核酸分子杂交
定义 具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或 固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的 过程叫核酸分子杂交
具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或 固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的 过程叫核酸分子杂交
种类 按反应支持物可分为固相杂交和液相杂交两种: 固相杂交应用较广,包括 Southern blot Northern blot、 Spot blot、 in situ hybridization等
按反应支持物可分为固相杂交和液相杂交两种： 固相杂交应用较广，包括Southern blot、 Northern blot 、Spot blot、in situ hybridization等
DNA Hybridization . De-and re-nature DNA DS using temperature variation MTTM high u high lower DNA double helices denaturation to renaturation restores single strands DNa double helices (nucleotide pairs (nucleotide pairs re-formed broken)
DNA Hybridization •De- and re-nature DNA DS using temperature variation
核酸探针制备及标记 ●核酸探针( probe)是指能与特定核酸序 列发生特异性互补的已知核酸片段,因 而可检测样品中特定的基因序列
l 核酸探针（probe）是指能与特定核酸序 列发生特异性互补的已知核酸片段，因 而可检测样品中特定的基因序列
探针 ●根据核酸探针的来源及性质有双链DNA、单链 DNA、单链RNA和人工合成的寡核苷酸探针等 用于分子杂交的核酸探针均须进行标记,带有 示踪物,与靶基因杂交后,才能检测显示出杂 交体信号。标记物有放射性同位素和非 同位素两大类。H、3和32P是三种较常用的 放射性同位素标记物,非放射性同位素标记物 较常用的是生物素( biotin)、地高 ( digoxigenin,DG)和荧光素等
l 根据核酸探针的来源及性质有双链DNA、单链 DNA、单链RNA和人工合成的寡核苷酸探针等。 用于分子杂交的核酸探针均须进行标记，带有 示踪物，与靶基因杂交后，才能检测显示出杂 交体信号。标记物有放射性同位素和非放射性 同位素两大类。 3H、 35S和32P是三种较常用的 放射性同位素标记物，非放射性同位素标记物 较 常 用 的 是 生 物 素 （ b i o t i n ） 、 地 高 辛 （digoxigenin，DIG）和荧光素等
()缺口平移标记法( Nick translation) 原理] ●在未标记的DNA探针溶液中加入一定量 的胰DNA酶I( DNase i),DNA聚合 酶Ⅰ和标记的三磷酸核苷。 DNase I在 DNA双链上随机切开若干个带有3′-OH末 端的单链缺口,而DNA聚合酶Ⅰ发挥 5→3′核酸外切酶活性从5′-末端
l ［原理］ l 在未标记的DNA探针溶液中加入一定量 的胰DNA酶Ⅰ（DNaseⅠ），DNA聚合 酶Ⅰ和标记的三磷酸核苷。DNaseⅠ在 DNA双链上随机切开若干个带有3′-OH末 端的单链缺口，而DNA聚合酶Ⅰ发挥 5′→3′核酸外切酶活性从5′-末端
标记 ●切除单核苷酸;同时又具有从5→→3‘的聚 合作用,将标记的三磷酸核苷按5-3方 向重新修补缺口,此新合成DNA的两条 链均匀地被掺人标记物。该法适合于各 种环状或线性双链DNA探针标记
l 切除单核苷酸；同时又具有从5′→3′的聚 合作用，将标记的三磷酸核苷按5′→3′方 向重新修补缺口，此新合成DNA的两条 链均匀地被掺人标记物。该法适合于各 种环状或线性双链DNA探针标记
标记 试剂] 1.10×缺口平移缓冲液 0.5 mol/L Tris-Cl(pH7. 2) 0.1 mol/L MgSO4 ●1.0mmoL二硫苏糖醇(DTT) ●500μgml牛血清白蛋白(BSA)
l ［试剂］ l 1. 10×缺口平移缓冲液 l 0.5 mol/L Tris-Cl(pH7.2） l l 0.1 mol/L MgSO4 l l 1.0 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT) l l 500 μg/ml 牛血清白蛋白(BSA) l
标记 2.未标记脱氧三磷酸核苷(dNTP)溶液: dTTP、dCTP、dGTP溶于50mmo/ L Tris-Cl(pH 7.2),终浓度为20mmoL。 3. DNase i(long/ml):溶于含50μg/mBSA lmmo/LDTT、50%(ⅴ/Ⅳ)乙二醇的溶液。 4.DNA聚合酶Ⅰ(5U/ul):溶于50 mmOl/L Tris-Cl(pH7.2)。 ●5.[0-32P]dATP:3000Ci/mmol、10μCi/μo
l 2. 未标记脱氧三磷酸核苷（dNTP）溶液： dTTP、dCTP、dGTP溶于50mmol/L Tris-Cl ( pH 7.2)，终浓度为20mmol/L。 l 3. DNaseⅠ（10ng/ml）：溶于含 50μg/ml BSA、 1mmol/L DTT 、50%（V/V）乙二醇的溶液。 l 4. DNA聚合酶Ⅰ（5U/μl）：溶于50mmol/L Tris-Cl ( pH 7.2)。 l 5. [α- 32P]dATP：3000Ci/mmol、10μCi/μl