一、实验目的要求 1.掌握细菌抹片的制备方法和革兰氏方法。 2.认识细菌革兰氏染色反应特性。 二、实验用品 隔水式恒温培养箱、电冰箱、高压蒸汽灭菌器、天平、接种环、酒精灯、试管、营养琼 脂、95%酒精、草酸铵结晶紫染色液、革兰氏碘溶液、碱性复红液、玻片、纱布、染色缸、 洗瓶、吸水纸、试管架、二甲苯、擦镜纸、香柏油、火柴。 三、实验方法及步骤 1、玻片准备新玻片或用后的玻片，应按附录一中（二）的方法处理后才用。用过很多次， 表面已有许多划痕的玻片应废弃。 手持玻片时，应以拇指、食指或中指夹住载玻片上下两边缘，以免表面粘上手印。载玻 片应清晰透明而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好，用玻璃铅笔容易画上记号。如 有残余油渍，可滴上95%酒精2-3滴，用清洁纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻通过几次。 若仍未能除去油渍，可再滴上12滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻拖过。 2、抹片材料不同，抹片方法有差异。 液体材料如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等，可直接用灭菌接种环取一环材料，于 玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。 固体材料如菌落、脓粒、粪便等，则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于 玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层（不 宜太厚)。 组织脏器材料：先用镊子夹持局部，然后以灭菌或洁净剪刀剪取一小块，夹出后以其新 鲜切面在玻片上压印或涂抹成一薄层。 如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，可以在同一张玻片上，先用蜡笔 在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品。需要保留的标本，应先做好标记，待标 本染色后贴上标签，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等 3、干燥上述涂好的抹片，应让其自然干燥或在酒精灯火焰上拖过以适当加温（以不烫手为 度)，促其干燥。 4、固定固定方法有2种： ().火焰固定将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯火焰上以钟摆的速度 来回通过3-5次，略作加热（但不能太热或烧灼，以手背能忍受为度），进行固定。 (2).化学固定血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨染色(Giemsa stain)时，不用火焰固定而 用甲醇固定。可将己干燥的抹片浸入甲醇中2-3mi,取出沥干：或者在抹片上滴加数滴甲醇， 使其作用2-3min后，自然挥发干燥或沥干：抹片如作瑞氏染色(Wright's stain)),则不必先作 上述固定，因染色液中含有甲醇，可以达到固定的目的。 抹片固定的目的在于： ①使抹片除去水分，很好地贴附在玻片上，以免被水洗时冲掉。 ②使抹片易于着色或更好地着色，因为死菌比活菌着色力强。 7 一、实验目的要求 1．掌握细菌抹片的制备方法和革兰氏方法。 2．认识细菌革兰氏染色反应特性。 二、实验用品 隔水式恒温培养箱、电冰箱、高压蒸汽灭菌器、天平、接种环、酒精灯、试管、营养琼 脂、95%酒精、草酸铵结晶紫染色液、革兰氏碘溶液、碱性复红液、玻片、纱布、染色缸、 洗瓶、吸水纸、试管架、二甲苯、擦镜纸、香柏油、火柴。 三、实验方法及步骤 1、玻片准备 新玻片或用后的玻片，应按附录一中（二）的方法处理后才用。用过很多次， 表面已有许多划痕的玻片应废弃。 手持玻片时，应以拇指、食指或中指夹住载玻片上下两边缘，以免表面粘上手印。载玻 片应清晰透明而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好，用玻璃铅笔容易画上记号。如 有残余油渍，可滴上 95%酒精 2-3 滴，用清洁纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻通过几次。 若仍未能除去油渍，可再滴上 1-2 滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻拖过。 2、抹片 材料不同，抹片方法有差异。 液体材料如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等，可直接用灭菌接种环取一环材料，于 玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。 固体材料如菌落、脓粒、粪便等，则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于 玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层（不 宜太厚）。 组织脏器材料：先用镊子夹持局部，然后以灭菌或洁净剪刀剪取一小块，夹出后以其新 鲜切面在玻片上压印或涂抹成一薄层。 如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，可以在同一张玻片上，先用蜡笔 在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品。需要保留的标本，应先做好标记，待标 本染色后贴上标签，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。 3、干燥 上述涂好的抹片，应让其自然干燥或在酒精灯火焰上拖过以适当加温（以不烫手为 度），促其干燥。 4、固定 固定方法有 2 种： ⑴.火焰固定 将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯火焰上以钟摆的速度 来回通过 3-5 次，略作加热（但不能太热或烧灼，以手背能忍受为度），进行固定。 ⑵.化学固定 血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨染色(Giemsa stain)时，不用火焰固定而 用甲醇固定。可将已干燥的抹片浸入甲醇中 2-3 min，取出沥干；或者在抹片上滴加数滴甲醇， 使其作用 2-3 min 后，自然挥发干燥或沥干；抹片如作瑞氏染色（Wright’s stain)，则不必先作 上述固定，因染色液中含有甲醇，可以达到固定的目的。 抹片固定的目的在于： ①使抹片除去水分，很好地贴附在玻片上，以免被水洗时冲掉。 ②使抹片易于着色或更好地着色，因为死菌比活菌着色力强