804:16氯仿戊醇:乙醇 4、 RnaseA母液:配方见第一章。 5、其它试剂:液氮、异丙醇、TE缓冲液,无水乙醇、70%乙醇、3mol/ NAaC 四、操作步骤 (一)水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取 1.在50m离心管中加入20ml提取缓冲液I,60℃水浴预热。 2.水稻幼苗或叶子5-10g,剪碎,在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热 的离心管中,剧烈摇动混匀,60℃水浴保温30-60分钟(时间长DNA产量高)不 时摇动。 3.加入20m氯仿戊醇/乙醇溶液,颠倒混匀(需带手套,防止损伤皮肤),室 温下静置5-10分钟,使水相和有机相分层(必要时可重新混匀) 4.室温下5000pm离心5分钟。 5.仔细移取上清液至另一50ml离心管加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放 置片刻即出现絮状DNA沉淀 6.在1.5 ml eppendorf中加入lmlT。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净 吸水纸上吸干转入含TE的离心管中DNA很快溶解于TE。 7.如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000pm离心5分钟,再将沉淀移入TE 管中。这样收集的沉淀往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上,以帮 助溶解。 8.将DNA溶液3000pm离心5分钟,上清液倒入干净的5ml离心管 9.加入5u1 RNaseA(10μg/u1),37℃10分钟,除去RNA(RNA对DNA的 操作、分析一般无影响,可省略该步骤)。 10.加入1/10体积的3 moll naAc及2×体积的冰乙醇混匀,-20℃放置20移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml 离 心管（有盖）及 5ml 和 1.5ml 离心管，弯成钩状的小玻棒。 三、试剂 1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g 葡萄糖，6.9g 二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul 巯基乙醇，加水至 300ml。 3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 4、 RnaseA 母液：配方见第一章。 5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE 缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 四、操作步骤： （一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组 DNA 提取 1. 在 50ml 离心管中加入 20ml 提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。 2. 水稻幼苗或叶子 5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热 的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温 30-60 分钟(时间长,DNA 产量高), 不 时摇动。 3. 加入 20ml 氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室 温下静置 5-10 分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 4. 室温下 5000rpm 离心 5 分钟。 5. 仔细移取上清液至另一 50ml 离心管,加入 1 倍体积异丙醇,混匀,室温下放 置片刻即出现絮状 DNA 沉淀。 6. 在 1.5ml eppendorf 中加入 1ml TE。用钩状玻璃棒捞出 DNA 絮团,在干净 吸水纸上吸干,转入含 TE 的离心管中,DNA 很快溶解于 TE。 7. 如 DNA 不形成絮状沉淀,则可用 5000rpm 离心 5 分钟, 再将沉淀移入 TE 管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于 TE,可在 60℃水浴放置 15 分钟以上，以帮 助溶解。 8. 将 DNA 溶液 3000rpm 离心 5 分钟, 上清液倒入干净的 5ml 离心管。 9. 加入 5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10 分钟, 除去 RNA(RNA 对 DNA 的 操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。 10. 加入 1/10 体积的 3mol/L NaAc 及 2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置 20