第六章基因组DNA的提取 第一节概述 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、 Southern杂交(包括RFLP) 及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性可以将其与细胞器或质粒等 小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇,基因组的大分子DNA即沉淀 形成纤维状絮团飘浮其中,可用玻棒将其取出,而小分子DNA则只形成颗粒状 沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的。在提取过程中染色体会发生机械断 裂产生大小不同的片段因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如 尽量减少酚氯仿抽提、混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。一般来说构 建基因组文库,初始DNA长度必须在100kb以上否则酶切后两边都带合适末端 的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析,DNA长度可短至50kb,在该长度 以上可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下并可保证包含PCR所扩增的片段 (一般2kb以下)。 不同生物(植物、动物、微生物)的基因组DNA的提取方法有所不同;不 同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同,分离方法也有差 异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR 反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时,应考 虑除去多糖和酚类物质。 本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果川叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养 物为材料学习基因组DNA提取的一般方法 第二节从植物组织提取基因组DNA 、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物,李(苹果)幼嫩叶子。 设备
第六章 基因组 DNA 的提取 第一节 概 述 基因组 DNA 的提取通常用于构建基因组文库、Southern 杂交(包括 RFLP) 及 PCR 分离基因等。利用基因组 DNA 较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等 小分子 DNA 分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子 DNA 即沉淀 形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子 DNA 则只形成颗粒状 沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断 裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组 DNA 时应尽量在温和的条件下操作,如 尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的 DNA。一般来说,构 建基因组文库, 初始 DNA 长度必须在 100kb 以上,否则酶切后两边都带合适末端 的有效片段很少。而进行 RFLP 和 PCR 分析, DNA 长度可短至 50kb, 在该长度 以上,可保证酶切后产生 RFLP 片段(20kb 以下),并可保证包含 PCR 所扩增的片段 (一般 2kb 以下)。 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组 DNA 的提取方法有所不同; 不 同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差 异。在提取某种特殊组织的 DNA 时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的 DNA 大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR 反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组 DNA 时, 应考 虑除去多糖和酚类物质。 本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养 物为材料,学习基因组 DNA 提取的一般方法。 第二节 从植物组织提取基因组 DNA 一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。 二、设备
移液器,冷冻高速离心机,台式髙速离心机,水浴锅,陶瓷硏钵,50m离 心管(有盖)及5m和1.5m离心管,弯成钩状的小玻棒。 三、试剂 1、提取缓冲液I:100 mmol/ tris:Cl,pH8.0,20 mmOl/L EDTA,500 mmol/L NaCl. 1.5% SDS 2、提取缓冲液Ⅱ:l86g葡萄糖,6.9g二乙基二硫代碳酸钠,60gPVP,240ul 巯基乙醇,加水至300ml。 3、804:16氯仿戊醇:乙醇 4、 RnaseA母液:配方见第一章。 5、其它试剂:液氮、异丙醇、TE缓冲液,无水乙醇、70%乙醇、3mol/ NAaC 四、操作步骤 (一)水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取 1.在50m离心管中加入20ml提取缓冲液I,60℃水浴预热。 2.水稻幼苗或叶子5-10g,剪碎,在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热 的离心管中,剧烈摇动混匀,60℃水浴保温30-60分钟(时间长DNA产量高)不 时摇动。 3.加入20m氯仿戊醇/乙醇溶液,颠倒混匀(需带手套,防止损伤皮肤),室 温下静置5-10分钟,使水相和有机相分层(必要时可重新混匀) 4.室温下5000pm离心5分钟。 5.仔细移取上清液至另一50ml离心管加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放 置片刻即出现絮状DNA沉淀 6.在1.5 ml eppendorf中加入lmlT。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净 吸水纸上吸干转入含TE的离心管中DNA很快溶解于TE。 7.如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000pm离心5分钟,再将沉淀移入TE 管中。这样收集的沉淀往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上,以帮 助溶解。 8.将DNA溶液3000pm离心5分钟,上清液倒入干净的5ml离心管 9.加入5u1 RNaseA(10μg/u1),37℃10分钟,除去RNA(RNA对DNA的 操作、分析一般无影响,可省略该步骤)。 10.加入1/10体积的3 moll naAc及2×体积的冰乙醇混匀,-20℃放置20
移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml 离 心管（有盖）及 5ml 和 1.5ml 离心管，弯成钩状的小玻棒。 三、试剂 1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g 葡萄糖，6.9g 二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul 巯基乙醇，加水至 300ml。 3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 4、 RnaseA 母液：配方见第一章。 5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE 缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 四、操作步骤： （一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组 DNA 提取 1. 在 50ml 离心管中加入 20ml 提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。 2. 水稻幼苗或叶子 5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热 的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温 30-60 分钟(时间长,DNA 产量高), 不 时摇动。 3. 加入 20ml 氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室 温下静置 5-10 分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 4. 室温下 5000rpm 离心 5 分钟。 5. 仔细移取上清液至另一 50ml 离心管,加入 1 倍体积异丙醇,混匀,室温下放 置片刻即出现絮状 DNA 沉淀。 6. 在 1.5ml eppendorf 中加入 1ml TE。用钩状玻璃棒捞出 DNA 絮团,在干净 吸水纸上吸干,转入含 TE 的离心管中,DNA 很快溶解于 TE。 7. 如 DNA 不形成絮状沉淀,则可用 5000rpm 离心 5 分钟, 再将沉淀移入 TE 管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于 TE,可在 60℃水浴放置 15 分钟以上，以帮 助溶解。 8. 将 DNA 溶液 3000rpm 离心 5 分钟, 上清液倒入干净的 5ml 离心管。 9. 加入 5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10 分钟, 除去 RNA(RNA 对 DNA 的 操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。 10. 加入 1/10 体积的 3mol/L NaAc 及 2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置 20
分钟左右DNA形成絮状沉淀 1l.用玻棒捞出DNA沉淀70%乙醇漂洗再在干净吸水纸上吸干。 12.将DNA重溶解于1mlTE,-20贮存。 13.取2μlDNA样品在0.7% Agarose胶上电泳,检测DNA的分子大小。同 时取15μl稀释20倍,测定OD260OD280,检测DNA含量及质量。 [注意]5g样品可保证获得500μgDNA,足供RFLP、PCR等分析之用 (二).从李(苹果)叶子提取基因组DNA 1.取3-5克嫩叶,液氮磨成粉状。 2.加入提取缓冲液Ⅱl0ml,再研磨至溶浆状。10000pm,10min。 3.去上清液沉淀加提取液Ⅰ20ml,混匀。65℃,30-60min,常摇动。 4.同本节(一)中步骤3-13操作。 第三节从动物组织提取基因组DNA 、材料 哺乳动物新鲜组织。 设备 移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。 三、试剂 1、分离缓冲液:10 mmol/ tris·ClpH74,10 mmol/L Nacl,25 mMoVL EDTA。 2、其它试剂:10%SDS,蛋白酶K(20mgml或粉剂),乙醚,酚:氯仿:异戊 醇(2524:1),无水乙醇及70%乙醇,5 mol/L Nacl,3 mo/L NaAc,TE 四、操作步骤: 1.切取组织5g左右,剔除结缔组织吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越 2.倒入液氮磨成粉末加10m分离缓冲液 3.加lmll0%SDS,混匀此时样品变得很粘稠。 4.加50ul或1mg蛋白酶K,37℃保温1-2小时,直到组织完全解体 5.加1m5 mol/L NaCl,混匀5000pm离心数秒钟。 6取上清液于新离心管,用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层
分钟左右,DNA 形成絮状沉淀。 11. 用玻棒捞出 DNA 沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。 12. 将 DNA 重溶解于 1ml TE, -20 贮存。 13. 取 2μl DNA 样品在 0.7% Agarose 胶上电泳, 检测 DNA 的分子大小。同 时取 15μl 稀释 20 倍, 测定 OD260/OD280, 检测 DNA 含量及质量。 [注意] 5g 样品可保证获得 500μg DNA, 足供 RFLP、PCR 等分析之用。 （二）. 从李(苹果)叶子提取基因组 DNA 1. 取 3-5 克嫩叶, 液氮磨成粉状。 2. 加入提取缓冲液Ⅱ10ml, 再研磨至溶浆状。10000rpm, 10min。 3. 去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混匀。65℃, 30-60min, 常摇动。 4. 同本节（一）中步骤 3-13 操作。 第三节 从动物组织提取基因组 DNA 一、材料 哺乳动物新鲜组织。 二、设备 移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。 三、试剂 1、分离缓冲液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。 2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml 或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异戊 醇(25:24:1)，无水乙醇及 70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。 四、操作步骤: 1. 切取组织 5g 左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越 好)。 2. 倒入液氮,磨成粉末,加 10ml 分离缓冲液。 3. 加 1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。 4. 加 50ul 或 1mg 蛋白酶 K, 37℃保温 1-2 小时, 直到组织完全解体。 5. 加 1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm 离心数秒钟。 6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层
后3000pm离心5分钟。 7.取上层水相至干净离心管,加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。 8.移去上层乙醚保留下层水相 9.加/10体积3 mol/L NaAc,及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室 温下静止10-20分钟,DNA沉淀形成白色絮状物。 10.用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后在吸水纸上吸干溶解于1n 正中-20℃保存 1l.如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000pm短暂离心取上清;如要除 去其中的RNA,可加5μ1 RNasea(10μg/μ),37℃保温30分钟,用酚抽提后,按 步骤9-10重沉淀DNA。 第四节细菌基因组DNA的制备 、材料 细菌培养物。 设备 移液管,高速冷冻离心机,台式离心机,水浴锅。 试剂 1、 CTAB/NaCl溶液:4 Ig NaCl溶解于80mlH2O,缓慢加入10 g CTAB加水 至100ml。 2、其它试剂:氯仿:异戊醇(24:1),酚氯仿异戊醇(25241),异丙醇,70%乙 醇,TE,10%SDS,蛋白酶K(20mg/ml或粉剂),5 mol/L NaCl 四、操作步骤 l.100ml细菌过夜培养液,5000pm离心10分钟,去上清液 2.加9.5mlTE悬浮沉淀,并加05ml10%SDS,50u120mgml(或1mg干粉) 蛋白酶K,混匀,37℃保温1小时。 3.加1.5ml5 mol/L NaCl,混匀 4.加1.5 mI ctAB∧NaCl溶液,混匀,65℃保温20分钟 5.用等体积酚氯仿:异戊醇(2524:1)抽提,5000pm离心10分钟,将上清液 移至干净离心管
后,3000rpm 离心 5 分钟。 7. 取上层水相至干净离心管, 加 2 倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。 8. 移去上层乙醚,保留下层水相。 9. 加 1/10 体积 3mol/L NaAc, 及 2 倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀 DNA。室 温下静止 10-20 分钟，DNA 沉淀形成白色絮状物。 10. 用玻棒钩出 DNA 沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于 1ml TE 中,-20℃保存。 11. 如果 DNA 溶液中有不溶解颗粒,可在 5000rpm短暂离心,取上清; 如要除 去其中的 RNA,可加 5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温 30 分钟, 用酚抽提后, 按 步骤 9-10 重沉淀 DNA。 第四节 细菌基因组 DNA 的制备 一、材料 细菌培养物。 二、设备 移液管, 高速冷冻离心机, 台式离心机，水浴锅。 三、试剂 1、CTAB/NaCl 溶液：4.1g NaCl 溶解于 80ml H2 O,缓慢加入 10g CTAB,加水 至 100ml。 2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙 醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml 或粉剂)，5mol/L NaCl。 四、操作步骤： 1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm 离心 10 分钟, 去上清液。 2. 加 9.5ml TE 悬浮沉淀, 并加 0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或 1mg 干粉) 蛋白酶 K, 混匀, 37℃保温 1 小时。 3. 加 1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。 4. 加 1.5ml CTAB/NaCl 溶液, 混匀, 65℃保温 20 分钟。 5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm 离心 10 分钟, 将上清液 移至干净离心管
6.用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提,取上清液移至干净管中, 7.加1倍体积异丙醇,颠倒混合,室温下静止10分钟,沉淀DNA。 8.用玻棒捞出DNA沉淀,π0%乙醇漂洗后,吸干溶解于1mTE,-20℃保存。 如DNA沉淀无法捞出,可500opm离心,使DNA沉淀。 9.如要除去其中的RNA,可以按本章第三节中操作步骤处理。 第五节基因组DNA的检测 上述方法得到的DNA一般可以用作 Southern,RFLP、PCR等分析。由于所 用材料的不同,得到的DNA产量及质量均不同有时DNA中含有酚类和多糖类物 质会影响酶切和PCR的效果。所以获得基因组DNA后均需检测DNA的产量 和质量。 1.DNA溶液稀释20-30倍后,测定OD260OD280比值,明确DNA的含量和 质量 2.取2-5p1在0.7% agarose胶上电泳,检测DNA的分子大小。 3.取2 ug dNA,用10单位( D)HindⅢ酶切过夜,0.7% agarose胶上电泳,检 测能否完全酶解(做 RFLP DNA必须完全酶解) 如果DNA中所含杂质多,不能完全酶切,或小分子DNA多,影响接续的分 析和操作可以用下列方法处理: (1)选用幼嫩植物组织,可减少淀粉类的含量。 (2)酚:氯仿抽提,去除蛋白质和多糖。 (3) Sepharose柱过滤,去除酚类、多糖和小分子DNA。 (4)CsCl梯度离心,去除杂质,分离大片段DNA(可用作文库构建)
6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 7. 加 1 倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止 10 分钟，沉淀 DNA。 8. 用玻棒捞出 DNA 沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于 1ml TE, -20℃保存。 如 DNA 沉淀无法捞出,可 5000rpm 离心, 使 DNA 沉淀。 9. 如要除去其中的 RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。 第五节 基因组 DNA 的检测 上述方法得到的 DNA 一般可以用作 Southern, RFLP、PCR 等分析。由于所 用材料的不同,得到的 DNA 产量及质量均不同,有时 DNA 中含有酚类和多糖类物 质,会影响酶切和 PCR 的效果。所以获得基因组 DNA 后,均需检测 DNA 的产量 和质量。 1. DNA 溶液稀释 20-30 倍后,测定 OD260 /OD280 比值, 明确DNA 的含量和 质量。 2. 取 2-5μl 在 0.7% agarose 胶上电泳, 检测 DNA 的分子大小。 3. 取 2μg DNA, 用 10 单位(U)HindⅢ酶切过夜, 0.7% agarose 胶上电泳, 检 测能否完全酶解(做 RFLP, DNA 必须完全酶解)。 如果 DNA 中所含杂质多, 不能完全酶切, 或小分子 DNA 多, 影响接续的分 析和操作,可以用下列方法处理： （1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。 （2） 酚:氯仿抽提, 去除蛋白质和多糖。 （3）Sepharose 柱过滤, 去除酚类、多糖和小分子 DNA。 （4）CsCl 梯度离心, 去除杂质, 分离大片段 DNA(可用作文库构建)