第五章 鱼精的利用 主要内容 ⚫ ⚫ 自鱼精中提取 DNA-Na ⚫ ⚫ 鱼精蛋白 ⚫ ⚫ 目标要求 ⚫ ⚫ 掌握自鱼精中提取 DNA-Na 的工艺 ⚫ ⚫ 掌握鱼精蛋白的工艺 学时建议 2 学时 一|、自鱼精中提取 DNA-Na （一）、概述 DNA 及其钠盐（DNA-Na）是遗传工程研究的重要材料，也是常用的生化试剂和医药制品 的原料。由 DNA 降解而成的 5′—脱氧核甘酸，在遗传工程上可用来合成一级结构模拟药 物，在临床上能控制一些贵遗传复制失调的疾病；在医药学上，可作为类抗病毒物，能起到 调节细胞功能，对治疗急慢性肝炎、肾炎、肌肉萎缩、心血压计管病、血小板减少症和白血 球减少症均有一定疗效；还可作为一类抗癌新药畏助应用于临床。 DNA 的制备，在五十年代是 Zamenhoff 等用不同方法从生产牛肉膏的下脚料小牛胸腺中提 取的，后来牛肉膏被蛋白胨取而代之。人们开始不断地探寻新的生产原料和方法。/国外亲 从各种微生物中分离制取过 DNA，但由于原料来源不便，未能广泛采用。1972 年德国专利 报告了鲱鱼精巢 DNA 的制备。在我国，早在 1958 年，中国科学院、上海鱼品厂等就以黄 鱼精巢为原料制取了 DNA-Na。80 年代前后，浙江水产学院分别由鲐鱼、蓝圆、大黄鱼和 马面的精巢中提取了 DNA-Na，并对其制备工艺进行了成功的筛选研究。 （二）、原料 制备 DNA 的原料应该符合下列几个条件： 1、DNA 含量高而且不源方便； 2、原料内活性去氧化核糖核酸酶的含量应该低，否则在原料贮藏及制备过程中，引起 DNA 的解聚作用； 3、原料中其它杂质，如 RNA、杂蛋白质及碳水化合物等含量要少，否则使提纯过程延长； 4、DNA 与蛋白质之间的结合强度应该是较弱的，否则难以分离 DNA 与蛋白质，在用变性 剂去蛋白质时，往往要重复多次主能把蛋白除尽。多年来的实践证明，除了犊牛胸腺外，水 产品中，淡水鱼，鱼等精巢均是较理想的原料，其次为蓝圆、大黄鱼和马面鱼精巢。 根据上面四个原则，很自然地提出了对原料新鱼并的要求，因为新鲜的才不会被解聚。而要 想达到 DNA 含量高的要求，则必须在适当的生长时期采集，并且要设法抑制 Dnase 的解聚 活力。 很显然，保藏原料具有很重要的意义，在鱼汛季节拥有大量的新鱼鱼精必须用低温冷藏，或 将鱼精先加工成核精蛋白加以保存。 （三）、DNA-Na 提取工艺 制取 DNA-Na 的具体方法很多，但各种方法最根本的均可归结为下面几步： 第一步：借机械或化学的历代法把组织的细胞破坏，并从中分离出纯净的 DNA-蛋白质。 第二步：以 DNA-蛋白质为原烂漫，把它分成 DNA 与蛋白质两部分。 第三步：把 DNA 部分由离心分出（离心液），并对其重复纯化，去除蛋白质等杂质。 第四步：将 DNA 钠盐干燥。 酚与 CHCL3-5%SDS 复合法，是浙江水产学院在吸取国外各种方法长处的基础上，经筛选改 进而提出的适合工业化生产的制备工艺，它具有产率高，质量稳定，操作方便，周期短，成 本较低诸优点。 工艺流程 原料 → 匀浆 → 搅拌→ 酚法变性 → 静置 → 离心或过滤 → 用 5%SDS 与 CHCL3 作第 二次变性 → 离心或过滤 → 析出 DNANa 纤维 → 洗涤 →真空干燥 → 产品检验→ 成
第五章 鱼精的利用 主要内容 ⚫ ⚫ 自鱼精中提取 DNA-Na ⚫ ⚫ 鱼精蛋白 ⚫ ⚫ 目标要求 ⚫ ⚫ 掌握自鱼精中提取 DNA-Na 的工艺 ⚫ ⚫ 掌握鱼精蛋白的工艺 学时建议 2 学时 一|、自鱼精中提取 DNA-Na （一）、概述 DNA 及其钠盐（DNA-Na）是遗传工程研究的重要材料，也是常用的生化试剂和医药制品 的原料。由 DNA 降解而成的 5′—脱氧核甘酸，在遗传工程上可用来合成一级结构模拟药 物，在临床上能控制一些贵遗传复制失调的疾病；在医药学上，可作为类抗病毒物，能起到 调节细胞功能，对治疗急慢性肝炎、肾炎、肌肉萎缩、心血压计管病、血小板减少症和白血 球减少症均有一定疗效；还可作为一类抗癌新药畏助应用于临床。 DNA 的制备，在五十年代是 Zamenhoff 等用不同方法从生产牛肉膏的下脚料小牛胸腺中提 取的，后来牛肉膏被蛋白胨取而代之。人们开始不断地探寻新的生产原料和方法。/国外亲 从各种微生物中分离制取过 DNA，但由于原料来源不便，未能广泛采用。1972 年德国专利 报告了鲱鱼精巢 DNA 的制备。在我国，早在 1958 年，中国科学院、上海鱼品厂等就以黄 鱼精巢为原料制取了 DNA-Na。80 年代前后，浙江水产学院分别由鲐鱼、蓝圆、大黄鱼和 马面的精巢中提取了 DNA-Na，并对其制备工艺进行了成功的筛选研究。 （二）、原料 制备 DNA 的原料应该符合下列几个条件： 1、DNA 含量高而且不源方便； 2、原料内活性去氧化核糖核酸酶的含量应该低，否则在原料贮藏及制备过程中，引起 DNA 的解聚作用； 3、原料中其它杂质，如 RNA、杂蛋白质及碳水化合物等含量要少，否则使提纯过程延长； 4、DNA 与蛋白质之间的结合强度应该是较弱的，否则难以分离 DNA 与蛋白质，在用变性 剂去蛋白质时，往往要重复多次主能把蛋白除尽。多年来的实践证明，除了犊牛胸腺外，水 产品中，淡水鱼，鱼等精巢均是较理想的原料，其次为蓝圆、大黄鱼和马面鱼精巢。 根据上面四个原则，很自然地提出了对原料新鱼并的要求，因为新鲜的才不会被解聚。而要 想达到 DNA 含量高的要求，则必须在适当的生长时期采集，并且要设法抑制 Dnase 的解聚 活力。 很显然，保藏原料具有很重要的意义，在鱼汛季节拥有大量的新鱼鱼精必须用低温冷藏，或 将鱼精先加工成核精蛋白加以保存。 （三）、DNA-Na 提取工艺 制取 DNA-Na 的具体方法很多，但各种方法最根本的均可归结为下面几步： 第一步：借机械或化学的历代法把组织的细胞破坏，并从中分离出纯净的 DNA-蛋白质。 第二步：以 DNA-蛋白质为原烂漫，把它分成 DNA 与蛋白质两部分。 第三步：把 DNA 部分由离心分出（离心液），并对其重复纯化，去除蛋白质等杂质。 第四步：将 DNA 钠盐干燥。 酚与 CHCL3-5%SDS 复合法，是浙江水产学院在吸取国外各种方法长处的基础上，经筛选改 进而提出的适合工业化生产的制备工艺，它具有产率高，质量稳定，操作方便，周期短，成 本较低诸优点。 工艺流程 原料 → 匀浆 → 搅拌→ 酚法变性 → 静置 → 离心或过滤 → 用 5%SDS 与 CHCL3 作第 二次变性 → 离心或过滤 → 析出 DNANa 纤维 → 洗涤 →真空干燥 → 产品检验→ 成
品及其包装 1、原理处理 对新鱼或冻藏鱼精除去污物和结缔组织。 2、匀浆 以原料与高盐溶液（2MnaCL-0.015M 柠檬酸三钠溶液）比为 1:3 加入高盐液，以 12000r/min×1′45″匀浆。 3、第一次变性 以原料与酚饱和溶液比为 1：0.8 后加速离心（3200r/min×30′） 4、第二次变性 取上述离心后的上清液稀释至 20-30 倍（以鱼精原料为基础程），加紧入其 1/9 体程（以 20 倍稀释时）的混合变性剂（5%SDS ，CHCL3=1：2），同时加入固体 NaCL， 使整个体系氯化钠浓度保持 1M。搅拌变性 1h 后，静置 6-12h，离心。 5、DNA-Na 的析出、洗涤和干燥 将二次变性后所得的上清液，徐徐倾入 1 倍体积的 95% 乙醇中，用两个容器往复倾倒几次，纤维状的 DNA-Na 就析出，将析出的 DNA-Na 依次用 95%的乙醇、丙酮和无水乙醇洗涤二次后，迅速用 P2O5 进行真空干燥。 （四）、5′-脱氧核酸的分离与精制 对于核酸的制备，前人已做过不少工作，也有好几类方法，有微生物发酵法，生物提取法等。 酶水解法曾因酶源的限制而不能推广应用。但自 60 年代开始，国内外均对微生物产生的核 酸酶进行了大量的研究。我国 1964 年上海轻工业研究所等用桔青霉（ penicillium citrinum）降解鱼精 DNA。1975 年以后，浙江水产学院 P·citrinum 菌的紫外线变异及酶活 的提高作了进一步的探索，发现由该菌产生的核酸酶 P1 具有酶解效率高，酶活较稳定，在 一定条件下，酶源可以控制，且成本较低等优点。 对于脱氧单核酸的分离与制备方法的研究不及核糖单核酸，在 W.Z.Cohn 等 1949 年发表用 离子交换法来分离核酸的组成以后，此法才被广泛应用于定性、定量乃至制备性的分离工作。 国外常用 Dowex-1 及 Dowex-2 和 Amberlite R-410，也有用 Dowex-5（阳离子交换剂），但 最多的还是 Dowex-1（阴离子交换剂）和 Dowex-2。国内上海第十二制药厂、上海鱼品加厂 用国产 201×T（氯型）阴离子交换树脂层析，稀盐酸洗脱分离 DNA 的炎解液，发现四种脱 氧单核酸的分离效果不理想，后来浙江水产学院通过若干年的研究，探索并获得了四种脱氧 单核酸完全分离的条件，并进而探求了取得其结晶成品的最适工艺。 工艺流程 鱼精 DNA-Na → 配成 1%（w/v）溶液 → 100℃沸水浴热变性 10 分钟 → 速冷 → 72℃± 0.5 酶解 1.5h 升温至 100℃，10min → 速冻 → 过滤 → 滤液（测酶解率）上 201×8 柱（同 时脱氧核等穿漏）用不同洗脱液脱分离（洗脱顺序为 Dcmp dAMP TMP dGMP）收集的 各种洗脱液用炭柱浓缩｛→一级真空浓缩 → 冷冻升华干燥→ → 两级真空浓缩 → 用冷酒精析出→ 洗涤→结晶 → 真空干燥→ 结晶成品→ 成品检验。 方法要点 1、核酸酶 P1 用 P. citrinum M71 经紫外线变异筛选后的菌株，采用液体培养制得的，滤 过液酶活每 ml 对 DNA 在 100 单位上下，对 RNA 为 300 多单位。 2、酶解反应 取定量热变性 DNA-Na 液，以 0.1N HCL 调 Ph5.0±0.1，72℃预热，加 Ph5.0±0.1 的 0.2M HAL-Ma 液 5%（v/v），加 0.05M ZnCL2 0.028%( v/v),酶解时 DNA-Na 浓度为 0.5%-0.1%,加酶液（1mgNAD-Na,酶活 10u）,计时并始终维持 72℃±0.5℃ 1.5h,煮沸 10min 终止酶反应，急冷至室温。过滤后，用 5%氨水调 pH8-9，再过滤后作上清液检验（用磺基 水杨酸检查去沉淀程度）并作纸层析鉴定，余者低温贮藏待用。 3、离子交换柱层析分离 201×8 柱（200-400 目）按常规预处理并转成氨型，用 5%氨水调 pH8-9，装柱，抽去气泡、平衡。 洗脱时，用 0.0018N（附近）HCL、0.0028N HCL，分别洗出 dCMP 和 dAMP，后用 pH6.0 的 0.036N NaCL 洗脱 Dtmp，最后用 0.02N NaCL 洗脱 Dtmp，最后用 0.2N NaCL 和 0.005 N HCL 溶液洗脱 Dgmp;洗脱效果见图 12-1。 4、炭柱处理 按常规用蒸馏水浸泡过夜，在 1N，NaOH 中煮沸 15min ,用蒸馏水洗至中性， 再用 1N HCL 煮沸 15min，并用蒸馏水洗至 pH3.0；装柱、平衡。每 ml 活化活性炭交换 22mg Dnmp ,上样流速1.9-2.6ml/cm2min 最后洗脱用5%NH3H2O:45%H2O:50%的95%乙醇的混合 物，流速 0.2-0.4ml.cm2min 洗至 OD260 为 0.55 以下。 5、真空浓缩 （1）第一级真空浓缩 浓缩液的蒸馏瓶置于水浴锅中（45℃） 冷凝器 集液瓶 集液瓶
品及其包装 1、原理处理 对新鱼或冻藏鱼精除去污物和结缔组织。 2、匀浆 以原料与高盐溶液（2MnaCL-0.015M 柠檬酸三钠溶液）比为 1:3 加入高盐液，以 12000r/min×1′45″匀浆。 3、第一次变性 以原料与酚饱和溶液比为 1：0.8 后加速离心（3200r/min×30′） 4、第二次变性 取上述离心后的上清液稀释至 20-30 倍（以鱼精原料为基础程），加紧入其 1/9 体程（以 20 倍稀释时）的混合变性剂（5%SDS ，CHCL3=1：2），同时加入固体 NaCL， 使整个体系氯化钠浓度保持 1M。搅拌变性 1h 后，静置 6-12h，离心。 5、DNA-Na 的析出、洗涤和干燥 将二次变性后所得的上清液，徐徐倾入 1 倍体积的 95% 乙醇中，用两个容器往复倾倒几次，纤维状的 DNA-Na 就析出，将析出的 DNA-Na 依次用 95%的乙醇、丙酮和无水乙醇洗涤二次后，迅速用 P2O5 进行真空干燥。 （四）、5′-脱氧核酸的分离与精制 对于核酸的制备，前人已做过不少工作，也有好几类方法，有微生物发酵法，生物提取法等。 酶水解法曾因酶源的限制而不能推广应用。但自 60 年代开始，国内外均对微生物产生的核 酸酶进行了大量的研究。我国 1964 年上海轻工业研究所等用桔青霉（ penicillium citrinum）降解鱼精 DNA。1975 年以后，浙江水产学院 P·citrinum 菌的紫外线变异及酶活 的提高作了进一步的探索，发现由该菌产生的核酸酶 P1 具有酶解效率高，酶活较稳定，在 一定条件下，酶源可以控制，且成本较低等优点。 对于脱氧单核酸的分离与制备方法的研究不及核糖单核酸，在 W.Z.Cohn 等 1949 年发表用 离子交换法来分离核酸的组成以后，此法才被广泛应用于定性、定量乃至制备性的分离工作。 国外常用 Dowex-1 及 Dowex-2 和 Amberlite R-410，也有用 Dowex-5（阳离子交换剂），但 最多的还是 Dowex-1（阴离子交换剂）和 Dowex-2。国内上海第十二制药厂、上海鱼品加厂 用国产 201×T（氯型）阴离子交换树脂层析，稀盐酸洗脱分离 DNA 的炎解液，发现四种脱 氧单核酸的分离效果不理想，后来浙江水产学院通过若干年的研究，探索并获得了四种脱氧 单核酸完全分离的条件，并进而探求了取得其结晶成品的最适工艺。 工艺流程 鱼精 DNA-Na → 配成 1%（w/v）溶液 → 100℃沸水浴热变性 10 分钟 → 速冷 → 72℃± 0.5 酶解 1.5h 升温至 100℃，10min → 速冻 → 过滤 → 滤液（测酶解率）上 201×8 柱（同 时脱氧核等穿漏）用不同洗脱液脱分离（洗脱顺序为 Dcmp dAMP TMP dGMP）收集的 各种洗脱液用炭柱浓缩｛→一级真空浓缩 → 冷冻升华干燥→ → 两级真空浓缩 → 用冷酒精析出→ 洗涤→结晶 → 真空干燥→ 结晶成品→ 成品检验。 方法要点 1、核酸酶 P1 用 P. citrinum M71 经紫外线变异筛选后的菌株，采用液体培养制得的，滤 过液酶活每 ml 对 DNA 在 100 单位上下，对 RNA 为 300 多单位。 2、酶解反应 取定量热变性 DNA-Na 液，以 0.1N HCL 调 Ph5.0±0.1，72℃预热，加 Ph5.0±0.1 的 0.2M HAL-Ma 液 5%（v/v），加 0.05M ZnCL2 0.028%( v/v),酶解时 DNA-Na 浓度为 0.5%-0.1%,加酶液（1mgNAD-Na,酶活 10u）,计时并始终维持 72℃±0.5℃ 1.5h,煮沸 10min 终止酶反应，急冷至室温。过滤后，用 5%氨水调 pH8-9，再过滤后作上清液检验（用磺基 水杨酸检查去沉淀程度）并作纸层析鉴定，余者低温贮藏待用。 3、离子交换柱层析分离 201×8 柱（200-400 目）按常规预处理并转成氨型，用 5%氨水调 pH8-9，装柱，抽去气泡、平衡。 洗脱时，用 0.0018N（附近）HCL、0.0028N HCL，分别洗出 dCMP 和 dAMP，后用 pH6.0 的 0.036N NaCL 洗脱 Dtmp，最后用 0.02N NaCL 洗脱 Dtmp，最后用 0.2N NaCL 和 0.005 N HCL 溶液洗脱 Dgmp;洗脱效果见图 12-1。 4、炭柱处理 按常规用蒸馏水浸泡过夜，在 1N，NaOH 中煮沸 15min ,用蒸馏水洗至中性， 再用 1N HCL 煮沸 15min，并用蒸馏水洗至 pH3.0；装柱、平衡。每 ml 活化活性炭交换 22mg Dnmp ,上样流速1.9-2.6ml/cm2min 最后洗脱用5%NH3H2O:45%H2O:50%的95%乙醇的混合 物，流速 0.2-0.4ml.cm2min 洗至 OD260 为 0.55 以下。 5、真空浓缩 （1）第一级真空浓缩 浓缩液的蒸馏瓶置于水浴锅中（45℃） 冷凝器 集液瓶 集液瓶
安全瓶 干燥器（两级） 安全瓶（带真空表） 真空泵。目的是除去氨水、酒精和部分水。 （2）第二级真空浓缩 将一级浓缩液快速离心，真空度 740mmHg 以上、温度 50℃左右， 转速 3000r/min .然后蒸发去水分，其水分经干冰冷凝器，至干燥，安全瓶，最后经真空泵抽 出，结果使物料由液态浓缩成粘稠状。 然后对 Dcmp，调至 pH2.7，对其他三种核酸，则调至微碱性。再用酒精析出，析出时置于 0℃冷间，离心得到沉淀置于真空干燥器干燥，视色泽深浅采取进一步纯化措施（用酒精洗 涤），最后得到无定形结晶成品。 二、鱼精蛋白 （一）、概述 鱼精蛋白又名精蛋白，是分子最较小（约 4000-10000 道尔顿）的简单蛋白质。它存在 于雄性鱼类成熟精子中，常跟 DNA 较紧密地结合在一起。此种结合能被强酸解离。鱼精蛋 白按构成精蛋白分子中有几种碱性氨基酸不定分类。一元精蛋白质仅含精氨酸一种碱性氨基 酸；二元精蛋白除了含精氨酸外还有赖氨酸或组氨酸；三元精蛋白含有三种碱性氨基酸。 日本安藤锐郎最早分离了鲱精蛋白的三个组分并决定了他们各自的一级结构： YI 肽链 31 个氨基酸中精氨酸 20 个，脯氨酸 2 个，丝氨酸 3 个，丙氨酸 2 个，苏氨酸 2 个， 异亮和甘氨酸各 1 个。 YII 肽链 30 个氨基酸中也有 20 个精氨酸 21 个，脯氨酸 3 个，丝氨酸 2 个，缬氨酸 2 个， 苏氨酸 1 个。 Z 肽链 31 个氨基酸中精氨酸 21 个，丝氨酸 3 个，丙氨酸 3 个，脯氨酸 2 个，缬氨酸 2 个。 鲱鱼蛋白的三个组分初级结构见图 12-2。 在鱼精蛋白质中没有酪氨酸（故对 Mill on 反应呈阴性）、色氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸 和甲硫氨酸。它能和多种矿酸结合成盐。它能溶于水、稀氨水、酸和碱；加热不凝固且较为 稳定。它能与多种蛋白质结合形成复合物，因而可以被用来制造长效降血糖激素制剂——鱼 精蛋白胰岛素锌盐，也可制成抗生素复合物，抑制肿瘤周围血管的增长。还用于临床作肝素 制剂和人工合成的抗凝血剂的解毒剂等。此外，它对革兰氏阳性菌有明显的抑制作用，与其 他辅料一起，对水产品、淀粉类等食品有良好的防腐作用。其硫酸盐可用来分离、纯化核酸、 酸性和碱性蛋白。 鱼精蛋白提取工艺的研究起步较早，随着科技的进步工艺日趋成熟。经典的提取方法一 般是将提取过程分两大步：即先提取精子头，再从中提出鱼精蛋白。提取精子头，常用方法 有 Felix 分离法和 Ando。Felix 法是应用质壁分离原理使精子头部离尾丝和细胞质之后经离 心所得悬浊液中加入柠檬酸（最终浓度为 0.003%）,得精子头白色沉淀，然后复以有机溶剂 脱脂、干燥得到纯粹精子头。Ando 法是利用脱氧核糖蛋白即精子头成分在 0.14mol 与 1-2mol NaCL 溶液中不同溶解中的不同溶解度来分离，再用乙醇析出核精蛋白。此外，还有在等渗 盐中用创分段离心法也可分离得到。在取得精子头后，鱼精蛋白部分的提取无论经典的或现 代的方法，基本上是矿酸为主要抽提剂，以柠檬酸盐或有机溶剂为纯化剂。如拉斯姆森法， 将精子头在冷的 0.2mol 盐酸中研磨取得抽出液，再用 0.125mol 苦味酸钠溶液将鱼精蛋白转 换为苦味酸盐黄色沉淀，接着以丙酮法清洗，加 H2SO4 使转化为硫酸盐，最后用乙醇沉淀 得其硫酸盐产品。而 Ando 法则在精子头的 0.2mol 盐酸抽出液中用 Amberlite-400（HCO3- 型）中和酸度，将滤液冷冻干燥即可。 另有一种原苏联的有机溶剂法，它采用大量的有机溶剂（丙酮、乙醇、氯仿等）进行反 复脱水、脱脂、抽提、洗涤鱼精蛋白，其间辅以硫酸钠、氨水、过氧化氢、EDTA 二钠盐等 试剂，再经活性炭脱色，强强性苯乙烯阳离子交换树脂处理，其操作繁琐，成本高昂，虽然 产品质量好但成品得率低。 在最近几年中，鱼精蛋白的提取工艺有了较大的改进与简化，尤其是日本。如在得到鱼精蛋 白盐类的方法中，有将鱼精在稀矿酸液中处理，抽提出鱼精蛋白及混杂蛋白。然后在抽出液 中加入甲醇或乙醇之类的有机溶剂以沉淀上述蛋白，分离子干燥后的固体溶于温水中，再冷 却析出鱼精蛋白盐类。但是在该工艺中，有机溶剂同样也会沉淀杂蛋白，这就势必要进一步 设法除去杂蛋白。尽管在温水中溶解后能析出鱼精蛋白，但同时也一定程度地混入杂蛋白而 影响纯度，这样仍需补充精制步骤。也有在矿酸抽出剂中不用有机溶剂而用聚磷酸盐，使鱼 精蛋白以磷酸盐形式沉淀出来，然后将沉淀溶解在高浓度的硫酸铵中，复分解为精蛋白硫酸
安全瓶 干燥器（两级） 安全瓶（带真空表） 真空泵。目的是除去氨水、酒精和部分水。 （2）第二级真空浓缩 将一级浓缩液快速离心，真空度 740mmHg 以上、温度 50℃左右， 转速 3000r/min .然后蒸发去水分，其水分经干冰冷凝器，至干燥，安全瓶，最后经真空泵抽 出，结果使物料由液态浓缩成粘稠状。 然后对 Dcmp，调至 pH2.7，对其他三种核酸，则调至微碱性。再用酒精析出，析出时置于 0℃冷间，离心得到沉淀置于真空干燥器干燥，视色泽深浅采取进一步纯化措施（用酒精洗 涤），最后得到无定形结晶成品。 二、鱼精蛋白 （一）、概述 鱼精蛋白又名精蛋白，是分子最较小（约 4000-10000 道尔顿）的简单蛋白质。它存在 于雄性鱼类成熟精子中，常跟 DNA 较紧密地结合在一起。此种结合能被强酸解离。鱼精蛋 白按构成精蛋白分子中有几种碱性氨基酸不定分类。一元精蛋白质仅含精氨酸一种碱性氨基 酸；二元精蛋白除了含精氨酸外还有赖氨酸或组氨酸；三元精蛋白含有三种碱性氨基酸。 日本安藤锐郎最早分离了鲱精蛋白的三个组分并决定了他们各自的一级结构： YI 肽链 31 个氨基酸中精氨酸 20 个，脯氨酸 2 个，丝氨酸 3 个，丙氨酸 2 个，苏氨酸 2 个， 异亮和甘氨酸各 1 个。 YII 肽链 30 个氨基酸中也有 20 个精氨酸 21 个，脯氨酸 3 个，丝氨酸 2 个，缬氨酸 2 个， 苏氨酸 1 个。 Z 肽链 31 个氨基酸中精氨酸 21 个，丝氨酸 3 个，丙氨酸 3 个，脯氨酸 2 个，缬氨酸 2 个。 鲱鱼蛋白的三个组分初级结构见图 12-2。 在鱼精蛋白质中没有酪氨酸（故对 Mill on 反应呈阴性）、色氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸 和甲硫氨酸。它能和多种矿酸结合成盐。它能溶于水、稀氨水、酸和碱；加热不凝固且较为 稳定。它能与多种蛋白质结合形成复合物，因而可以被用来制造长效降血糖激素制剂——鱼 精蛋白胰岛素锌盐，也可制成抗生素复合物，抑制肿瘤周围血管的增长。还用于临床作肝素 制剂和人工合成的抗凝血剂的解毒剂等。此外，它对革兰氏阳性菌有明显的抑制作用，与其 他辅料一起，对水产品、淀粉类等食品有良好的防腐作用。其硫酸盐可用来分离、纯化核酸、 酸性和碱性蛋白。 鱼精蛋白提取工艺的研究起步较早，随着科技的进步工艺日趋成熟。经典的提取方法一 般是将提取过程分两大步：即先提取精子头，再从中提出鱼精蛋白。提取精子头，常用方法 有 Felix 分离法和 Ando。Felix 法是应用质壁分离原理使精子头部离尾丝和细胞质之后经离 心所得悬浊液中加入柠檬酸（最终浓度为 0.003%）,得精子头白色沉淀，然后复以有机溶剂 脱脂、干燥得到纯粹精子头。Ando 法是利用脱氧核糖蛋白即精子头成分在 0.14mol 与 1-2mol NaCL 溶液中不同溶解中的不同溶解度来分离，再用乙醇析出核精蛋白。此外，还有在等渗 盐中用创分段离心法也可分离得到。在取得精子头后，鱼精蛋白部分的提取无论经典的或现 代的方法，基本上是矿酸为主要抽提剂，以柠檬酸盐或有机溶剂为纯化剂。如拉斯姆森法， 将精子头在冷的 0.2mol 盐酸中研磨取得抽出液，再用 0.125mol 苦味酸钠溶液将鱼精蛋白转 换为苦味酸盐黄色沉淀，接着以丙酮法清洗，加 H2SO4 使转化为硫酸盐，最后用乙醇沉淀 得其硫酸盐产品。而 Ando 法则在精子头的 0.2mol 盐酸抽出液中用 Amberlite-400（HCO3- 型）中和酸度，将滤液冷冻干燥即可。 另有一种原苏联的有机溶剂法，它采用大量的有机溶剂（丙酮、乙醇、氯仿等）进行反 复脱水、脱脂、抽提、洗涤鱼精蛋白，其间辅以硫酸钠、氨水、过氧化氢、EDTA 二钠盐等 试剂，再经活性炭脱色，强强性苯乙烯阳离子交换树脂处理，其操作繁琐，成本高昂，虽然 产品质量好但成品得率低。 在最近几年中，鱼精蛋白的提取工艺有了较大的改进与简化，尤其是日本。如在得到鱼精蛋 白盐类的方法中，有将鱼精在稀矿酸液中处理，抽提出鱼精蛋白及混杂蛋白。然后在抽出液 中加入甲醇或乙醇之类的有机溶剂以沉淀上述蛋白，分离子干燥后的固体溶于温水中，再冷 却析出鱼精蛋白盐类。但是在该工艺中，有机溶剂同样也会沉淀杂蛋白，这就势必要进一步 设法除去杂蛋白。尽管在温水中溶解后能析出鱼精蛋白，但同时也一定程度地混入杂蛋白而 影响纯度，这样仍需补充精制步骤。也有在矿酸抽出剂中不用有机溶剂而用聚磷酸盐，使鱼 精蛋白以磷酸盐形式沉淀出来，然后将沉淀溶解在高浓度的硫酸铵中，复分解为精蛋白硫酸
盐。然该法需中途取出沉淀再溶解，影响了操作的流水性。同时，同上法一样，也会有杂蛋 白与鱼精蛋白一起沉淀而影响纯度。为此采用活性炭之类的吸附剂除去杂质，再用有机溶剂 沉淀得到成品，操作繁杂、成本高。 从现有的资料来看，各国对鱼精蛋白的研究，多以鲑科鱼类为对象，前苏联是用大麻哈 鱼和细鳞大马哈鱼的精巢为原料。而我国由于鲑科鱼类的产量较少，因此从 1958 年开始， 上海和青岛等地的水产科学研究部门，曾多次利用黄色精巢与淡水鱼的鲤鱼精巢提取鱼精蛋 白，并获得成功。八十年代和九十年代浙江水产学院食品科学研究所又从鲐鱼和金枪鱼和淡 水鲢鱼精巢中成功地提取了鱼精蛋白。这样就解决了我国生产鱼精蛋白原料不足的问题。 （二）、原料特征 对于提取鱼精蛋白作用的原料要求较高。要新鲜而成熟，一经排过精液的精巢，即不能 利用。 对原料的保藏要采取妥善的方法。根据实验发现用新鲜原料提取鱼精蛋白的收得率要比 冰冻过的原料高。这是因为在冰冻和解冻过程中部分鱼精蛋白流失的结果。性腺的成熟度对 成品率的影响更大。根据前苏联海洋渔业与海洋研究所发表的资料（见下表）中可看到：成 熟度不大的精巢，其成公差异很大：精巢成熟时，其含氮量增加。 精巢蛋白质的成分很不稳定，它随着性腺的成熟变化很大，精巢成熟时，二氨基酸含量增加， 且其含量的增加主要是由于精氨酸的增加。 在鱼精蛋白中没有酷氨酸（对 Millon 反应呈阴性）、色氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和甲 硫氨酸。 （三）、提取工艺 1、鱼精蛋白矿酸盐（以鱼精蛋白硫酸盐为例） 鱼精蛋白通常主要以 DNA-蛋白质的形式 聚集于鱼类精子中，但这种核蛋白的结合链并不牢固，能被硫酸等强酸所解离而释出易溶于 水，不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂的鱼精蛋白硫酸盐，其提取工艺如下： 原料鱼精 → 绞碎 → 过滤 → 醋酸酸化 → 沉淀 → 压滤 → 酒精洗涤沉淀→ 过滤→ 潮固体品 → 硫酸抽提 → 过滤 → 加硅藻土过滤→ 酒精沉淀 → 离心分离→ 粗鱼精蛋 白硫酸盐 → 水溶解 → 过滤 → NaOH 碱化 → 沉淀→ 加温→ 过滤 → 滤液静置→ 油状沉淀 → 硫酸溶解 → 过滤 → 乙醇处理 → 沉淀 → 丙酮、乙醚洗涤 → 真空干燥 → 鱼精蛋白破酸盐成品 → 用注射水溶解 → 配料 →无菌过滤 → 灌封 → 鱼精蛋白硫酸盐 注射液。 上述生产工艺要点： （1）原料处理 将新鲜成熟的鱼精绞碎后，加入一定量水搅拌 1h 后，用尼龙纱布滤除结缔 组织等。再加冰醋酸在乳白色滤液中，使滤液呈酸性，鱼精蛋白沉淀，然后压滤；加入药用 酒精洗涤沉淀物，过滤即得潮固体品。 （2）硫酸提取 将潮固体品加一定量 10%H2SO4 至糊状物的酸浓度达 4%-5%，搅拌 2h， 使鱼精蛋白与核酸分离。过滤去滤渣，再加少量藻土，用纸浆过滤得稍微混浊的鱼精蛋白质 硫酸盐溶液，然后加酒精至溶液中含醇量达 70%-72%，置 0℃下 8-12h，离心得粗制鱼精蛋 白硫酸盐沉淀物。 （3）精制 将上述粗制品加入无热源馏水加热溶解，加少量硅藻土趁热过滤，滤液再在水 浴中加热至 80℃，滴加 1N NaOH 溶液至 pH9.0 左右，0.5h 后趁热过滤，滤液在 0℃下静 置 24h，有油膏状物质沉集底部，倾去上清液，然后再用 3 倍药用酒精，在 0℃下静置 8-12h， 离心所得沉淀，用药用丙酮洗涤 3-4 次，再用乙醚洗 1 次，最后真空干燥，得鱼精蛋白硫酸 盐成品。若再配料（加入氯化钠及苯酚和适量 1N 硫酸）、灌封等加工，则可生产出注射剂。 2、离子交换法 将经过处理的强碱性苯乙烯离子树脂装柱。 鱼精原料 → 洗涤、沥干 → 捣碎 → 加硫酸搅拌 → 离心取上清液 → 上柱分离 → 洗脱 →减压干燥或冷冻干燥 → 鱼精蛋白硫酸盐成品。 3、二段盐析法 浙江水产学院从鱼精蛋白和杂蛋白的性质差异出发，采用溶解性显著差别 的盐析法除去蛋白，所得制品纯度较高，而且得率也高，成本低，生产周期短，此工艺称为 新的二段盐析法。 硫酸鱼精蛋白质粉末，易溶于水，不溶于乙醇或乙醚等有机溶剂。 注射用的质量标准： （1）鱼精蛋白硫酸盐的生理氯化钠注射液，每 ml 内含：
盐。然该法需中途取出沉淀再溶解，影响了操作的流水性。同时，同上法一样，也会有杂蛋 白与鱼精蛋白一起沉淀而影响纯度。为此采用活性炭之类的吸附剂除去杂质，再用有机溶剂 沉淀得到成品，操作繁杂、成本高。 从现有的资料来看，各国对鱼精蛋白的研究，多以鲑科鱼类为对象，前苏联是用大麻哈 鱼和细鳞大马哈鱼的精巢为原料。而我国由于鲑科鱼类的产量较少，因此从 1958 年开始， 上海和青岛等地的水产科学研究部门，曾多次利用黄色精巢与淡水鱼的鲤鱼精巢提取鱼精蛋 白，并获得成功。八十年代和九十年代浙江水产学院食品科学研究所又从鲐鱼和金枪鱼和淡 水鲢鱼精巢中成功地提取了鱼精蛋白。这样就解决了我国生产鱼精蛋白原料不足的问题。 （二）、原料特征 对于提取鱼精蛋白作用的原料要求较高。要新鲜而成熟，一经排过精液的精巢，即不能 利用。 对原料的保藏要采取妥善的方法。根据实验发现用新鲜原料提取鱼精蛋白的收得率要比 冰冻过的原料高。这是因为在冰冻和解冻过程中部分鱼精蛋白流失的结果。性腺的成熟度对 成品率的影响更大。根据前苏联海洋渔业与海洋研究所发表的资料（见下表）中可看到：成 熟度不大的精巢，其成公差异很大：精巢成熟时，其含氮量增加。 精巢蛋白质的成分很不稳定，它随着性腺的成熟变化很大，精巢成熟时，二氨基酸含量增加， 且其含量的增加主要是由于精氨酸的增加。 在鱼精蛋白中没有酷氨酸（对 Millon 反应呈阴性）、色氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和甲 硫氨酸。 （三）、提取工艺 1、鱼精蛋白矿酸盐（以鱼精蛋白硫酸盐为例） 鱼精蛋白通常主要以 DNA-蛋白质的形式 聚集于鱼类精子中，但这种核蛋白的结合链并不牢固，能被硫酸等强酸所解离而释出易溶于 水，不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂的鱼精蛋白硫酸盐，其提取工艺如下： 原料鱼精 → 绞碎 → 过滤 → 醋酸酸化 → 沉淀 → 压滤 → 酒精洗涤沉淀→ 过滤→ 潮固体品 → 硫酸抽提 → 过滤 → 加硅藻土过滤→ 酒精沉淀 → 离心分离→ 粗鱼精蛋 白硫酸盐 → 水溶解 → 过滤 → NaOH 碱化 → 沉淀→ 加温→ 过滤 → 滤液静置→ 油状沉淀 → 硫酸溶解 → 过滤 → 乙醇处理 → 沉淀 → 丙酮、乙醚洗涤 → 真空干燥 → 鱼精蛋白破酸盐成品 → 用注射水溶解 → 配料 →无菌过滤 → 灌封 → 鱼精蛋白硫酸盐 注射液。 上述生产工艺要点： （1）原料处理 将新鲜成熟的鱼精绞碎后，加入一定量水搅拌 1h 后，用尼龙纱布滤除结缔 组织等。再加冰醋酸在乳白色滤液中，使滤液呈酸性，鱼精蛋白沉淀，然后压滤；加入药用 酒精洗涤沉淀物，过滤即得潮固体品。 （2）硫酸提取 将潮固体品加一定量 10%H2SO4 至糊状物的酸浓度达 4%-5%，搅拌 2h， 使鱼精蛋白与核酸分离。过滤去滤渣，再加少量藻土，用纸浆过滤得稍微混浊的鱼精蛋白质 硫酸盐溶液，然后加酒精至溶液中含醇量达 70%-72%，置 0℃下 8-12h，离心得粗制鱼精蛋 白硫酸盐沉淀物。 （3）精制 将上述粗制品加入无热源馏水加热溶解，加少量硅藻土趁热过滤，滤液再在水 浴中加热至 80℃，滴加 1N NaOH 溶液至 pH9.0 左右，0.5h 后趁热过滤，滤液在 0℃下静 置 24h，有油膏状物质沉集底部，倾去上清液，然后再用 3 倍药用酒精，在 0℃下静置 8-12h， 离心所得沉淀，用药用丙酮洗涤 3-4 次，再用乙醚洗 1 次，最后真空干燥，得鱼精蛋白硫酸 盐成品。若再配料（加入氯化钠及苯酚和适量 1N 硫酸）、灌封等加工，则可生产出注射剂。 2、离子交换法 将经过处理的强碱性苯乙烯离子树脂装柱。 鱼精原料 → 洗涤、沥干 → 捣碎 → 加硫酸搅拌 → 离心取上清液 → 上柱分离 → 洗脱 →减压干燥或冷冻干燥 → 鱼精蛋白硫酸盐成品。 3、二段盐析法 浙江水产学院从鱼精蛋白和杂蛋白的性质差异出发，采用溶解性显著差别 的盐析法除去蛋白，所得制品纯度较高，而且得率也高，成本低，生产周期短，此工艺称为 新的二段盐析法。 硫酸鱼精蛋白质粉末，易溶于水，不溶于乙醇或乙醚等有机溶剂。 注射用的质量标准： （1）鱼精蛋白硫酸盐的生理氯化钠注射液，每 ml 内含：
（2）每 mg 鱼精蛋白抵消肝素抗凝作用不得低于 70 肝素； （3）含氮量为 20%-30%； （4）热源试验应符合我国药典之规定； （5）外观应为无色透明液体。 2、游离态鱼精蛋白 可加碱到已提纯的硫酸鱼精蛋白的水溶液中，再加能溶于水的有机溶 剂，使游离鱼精蛋白沉淀，以离心分离后，沉淀物去冻冷冻干燥即得游离态度 复习题： 1、制备 DNA 的原料应该符合哪几个条件？ 2、简述自鱼精中提取 DNA-Na 的生产工艺 3、简述鱼精蛋白的生产工艺？
（2）每 mg 鱼精蛋白抵消肝素抗凝作用不得低于 70 肝素； （3）含氮量为 20%-30%； （4）热源试验应符合我国药典之规定； （5）外观应为无色透明液体。 2、游离态鱼精蛋白 可加碱到已提纯的硫酸鱼精蛋白的水溶液中，再加能溶于水的有机溶 剂，使游离鱼精蛋白沉淀，以离心分离后，沉淀物去冻冷冻干燥即得游离态度 复习题： 1、制备 DNA 的原料应该符合哪几个条件？ 2、简述自鱼精中提取 DNA-Na 的生产工艺 3、简述鱼精蛋白的生产工艺？