品及其包装 1、原理处理 对新鱼或冻藏鱼精除去污物和结缔组织。 2、匀浆 以原料与高盐溶液（2MnaCL-0.015M 柠檬酸三钠溶液）比为 1:3 加入高盐液，以 12000r/min×1′45″匀浆。 3、第一次变性 以原料与酚饱和溶液比为 1：0.8 后加速离心（3200r/min×30′） 4、第二次变性 取上述离心后的上清液稀释至 20-30 倍（以鱼精原料为基础程），加紧入其 1/9 体程（以 20 倍稀释时）的混合变性剂（5%SDS ，CHCL3=1：2），同时加入固体 NaCL， 使整个体系氯化钠浓度保持 1M。搅拌变性 1h 后，静置 6-12h，离心。 5、DNA-Na 的析出、洗涤和干燥 将二次变性后所得的上清液，徐徐倾入 1 倍体积的 95% 乙醇中，用两个容器往复倾倒几次，纤维状的 DNA-Na 就析出，将析出的 DNA-Na 依次用 95%的乙醇、丙酮和无水乙醇洗涤二次后，迅速用 P2O5 进行真空干燥。 （四）、5′-脱氧核酸的分离与精制 对于核酸的制备，前人已做过不少工作，也有好几类方法，有微生物发酵法，生物提取法等。 酶水解法曾因酶源的限制而不能推广应用。但自 60 年代开始，国内外均对微生物产生的核 酸酶进行了大量的研究。我国 1964 年上海轻工业研究所等用桔青霉（ penicillium citrinum）降解鱼精 DNA。1975 年以后，浙江水产学院 P·citrinum 菌的紫外线变异及酶活 的提高作了进一步的探索，发现由该菌产生的核酸酶 P1 具有酶解效率高，酶活较稳定，在 一定条件下，酶源可以控制，且成本较低等优点。 对于脱氧单核酸的分离与制备方法的研究不及核糖单核酸，在 W.Z.Cohn 等 1949 年发表用 离子交换法来分离核酸的组成以后，此法才被广泛应用于定性、定量乃至制备性的分离工作。 国外常用 Dowex-1 及 Dowex-2 和 Amberlite R-410，也有用 Dowex-5（阳离子交换剂），但 最多的还是 Dowex-1（阴离子交换剂）和 Dowex-2。国内上海第十二制药厂、上海鱼品加厂 用国产 201×T（氯型）阴离子交换树脂层析，稀盐酸洗脱分离 DNA 的炎解液，发现四种脱 氧单核酸的分离效果不理想，后来浙江水产学院通过若干年的研究，探索并获得了四种脱氧 单核酸完全分离的条件，并进而探求了取得其结晶成品的最适工艺。 工艺流程 鱼精 DNA-Na → 配成 1%（w/v）溶液 → 100℃沸水浴热变性 10 分钟 → 速冷 → 72℃± 0.5 酶解 1.5h 升温至 100℃，10min → 速冻 → 过滤 → 滤液（测酶解率）上 201×8 柱（同 时脱氧核等穿漏）用不同洗脱液脱分离（洗脱顺序为 Dcmp dAMP TMP dGMP）收集的 各种洗脱液用炭柱浓缩｛→一级真空浓缩 → 冷冻升华干燥→ → 两级真空浓缩 → 用冷酒精析出→ 洗涤→结晶 → 真空干燥→ 结晶成品→ 成品检验。 方法要点 1、核酸酶 P1 用 P. citrinum M71 经紫外线变异筛选后的菌株，采用液体培养制得的，滤 过液酶活每 ml 对 DNA 在 100 单位上下，对 RNA 为 300 多单位。 2、酶解反应 取定量热变性 DNA-Na 液，以 0.1N HCL 调 Ph5.0±0.1，72℃预热，加 Ph5.0±0.1 的 0.2M HAL-Ma 液 5%（v/v），加 0.05M ZnCL2 0.028%( v/v),酶解时 DNA-Na 浓度为 0.5%-0.1%,加酶液（1mgNAD-Na,酶活 10u）,计时并始终维持 72℃±0.5℃ 1.5h,煮沸 10min 终止酶反应，急冷至室温。过滤后，用 5%氨水调 pH8-9，再过滤后作上清液检验（用磺基 水杨酸检查去沉淀程度）并作纸层析鉴定，余者低温贮藏待用。 3、离子交换柱层析分离 201×8 柱（200-400 目）按常规预处理并转成氨型，用 5%氨水调 pH8-9，装柱，抽去气泡、平衡。 洗脱时，用 0.0018N（附近）HCL、0.0028N HCL，分别洗出 dCMP 和 dAMP，后用 pH6.0 的 0.036N NaCL 洗脱 Dtmp，最后用 0.02N NaCL 洗脱 Dtmp，最后用 0.2N NaCL 和 0.005 N HCL 溶液洗脱 Dgmp;洗脱效果见图 12-1。 4、炭柱处理 按常规用蒸馏水浸泡过夜，在 1N，NaOH 中煮沸 15min ,用蒸馏水洗至中性， 再用 1N HCL 煮沸 15min，并用蒸馏水洗至 pH3.0；装柱、平衡。每 ml 活化活性炭交换 22mg Dnmp ,上样流速1.9-2.6ml/cm2min 最后洗脱用5%NH3H2O:45%H2O:50%的95%乙醇的混合 物，流速 0.2-0.4ml.cm2min 洗至 OD260 为 0.55 以下。 5、真空浓缩 （1）第一级真空浓缩 浓缩液的蒸馏瓶置于水浴锅中（45℃） 冷凝器 集液瓶 集液瓶品及其包装 1、原理处理 对新鱼或冻藏鱼精除去污物和结缔组织。 2、匀浆 以原料与高盐溶液（2MnaCL-0.015M 柠檬酸三钠溶液）比为 1:3 加入高盐液，以 12000r/min×1′45″匀浆。 3、第一次变性 以原料与酚饱和溶液比为 1：0.8 后加速离心（3200r/min×30′） 4、第二次变性 取上述离心后的上清液稀释至 20-30 倍（以鱼精原料为基础程），加紧入其 1/9 体程（以 20 倍稀释时）的混合变性剂（5%SDS ，CHCL3=1：2），同时加入固体 NaCL， 使整个体系氯化钠浓度保持 1M。搅拌变性 1h 后，静置 6-12h，离心。 5、DNA-Na 的析出、洗涤和干燥 将二次变性后所得的上清液，徐徐倾入 1 倍体积的 95% 乙醇中，用两个容器往复倾倒几次，纤维状的 DNA-Na 就析出，将析出的 DNA-Na 依次用 95%的乙醇、丙酮和无水乙醇洗涤二次后，迅速用 P2O5 进行真空干燥。 （四）、5′-脱氧核酸的分离与精制 对于核酸的制备，前人已做过不少工作，也有好几类方法，有微生物发酵法，生物提取法等。 酶水解法曾因酶源的限制而不能推广应用。但自 60 年代开始，国内外均对微生物产生的核 酸酶进行了大量的研究。我国 1964 年上海轻工业研究所等用桔青霉（ penicillium citrinum）降解鱼精 DNA。1975 年以后，浙江水产学院 P·citrinum 菌的紫外线变异及酶活 的提高作了进一步的探索，发现由该菌产生的核酸酶 P1 具有酶解效率高，酶活较稳定，在 一定条件下，酶源可以控制，且成本较低等优点。 对于脱氧单核酸的分离与制备方法的研究不及核糖单核酸，在 W.Z.Cohn 等 1949 年发表用 离子交换法来分离核酸的组成以后，此法才被广泛应用于定性、定量乃至制备性的分离工作。 国外常用 Dowex-1 及 Dowex-2 和 Amberlite R-410，也有用 Dowex-5（阳离子交换剂），但 最多的还是 Dowex-1（阴离子交换剂）和 Dowex-2。国内上海第十二制药厂、上海鱼品加厂 用国产 201×T（氯型）阴离子交换树脂层析，稀盐酸洗脱分离 DNA 的炎解液，发现四种脱 氧单核酸的分离效果不理想，后来浙江水产学院通过若干年的研究，探索并获得了四种脱氧 单核酸完全分离的条件，并进而探求了取得其结晶成品的最适工艺。 工艺流程 鱼精 DNA-Na → 配成 1%（w/v）溶液 → 100℃沸水浴热变性 10 分钟 → 速冷 → 72℃± 0.5 酶解 1.5h 升温至 100℃，10min → 速冻 → 过滤 → 滤液（测酶解率）上 201×8 柱（同 时脱氧核等穿漏）用不同洗脱液脱分离（洗脱顺序为 Dcmp dAMP TMP dGMP）收集的 各种洗脱液用炭柱浓缩｛→一级真空浓缩 → 冷冻升华干燥→ → 两级真空浓缩 → 用冷酒精析出→ 洗涤→结晶 → 真空干燥→ 结晶成品→ 成品检验。 方法要点 1、核酸酶 P1 用 P. citrinum M71 经紫外线变异筛选后的菌株，采用液体培养制得的，滤 过液酶活每 ml 对 DNA 在 100 单位上下，对 RNA 为 300 多单位。 2、酶解反应 取定量热变性 DNA-Na 液，以 0.1N HCL 调 Ph5.0±0.1，72℃预热，加 Ph5.0±0.1 的 0.2M HAL-Ma 液 5%（v/v），加 0.05M ZnCL2 0.028%( v/v),酶解时 DNA-Na 浓度为 0.5%-0.1%,加酶液（1mgNAD-Na,酶活 10u）,计时并始终维持 72℃±0.5℃ 1.5h,煮沸 10min 终止酶反应，急冷至室温。过滤后，用 5%氨水调 pH8-9，再过滤后作上清液检验（用磺基 水杨酸检查去沉淀程度）并作纸层析鉴定，余者低温贮藏待用。 3、离子交换柱层析分离 201×8 柱（200-400 目）按常规预处理并转成氨型，用 5%氨水调 pH8-9，装柱，抽去气泡、平衡。 洗脱时，用 0.0018N（附近）HCL、0.0028N HCL，分别洗出 dCMP 和 dAMP，后用 pH6.0 的 0.036N NaCL 洗脱 Dtmp，最后用 0.02N NaCL 洗脱 Dtmp，最后用 0.2N NaCL 和 0.005 N HCL 溶液洗脱 Dgmp;洗脱效果见图 12-1。 4、炭柱处理 按常规用蒸馏水浸泡过夜，在 1N，NaOH 中煮沸 15min ,用蒸馏水洗至中性， 再用 1N HCL 煮沸 15min，并用蒸馏水洗至 pH3.0；装柱、平衡。每 ml 活化活性炭交换 22mg Dnmp ,上样流速1.9-2.6ml/cm2min 最后洗脱用5%NH3H2O:45%H2O:50%的95%乙醇的混合 物，流速 0.2-0.4ml.cm2min 洗至 OD260 为 0.55 以下。 5、真空浓缩 （1）第一级真空浓缩 浓缩液的蒸馏瓶置于水浴锅中（45℃） 冷凝器 集液瓶 集液瓶