实验须知 在微生物学实验过程中，可能接触病原微生物，有些病原微生物可引起人兽共患传染病， 如炭疽、布氏杆菌病、结核、狂犬病等。学生在操作过程中稍有疏忽，就有可能引起疫病流 行，甚至感染人身，危及生命。因此，既要求工作谨慎，严防实验室感染，防止事故，确保 安全，又要求严格训练。为此，在实验时必须遵守下列规定。 1。防止病原微生物的散宿 ()在实验时必须穿工作服，当接触或操作危险材料时，须穿戴胶靴、围裙、手套及眼镜，用 后应立即消毒清洗后，方可再用。在操作时，一定严肃认真，勿以手指或其他器物等接触口 唇、眼、鼻和面部，手和面部有伤口时，应避免危险材料的接触。 (②)使用危险材料应行无菌操作，盛危险材料的器皿要牢固，以免操作过程破裂，以防液体流 出，造成污染。用过的尸体、内脏、血液以及废弃的培养基、生物制品等，须严加消毒或深 埋。用过的棉球、纱布等污物，放在固定容器中，统一处理，不得随意抛弃。万一危险材料 滴出或打翻，或发生其他意外，应立即报告指导老师及时处理。如手指或皮肤受污染，立即 将手浸入消毒液中15min,然后用清水洗干净。沾有微生物的器皿应先消毒再进行洗涤。 (3)接种环、接种针用前用后必须于火焰中烧的灭菌。 (4)含有培养物的试管不可平放在桌面上，以防止液体流出。 (⑤)实验室内禁止饮食、吸烟及用嘴湿润铅笔及标签等物。 (6)操作危险材料时勿谈话或思考其他问题，以免分散注意力而发生意外 (7)菌种或种毒不得带出实验室，若要索取，应严格按规章办理。 (⑧)实验完毕，将操作台面用消毒液消毒，自身的手也须消毒和洗刷干净后方得离开实验室。 2.防火 切易燃品应远离火源。不可将酒精灯倾向另一酒精灯引火，以免发生爆炸。电炉、电热板、 煤油炉、煤气等用完后应立即关灭。如漏电、漏气等应立即修理，实验室内应有灭火器。 3.节约 (1)使用药品、试剂、染色剂、镜油、拭镜纸等应节约。 (②)使用仪器等要小心，按操作规程工作、保养，避免不必要的损耗和意外。 (3)吸管插入试管中时，要轻放到底才松手，以免娥破试管。 (④)平皿一般应倒放，即皿底在上，皿盖在下，以免拿时皿底掉下摔破。 (⑤)金属器皿用完消毒后，应立即擦干，防止生锈。 4.标记 所用各种试剂、染色剂、培养物、动物等，均需标记明确。要经高压消毒或蒸汽消毒的标签 应用深黑色铅笔书写，不可用毛笔、钢笔、圆珠笔书写，以免消毒后模糊不清。 5.记录 实验前应对本次实验目的、有关内容和操作技术进行预习：实验时在老师指导下进行，并遵 守实验程序，均不可潦草应付或不动手：实验时应作好记录，特别是实验内容、方法及结果 应详细记录，认真做好作业。 6.安全 最后一人离开实验室前，应检查一遍水、电、煤气，关好门窗。 7.清洁与秩序
1 实验须知 在微生物学实验过程中，可能接触病原微生物，有些病原微生物可引起人兽共患传染病， 如炭疽、布氏杆菌病、结核、狂犬病等。学生在操作过程中稍有疏忽，就有可能引起疫病流 行，甚至感染人身，危及生命。因此，既要求工作谨慎，严防实验室感染，防止事故，确保 安全，又要求严格训练。为此，在实验时必须遵守下列规定。 1．防止病原微生物的散布 (1)在实验时必须穿工作服，当接触或操作危险材料时，须穿戴胶靴、围裙、手套及眼镜，用 后应立即消毒清洗后，方可再用。在操作时，一定严肃认真，勿以手指或其他器物等接触口 唇、眼、鼻和面部，手和面部有伤口时，应避免危险材料的接触。 (2)使用危险材料应行无菌操作，盛危险材料的器皿要牢固，以免操作过程破裂，以防液体流 出，造成污染。用过的尸体、内脏、血液以及废弃的培养基、生物制品等，须严加消毒或深 埋。用过的棉球、纱布等污物，放在固定容器中，统一处理，不得随意抛弃。万一危险材料 滴出或打翻，或发生其他意外，应立即报告指导老师及时处理。如手指或皮肤受污染，立即 将手浸入消毒液中 1 5min，然后用清水洗干净。沾有微生物的器皿应先消毒再进行洗涤。 (3)接种环、接种针用前用后必须于火焰中烧灼灭菌。 (4)含有培养物的试管不可平放在桌面上，以防止液体流出。 (5)实验室内禁止饮食、吸烟及用嘴湿润铅笔及标签等物。 (6)操作危险材料时勿谈话或思考其他问题，以免分散注意力而发生意外。 (7)菌种或种毒不得带出实验室，若要索取，应严格按规章办理。 (8)实验完毕，将操作台面用消毒液消毒，自身的手也须消毒和洗刷干净后方得离开实验室。 2．防火 一切易燃品应远离火源。不可将酒精灯倾向另一酒精灯引火，以免发生爆炸。电炉、电热板、 煤油炉、煤气等用完后应立即关灭。如漏电、漏气等应立即修理，实验室内应有灭火器。 3．节约 (1)使用药品、试剂、染色剂、镜油、拭镜纸等应节约。 (2)使用仪器等要小心，按操作规程工作、保养，避免不必要的损耗和意外。 (3)吸管插入试管中时，要轻放到底才松手，以免戮破试管。 (4)平皿一般应倒放，即皿底在上，皿盖在下，以免拿时皿底掉下摔破。 (5)金属器皿用完消毒后，应立即擦干，防止生锈。 4．标记 所用各种试剂、染色剂、培养物、动物等，均需标记明确。要经高压消毒或蒸汽消毒的标签， 应用深黑色铅笔书写，不可用毛笔、钢笔、圆珠笔书写，以免消毒后模糊不清。 5．记录 实验前应对本次实验目的、有关内容和操作技术进行预习；实验时在老师指导下进行，并遵 守实验程序，均不可潦草应付或不动手；实验时应作好记录，特别是实验内容、方法及结果 应详细记录，认真做好作业。 6．安全 最后一人离开实验室前，应检查一遍水、电、煤气，关好门窗。 7．清洁与秩序
实验室中各物均应摆放一定位置，工作完后放回原处或指定地点，对实验室进行整理，清洁 后离开。 说明 一、适用专业：动物医学 二、目的和任务 1、通过实验，使学生逐步掌握《兽医微生物学》实验的基本操作方法，将理论知识同 生产实际紧密地结合起来。 2、通过实验，逐步提高学生的观察、分析、独立思考和独立解决问题的能力。并初步 学会分析和解决畜牧业中有关微生物学方面的基本问题。为动物传染病的诊断打下一定的 基础。 3、在实验过程中，逐步培养学生在科学研究中的严肃的态度、严格的要求、严密的方 法和严谨的作风。 三、主要教学内容和基本要求 1、主要内容： 本课程的主要实验内容有：细菌基本形态的观察、细菌抹片的制备及染色、细菌的分 离培养及培养特性的观察、细菌的生化试验、细菌的药物敏感试验、凝集试验与沉淀试验应、 血凝及血凝抑制试验及鸡胚接种等。 2、基本要求： (1)每次实验前负责实验课的老师及技术人员必须认真准备实验。 (2)学生在实验前必须预习实验指导，复习与本次实验有关的理论知识。 (3)在实验中，教师应认真负责地指导学生，并严格要求学生遵守实验室规则及操作 规范，认真、细致、大胆地完成实验任务。 (4)实验课后，学生的实验用品及用过的材料，按要求清洁整理安放，课后认真整理 实验结果，及时交实验报告，教师应认真及时的进行批改。 四、实验课程内容和学时分配 用实验项目名称 实验内容 时实验实验 每组 实验 已开/ 分 类别类型 人数 要求 未开 1显微镜油镜的 1、显微镜油镜的使用 2 基础验证 必做 己开 使用及细菌形 与保护 举 态的风容 2、细菌基本形态的而 2细菌抹片的制 1、细菌抹片的制备 基础验证 必做 己开 器及简单染色 2、美蓝染色法 类 法 3细特片的 1、细菌抹片的制各 基础 验证 必做 已开 备及革兰氏染 2、革兰氏染色法 类 类 色法 4细菌的分离培 1、细菌的分离培养 基础综合1 必做已开
2 实验室中各物均应摆放一定位置，工作完后放回原处或指定地点，对实验室进行整理，清洁 后离开。 说 明 一、适用专业：动物医学 二、目的和任务 1、通过实验，使学生逐步掌握《兽医微生物学》实验的基本操作方法，将理论知识同 生产实际紧密地结合起来。 2、通过实验，逐步提高学生的观察、分析、独立思考和独立解决问题的能力。并初步 学会分析和解决畜牧业中有关微生物学方面的基本问题。为动物传染病的诊断打下一定的 基础。 3、在实验过程中，逐步培养学生在科学研究中的严肃的态度、严格的要求、严密的方 法和严谨的作风。 三、主要教学内容和基本要求 1、主要内容： 本课程的主要实验内容有：细菌基本形态的观察、细菌抹片的制备及染色、细菌的分 离培养及培养特性的观察、细菌的生化试验、细菌的药物敏感试验、凝集试验与沉淀试验应、 血凝及血凝抑制试验及鸡胚接种等。 2、基本要求： （1）每次实验前负责实验课的老师及技术人员必须认真准备实验。 （2）学生在实验前必须预习实验指导，复习与本次实验有关的理论知识。 （3）在实验中，教师应认真负责地指导学生，并严格要求学生遵守实验室规则及操作 规范，认真、细致、大胆地完成实验任务。 （4）实验课后，学生的实验用品及用过的材料，按要求清洁整理安放，课后认真整理 实验结果，及时交实验报告，教师应认真及时的进行批改。 四、实验课程内容和学时分配 序 号 实验项目名称 实验内容 学时 分配 实验 类别 实验 类型 每组 人数 实验 要求 已开/ 未开 1 显微镜油镜的 使用及细菌形 态的观察 1、显微镜油镜 的使 用 与保护 2、细菌基本形态的观 察 2 基础 类 验证 类 1 必做 已开 2 细菌抹片的制 备及简单染色 法 1、细菌抹片的制备 2、美蓝染色法 2 基础 类 验证 类 1 必做 已开 3 细菌抹片的制 备及革兰氏染 色法 1、细菌抹片的制备 2、革兰氏染色法 2 基础 类 验证 类 1 必做 已开 4 细菌的分离培 1、细菌的分离培养 2 基础 综合 1 必做 已开
养及培养性 类 类 细菌的生化 1,糖（醇 发酵试 基 细的药物场 设计 人做 已开 感试验的设计 白平板凝试验 证 已开 基耐 沉淀试验 证 己开 琼脂扩散试验 血凝及血凝邦 血凝试 必 已开 制试验 2 血凝抑制试验 类 鸡胚接利 公现 己开 五、实验教科书、参考书 ()教科书 姚火春.兽医微生物学实验指导.北京：中国农业出版社，2002 口参考书 沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验.北京：高等教育出版社，1999 实验一显微镜油镜的使用及细菌形态的观察 一、实验目的要求 1,正确掌握显微镜油镜的使用方法。 2.认识细菌的基本形态并绘图。 二、实验用品 生物显微镜、二甲苯、擦镜纸、香柏油、细菌标本片。 二、实验方法及步骤 (、油镜的使用 1、油镜的识别油浸物镜简称油镜，是接物镜中放大倍数最高的镜头。除病毒外，观察 细菌等微生物均要用普通生物显微镜的油镜。外形上油镜头最长，镜头的品片和透光口径最 小，一般在镜头下缘刻有一圈红线或黑线，注有100×或90×、油或O1字样
3 养及培养性状 的观察 2、细菌培养性状的观 察 类 类 5 细菌的生化试 验 1、糖（醇）发酵试验 2、吲哚形成试验 3、甲基红试验 4、维培试验 2 基础 类 综合 类 1 必做 已开 6 细菌的药物敏 感试验的设计 园纸片扩散试验 2 专业 基础 类 设计 类 1 必做 已开 7 凝集试验 鸡白痢平板凝集试验 2 专业 基础 类 验证 类 1 必做 已开 8 沉淀试验 1、炭疽环状沉淀反应 2、琼脂扩散试验 2 基础 类 验证 类 1 必做 已开 9 血凝及血凝抑 制试验 1、血凝试验 2、血凝抑制试验 2 专业 基础 类 验证 类 1 必做 已开 1 0 鸡胚接种 1、绒毛尿囊膜接种 2、绒毛尿囊腔接种 2 专业 基础 类 验证 类 1 必做 已开 五、实验教科书、参考书 ㈠教科书 姚火春.兽医微生物学实验指导.北京：中国农业出版社，2002 ㈡参考书 沈 萍，范秀容，李广武.微生物学实验.北京：高等教育出版社，1999 实验一 显微镜油镜的使用及细菌形态的观察 一、实验目的要求 1．正确掌握显微镜油镜的使用方法。 2．认识细菌的基本形态并绘图。 二、实验用品 生物显微镜、二甲苯、擦镜纸、香柏油、细菌标本片。 二、实验方法及步骤 ㈠、油镜的使用 1、油镜的识别 油浸物镜简称油镜，是接物镜中放大倍数最高的镜头。除病毒外，观察 细菌等微生物均要用普通生物显微镜的油镜。外形上油镜头最长，镜头的晶片和透光口径最 小，一般在镜头下缘刻有一圈红线或黑线，注有 100 ×或 90×、油或 Oil 字样
2、油镜的使用方法 ().调节光源用油镜检查细菌等染色标本时，光线宜强。为了获得最亮的光线须注意3 个要点：光圈开至最大：聚光器升至最高：反光镜用凹面。检查不染色的活菌标本时，宜用 较弱光线，此时可将集光器稍稍降低或将光圈缩小。 (②)将标本片放在载物台上，用弹簧夹固定，用移动器将标本调至光斑中间，先用低倍镜 找到染色的视野，然后换用高倍镜或油镜。使用油镜时，先加香柏油一滴于标本上，从侧面 看者油镜头，小心地转动粗螺旋，使油镜下降，先与油滴接触，再继续下降到几乎与载玻片 接触。然后从目镜观察，一面徐徐向上转动粗螺旋直到视野中出现模糊的物象，再转动微动 螺旋校准焦距至物象清晰为止。如果镜头己离开油面，仍未见到物象时，则可重复按照上述 步骤操作直到看清为止。必须注意油镜头己接触油滴后调焦距时只能让粗螺旋向反时 针转动提升镜头，绝对不能向顺时针转动下降镜头，否则有压碎标本片和损坏透镜的危险。 有的显微镜是净桶和油镜固定，转动载物台下面的粗螺旋，上升载物台，使标本表面的香柏 油与油镜头接触，然后转动微动螺旋，徐徐下降载物台，调准焦距进行观察的。 表实1H实验室几种常用物质的折光指数 名 折光指数 32 香油 香柏 树 151 9 液体石蜡油 1.33 使用油镜时之所以要加一滴香柏油，是由于油镜头的晶片极小，当镜头与标本片之间被 空气层所隔时，因空气的折光指数与玻璃不同，自标本透过的光线往往在空气中折光而不易 射入镜头内，使视野黑暗、物象不清。载玻片标本上滴一滴与玻璃的折光指数相近的油类 香柏油等（表实11），可避免透过的光线损失（图实11），进入油镜头的光量增多，视野亮 度增大，菌体观察才清晰。 (3).油镜观察完毕， 应提高镜 筒或降低载物台，取出标 0 本片，用拭 镜纸盖在标本的油滴上 气折光 并轻轻拖 过，以抹去标本上的大部 分油渍，利 于标本的保存和再次使 用。油镜头 上的香柏油先用拭镜纸 搽拭，再用 蘸有少量二甲苯的拭镜 纸搽拭，最 光钱 后再用拭镜纸将二甲苯 拭干，以免 图实1】油镜的使用源理 图实12香柏油壶
4 2、油镜的使用方法 ⑴.调节光源 用油镜检查细菌等染色标本时，光线宜强。为了获得最亮的光线须注意 3 个要点：光圈开至最大；聚光器升至最高；反光镜用凹面。检查不染色的活菌标本时，宜用 较弱光线，此时可将集光器稍稍降低或将光圈缩小。 ⑵.将标本片放在载物台上，用弹簧夹固定，用移动器将标本调至光斑中间，先用低倍镜 找到染色的视野，然后换用高倍镜或油镜。使用油镜时，先加香柏油一滴于标本上，从侧面 看着油镜头，小心地转动粗螺旋，使油镜下降，先与油滴接触，再继续下降到几乎与载玻片 接触。然后从目镜观察，一面徐徐向上转动粗螺旋直到视野中出现模糊的物象，再转动微动 螺旋校准焦距至物象清晰为止。如果镜头已离开油面，仍未见到物象时，则可重复按照上述 步骤操作直到看清为止。必须注意油镜头已接触油滴后调焦距时只能让粗螺旋向反时 针转动提升镜头，绝对不能向顺时针转动下降镜头，否则有压碎标本片和损坏透镜的危险。 有的显微镜是净桶和油镜固定，转动载物台下面的粗螺旋，上升载物台，使标本表面的香柏 油与油镜头接触，然后转动微动螺旋，徐徐下降载物台，调准焦距进行观察的。 使用油镜时之所以要加一滴香柏油，是由于油镜头的晶片极小，当镜头与标本片之间被 空气层所隔时，因空气的折光指数与玻璃不同，自标本透过的光线往往在空气中折光而不易 射入镜头内，使视野黑暗、物象不清。载玻片标本上滴一滴与玻璃的折光指数相近的油类— 香柏油等（表实 1-1），可避免透过的光线损失（图实 1-1），进入油镜头的光量增多，视野亮 度增大，菌体观察才清晰。 ⑶．油镜观察完毕， 应提高镜 筒或降低载物台，取出标 本片，用拭 镜纸盖在标本的油滴上 并轻轻拖 过，以抹去标本上的大部 分油渍，利 于标本的保存和再次使 用。油镜头 上的香柏油先用拭镜纸 搽拭，再用 蘸有少量二甲苯的拭镜 纸搽拭，最 后再用拭镜纸将二甲苯 拭干，以免
二甲苯溶化品片周围的粘胶，使品片脱落。如油滴已浓稠或干结，则可先用拭镜纸蘸少量二 甲苯，溶解并抹去镜头上的油渍，再用拭镜纸抹去残存的二甲苯。 (④)。显微镜用毕，将反光镜竖放，下降集光器，转动转换器，将低倍物镜对准载物台中 央圆孔或摆成八字形，下降镜筒，再将各部件抹干净，放入镜箱或罩上镜罩。 3、显微镜的维护 1.移动显微镜时要轻缓，勿使震动，搬动时右手把持镜臂，左手托住镜座。 2.显微镜应避免直接在阳光下曝晒，以免高温使粘胶溶解或变形，引起透镜脱落或破裂。 3.勿使显微镜与挥发性药品及腐蚀性酸碱类物品放在一起。 4.显微镜不能随便拆卸。各镜面避免用手沾抹，以防印上手印和长霉。 5.显微镜应放在干燥的地方，雨水多的季节应在镜箱内存放硅胶，以吸收水分。如长时 间不用，物镜和目镜应卸下放在干燥器中，以免受潮长霉。 白、细菌基本形态的观察 细菌基本形态在油镜下观察葡萄球菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、猪丹毒杆菌、 乳酸杆菌、芽孢杆菌、放线菌等细菌标本片。注意细菌的基本形态、排列、颜色以及各种细 菌的相对大小。 四、作业 1如何正确使用油镜？ 2绘出葡萄球菌的形态 实验二细菌抹片制备及简单染色法 一、实验目的要求 1.掌握细菌抹片的制备方法， 2.掌握细美蓝染色方法。 二、实验用品 隔水式恒温培养箱、电冰箱、高压蒸汽灭菌器、生物显微镜、天平、接种环、酒精灯」 试管、营养琼脂、95%酒精、美蓝染色液、玻片、纱布、染色缸、洗瓶、吸水纸、试管架 二甲苯、擦镜纸、香柏油、火柴。 三、实验方法及步骤 、细菌抹片的制备 进行细菌染色之前，须先制好细菌抹片，其方法如下： 1、玻片准备新玻片或用后的玻片，应按附录一中（二）的方法处理后才用。用过很多 次，表面己有许多划痕的玻片应废弃。 手持玻片时，应以拇指、食指或中指夹住载玻片上下两边缘，以免表面粘上手印。载玻
5 二甲苯溶化晶片周围的粘胶，使晶片脱落。如油滴已浓稠或干结，则可先用拭镜纸蘸少量二 甲苯，溶解并抹去镜头上的油渍，再用拭镜纸抹去残存的二甲苯。 ⑷．显微镜用毕，将反光镜竖放，下降集光器，转动转换器，将低倍物镜对准载物台中 央圆孔或摆成八字形，下降镜筒，再将各部件抹干净，放入镜箱或罩上镜罩。 3、显微镜的维护 1．移动显微镜时要轻缓，勿使震动，搬动时右手把持镜臂，左手托住镜座。 2．显微镜应避免直接在阳光下曝晒，以免高温使粘胶溶解或变形，引起透镜脱落或破裂。 3．勿使显微镜与挥发性药品及腐蚀性酸碱类物品放在一起。 4．显微镜不能随便拆卸。各镜面避免用手沾抹，以防印上手印和长霉。 5．显微镜应放在干燥的地方，雨水多的季节应在镜箱内存放硅胶，以吸收水分。如长时 间不用，物镜和目镜应卸下放在干燥器中，以免受潮长霉。 ㈡、细菌基本形态的观察 细菌基本形态 在油镜下观察葡萄球菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、猪丹毒杆菌、 乳酸杆菌、芽孢杆菌、放线菌等细菌标本片。注意细菌的基本形态、排列、颜色以及各种细 菌的相对大小。 四、作 业 1.如何正确使用油镜? 2.绘出葡萄球菌的形态. 实验二 细菌抹片制备及简单染色法 一、实验目的要求 1．掌握细菌抹片的制备方法。 2．掌握细美蓝染色方法。 二、实验用品 隔水式恒温培养箱、电冰箱、高压蒸汽灭菌器、生物显微镜、天平、接种环、酒精灯、 试管、营养琼脂、95%酒精、美蓝染色液、玻片、纱布、染色缸、洗瓶、吸水纸、试管架、 二甲苯、擦镜纸、香柏油、火柴。 三、实验方法及步骤 ㈠、细菌抹片的制备 进行细菌染色之前，须先制好细菌抹片，其方法如下： 1、玻片准备 新玻片或用后的玻片，应按附录一中（二）的方法处理后才用。用过很多 次，表面已有许多划痕的玻片应废弃。 手持玻片时，应以拇指、食指或中指夹住载玻片上下两边缘，以免表面粘上手印。载玻
片应清晰透明而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好，用玻璃铅笔容易画上记号。如 有残余油渍，可滴上95%酒精2-3滴，用清洁纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻通过几次。 若仍未能除去油渍，可再滴上1-2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻拖过。 2、抹片材料不同，抹片方法有差异。 液体材料如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等，可直接用灭菌接种环取一环材料，于 玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。 固体材料如菌落、脓粒、粪便等，则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于 玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层（不 宜太厚)。 组织脏器材料：先用镊子夹持局部，然后以灭菌或洁净剪刀剪取一小块，夹出后以其新 鲜切面在玻片上压印或涂抹成一薄层。 如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，可以在同一张玻片上，先用蜡笔 在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品。需要保留的标本，应先做好标记，待标 本染色后贴上标签，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。 3、干燥上述涂好的抹片，应让其自然干燥或在酒精灯火焰上拖过以适当加温（以不烫 手为度)，促其干燥。 4、固定固定方法有2种： ()火焰固定将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯火焰上以钟摆的速度 来回通过35次，略作加热（但不能太热或烧灼，以手背能忍受为度），进行固定。 (2).化学固定血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨染色(Giemsa stain)时，不用火焰固定而 用甲醇固定。可将已干燥的抹片浸入甲醇中2-3m,取出沥干：或者在抹片上滴加数滴甲醇， 使其作用2-3min后，自然挥发干燥或沥干：抹片如作瑞氏染色(Wright's stain),则不必先作 上述固定，因染色液中含有甲醇，可以达到固定的目的。 抹片固定的目的在于： ①使抹片除去水分，很好地贴附在玻片上，以免被水洗时冲掉。 ②使抹片易于着色或更好地着色，因为死菌比活菌着色力强。 ③可能杀死抹片中的微生物 必须注意：在抹片固定过程中，实际上并不保证能杀死全部细菌，也不能完全避免在染 色水洗时会将部分材料冲脱，因此，在制备烈性病原菌，特别是带芽孢的病原菌的染色抹) 时，应亚格填重处理染色用过的残液和抹片本身，以免引起病原的散播。固定好的抹片，即 可进行各种方法的染色。 白、简单染色法只用一种染料进行染色的方法，如美蓝染色法。 美蓝染色法：在己干燥、固定好的抹片上，滴加适量的（足够覆盖抹片点即可）美蓝染 色液，经1-2mi,水洗，沥去多余的水分，用滤纸吸千或火焰上来回烘干（不能太热），镜 检。 四、作业 试述抹片固定的目的。 实验三细菌的革兰氏染色法
6 片应清晰透明而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好，用玻璃铅笔容易画上记号。如 有残余油渍，可滴上 95%酒精 2-3 滴，用清洁纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻通过几次。 若仍未能除去油渍，可再滴上 1-2 滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻拖过。 2、抹片 材料不同，抹片方法有差异。 液体材料如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等，可直接用灭菌接种环取一环材料，于 玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。 固体材料如菌落、脓粒、粪便等，则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于 玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层（不 宜太厚）。 组织脏器材料：先用镊子夹持局部，然后以灭菌或洁净剪刀剪取一小块，夹出后以其新 鲜切面在玻片上压印或涂抹成一薄层。 如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，可以在同一张玻片上，先用蜡笔 在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品。需要保留的标本，应先做好标记，待标 本染色后贴上标签，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。 3、干燥 上述涂好的抹片，应让其自然干燥或在酒精灯火焰上拖过以适当加温（以不烫 手为度），促其干燥。 4、固定 固定方法有 2 种： ⑴.火焰固定 将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯火焰上以钟摆的速度 来回通过 3-5 次，略作加热（但不能太热或烧灼，以手背能忍受为度），进行固定。 ⑵.化学固定 血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨染色(Giemsa stain)时，不用火焰固定而 用甲醇固定。可将已干燥的抹片浸入甲醇中 2-3 min，取出沥干；或者在抹片上滴加数滴甲醇， 使其作用 2-3 min 后，自然挥发干燥或沥干；抹片如作瑞氏染色（Wright’s stain)，则不必先作 上述固定，因染色液中含有甲醇，可以达到固定的目的。 抹片固定的目的在于： ①使抹片除去水分，很好地贴附在玻片上，以免被水洗时冲掉。 ②使抹片易于着色或更好地着色，因为死菌比活菌着色力强。 ③可能杀死抹片中的微生物。 必须注意：在抹片固定过程中，实际上并不保证能杀死全部细菌，也不能完全避免在染 色水洗时会将部分材料冲脱，因此，在制备烈性病原菌，特别是带芽孢的病原菌的染色抹片 时，应严格慎重处理染色用过的残液和抹片本身，以免引起病原的散播。固定好的抹片，即 可进行各种方法的染色。 ㈡、简单染色法 只用一种染料进行染色的方法，如美蓝染色法。 美蓝染色法：在已干燥、固定好的抹片上，滴加适量的（足够覆盖抹片点即可）美蓝染 色液，经 1-2 min，水洗，沥去多余的水分，用滤纸吸干或火焰上来回烘干（不能太热），镜 检。 四、作业 试述抹片固定的目的。 实验三 细菌的革兰氏染色法
一、实验目的要求 1.掌握细菌抹片的制备方法和革兰氏方法。 2.认识细菌革兰氏染色反应特性。 二、实验用品 隔水式恒温培养箱、电冰箱、高压蒸汽灭菌器、天平、接种环、酒精灯、试管、营养琼 脂、95%酒精、草酸铵结晶紫染色液、革兰氏碘溶液、碱性复红液、玻片、纱布、染色缸、 洗瓶、吸水纸、试管架、二甲苯、擦镜纸、香柏油、火柴。 三、实验方法及步骤 1、玻片准备新玻片或用后的玻片，应按附录一中（二）的方法处理后才用。用过很多次， 表面已有许多划痕的玻片应废弃。 手持玻片时，应以拇指、食指或中指夹住载玻片上下两边缘，以免表面粘上手印。载玻 片应清晰透明而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好，用玻璃铅笔容易画上记号。如 有残余油渍，可滴上95%酒精2-3滴，用清洁纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻通过几次。 若仍未能除去油渍，可再滴上12滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻拖过。 2、抹片材料不同，抹片方法有差异。 液体材料如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等，可直接用灭菌接种环取一环材料，于 玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。 固体材料如菌落、脓粒、粪便等，则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于 玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层（不 宜太厚)。 组织脏器材料：先用镊子夹持局部，然后以灭菌或洁净剪刀剪取一小块，夹出后以其新 鲜切面在玻片上压印或涂抹成一薄层。 如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，可以在同一张玻片上，先用蜡笔 在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品。需要保留的标本，应先做好标记，待标 本染色后贴上标签，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等 3、干燥上述涂好的抹片，应让其自然干燥或在酒精灯火焰上拖过以适当加温（以不烫手为 度)，促其干燥。 4、固定固定方法有2种： ().火焰固定将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯火焰上以钟摆的速度 来回通过3-5次，略作加热（但不能太热或烧灼，以手背能忍受为度），进行固定。 (2).化学固定血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨染色(Giemsa stain)时，不用火焰固定而 用甲醇固定。可将己干燥的抹片浸入甲醇中2-3mi,取出沥干：或者在抹片上滴加数滴甲醇， 使其作用2-3min后，自然挥发干燥或沥干：抹片如作瑞氏染色(Wright's stain)),则不必先作 上述固定，因染色液中含有甲醇，可以达到固定的目的。 抹片固定的目的在于： ①使抹片除去水分，很好地贴附在玻片上，以免被水洗时冲掉。 ②使抹片易于着色或更好地着色，因为死菌比活菌着色力强
7 一、实验目的要求 1．掌握细菌抹片的制备方法和革兰氏方法。 2．认识细菌革兰氏染色反应特性。 二、实验用品 隔水式恒温培养箱、电冰箱、高压蒸汽灭菌器、天平、接种环、酒精灯、试管、营养琼 脂、95%酒精、草酸铵结晶紫染色液、革兰氏碘溶液、碱性复红液、玻片、纱布、染色缸、 洗瓶、吸水纸、试管架、二甲苯、擦镜纸、香柏油、火柴。 三、实验方法及步骤 1、玻片准备 新玻片或用后的玻片，应按附录一中（二）的方法处理后才用。用过很多次， 表面已有许多划痕的玻片应废弃。 手持玻片时，应以拇指、食指或中指夹住载玻片上下两边缘，以免表面粘上手印。载玻 片应清晰透明而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好，用玻璃铅笔容易画上记号。如 有残余油渍，可滴上 95%酒精 2-3 滴，用清洁纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻通过几次。 若仍未能除去油渍，可再滴上 1-2 滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻拖过。 2、抹片 材料不同，抹片方法有差异。 液体材料如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等，可直接用灭菌接种环取一环材料，于 玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。 固体材料如菌落、脓粒、粪便等，则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于 玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层（不 宜太厚）。 组织脏器材料：先用镊子夹持局部，然后以灭菌或洁净剪刀剪取一小块，夹出后以其新 鲜切面在玻片上压印或涂抹成一薄层。 如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，可以在同一张玻片上，先用蜡笔 在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品。需要保留的标本，应先做好标记，待标 本染色后贴上标签，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。 3、干燥 上述涂好的抹片，应让其自然干燥或在酒精灯火焰上拖过以适当加温（以不烫手为 度），促其干燥。 4、固定 固定方法有 2 种： ⑴.火焰固定 将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯火焰上以钟摆的速度 来回通过 3-5 次，略作加热（但不能太热或烧灼，以手背能忍受为度），进行固定。 ⑵.化学固定 血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨染色(Giemsa stain)时，不用火焰固定而 用甲醇固定。可将已干燥的抹片浸入甲醇中 2-3 min，取出沥干；或者在抹片上滴加数滴甲醇， 使其作用 2-3 min 后，自然挥发干燥或沥干；抹片如作瑞氏染色（Wright’s stain)，则不必先作 上述固定，因染色液中含有甲醇，可以达到固定的目的。 抹片固定的目的在于： ①使抹片除去水分，很好地贴附在玻片上，以免被水洗时冲掉。 ②使抹片易于着色或更好地着色，因为死菌比活菌着色力强
③可能杀死抹片中的微生物。 必须注意：在抹片固定过程中，实际上并不保证能杀死全部细菌，也不能完全避免在染 色水洗时会将部分材料冲脱，因此，在制备烈性病原菌，特别是带芽孢的病原菌的染色抹片 时，应严格慎重处理染色用过的残液和抹片本身，以免引起病原的散播。固定好的抹片，即 可进行各种方法的染色。 白、染色革兰(Gram)氏染色法 (1)在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经1-2mn,水洗。这时细菌 都染成紫色。 (2)加革兰氏碘溶液于抹片上助染，作用1-3m,水洗。这时细菌都呈更深的紫色。 (3)加95%酒精于抹片上脱色，约30s至1min,水洗。这时有的细菌紫色被脱去，呈无色： 有的紫色脱不了，仍保持紫色。 (4)加碱性复红液复染10-30s,水洗。这时己脱色的细菌复染成红色，未脱色的细菌呈蓝 紫色。 (⑤)吸干或烘干，镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色 四、作业 试述革兰氏染色的关键步骤。 实验三细菌的分离培养及培养性状观察 一、实验目的要求 1.掌握需氧菌分离培养的基本要领。 2.了解厌氧菌的分离培养原则及常用的几种分离培养法。 3.了解细菌在固体和液体培养基中的生长表现。 二、实验用品 隔水式恒温培养箱、电冰箱、高压蒸汽灭菌器、天平、接种环、酒精灯、试管、营养琼 脂、平皿、精密pH试纸、试管架、火柴。 三、实验方法及步骤 细菌分离培养和移植的一般原则 分离培养是细菌学检验的基本技术之一。分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污 染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。细菌分离培养的步骤：先从被检材料或病料中分离培养 单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。进行细菌分离培养和移 植应注意下列事项： 1.选择适当培养基和培养条件。分离培养前应充分考虑所分离的细菌的特性，选择适合 其生长的培养基以及所需的气体与培养温度（病原南菌一般为37℃）等。 2.严格无菌操作、防止污染。培养基和一切用具必须彻底灭菌：操作时必须靠近火焰
8 ③可能杀死抹片中的微生物。 必须注意：在抹片固定过程中，实际上并不保证能杀死全部细菌，也不能完全避免在染 色水洗时会将部分材料冲脱，因此，在制备烈性病原菌，特别是带芽孢的病原菌的染色抹片 时，应严格慎重处理染色用过的残液和抹片本身，以免引起病原的散播。固定好的抹片，即 可进行各种方法的染色。 ㈡、染色 革兰（Gram）氏染色法 ⑴在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经 1-2min，水洗。这时细菌 都染成紫色。 ⑵加革兰氏碘溶液于抹片上助染，作用 1-3 min，水洗。这时细菌都呈更深的紫色。 ⑶加 95%酒精于抹片上脱色，约 30s 至 1 min,水洗。这时有的细菌紫色被脱去，呈无色； 有的紫色脱不了，仍保持紫色。 ⑷加碱性复红液复染 10-30 s，水洗。这时已脱色的细菌复染成红色，未脱色的细菌呈蓝 紫色。 ⑸吸干或烘干，镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 四、作 业 试述革兰氏染色的关键步骤。 实验三 细菌的分离培养及培养性状观察 一、实验目的要求 1．掌握需氧菌分离培养的基本要领。 2．了解厌氧菌的分离培养原则及常用的几种分离培养法。 3．了解细菌在固体和液体培养基中的生长表现。 二、实验用品 隔水式恒温培养箱、电冰箱、高压蒸汽灭菌器、天平、接种环、酒精灯、试管、营养琼 脂、平皿、精密 pH 试纸、试管架、火柴。 三、实验方法及步骤 细菌分离培养和移植的一般原则 分离培养是细菌学检验的基本技术之一。分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污 染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。细菌分离培养的步骤：先从被检材料或病料中分离培养 单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。进行细菌分离培养和移 植应注意下列事项： 1．选择适当培养基和培养条件。分离培养前应充分考虑所分离的细菌的特性，选择适合 其生长的培养基以及所需的气体与培养温度（病原菌一般为 37℃）等。 2．严格无菌操作、防止污染。培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰
接种环必须经火焰彻底灭菌：操作完毕后，防止再让培养基接触外界空气，接种环通过酒精 灯火焰灭菌。 3.防止过热的接种环杀死需要分离培养的细菌。接种环在烧灼灭菌后，不能立即钓取细 菌材料，否则会将细菌烫死：另外，还应注意防止己钓取菌料的接种环，不慎通过火焰而将 细菌杀死。 4.纯化分离菌。初代分离时若长出两种以上菌落，应进一步挑选可疑菌落进行纯培养。 细菌的分离培养法 (一)需氧菌分离培养法 1.平板划线法此法为最常用的细菌分离培养方法，其原则在于使被检材料充分分散， 以便经过培养后得到单个菌落，并可对菌落的形态、颜色、溶血与否等进行观察。 术式：右手似持毛笔的姿势持接种棒的塑料柄处，将接种环伸入酒精灯火焰中烧至通红， 再缓慢将接种棒其余金属部分均加以烧灼，准备蘸取材料：左手取琼脂平板，琼脂面与水平 面成45°角，接种环同培养基平面也成45°角。靠近酒精灯火焰操作。 方法：接种环经烧灼灭菌、冷却后，蘸取欲分离材料少许，按图实5-2中所示的几种划 线方式，选择其中一种进行划线。注意不要划破琼脂，不要划得太疏，不要过多重复划线， 以免形成菌苔。划毕，将培养基用皿盖盖好，接种环烧灼灭菌，于皿底用蜡笔标记被分离材 料名称及日期，倒转置37℃恒温箱中培养。 2.倾注法取3支预先准备的普通琼脂培养基管，水浴加热融化，冷至约50℃，用火 焰灭菌接种环钓取待分离物接种至第1管内，充分摇匀后，自第1管取一接种环内容物至第 2管，以同样方法自第2管移种至第3管。然后分别倾注一个已灭菌的平皿，凝固后倒转置 温箱内培养。结果多数细菌在琼脂内生长成菌落。仅少数菌落出现在表面，通常第一个平板 内的菌落数较多而密集，第二、三个平板则逐渐减少，可见单个菌落。此法目前已较少应用 (二)厌氧菌分离培养法厌氧菌生长繁殖的环境不能有游离氧的存在，故在培养厌氧菌时， 必须创造一个厌氧环境，一般以降低氧的张力或保持减低的氧张力为原则。目前，应用于厌 氧菌的分离培养方法颇多，现就其中较简便的几种方法介绍如下：
9 接种环必须经火焰彻底灭菌；操作完毕后，防止再让培养基接触外界空气，接种环通过酒精 灯火焰灭菌。 3．防止过热的接种环杀死需要分离培养的细菌。接种环在烧灼灭菌后，不能立即钓取细 菌材料，否则会将细菌烫死；另外，还应注意防止已钓取菌料的接种环，不慎通过火焰而将 细菌杀死。 4．纯化分离菌。初代分离时若长出两种以上菌落，应进一步挑选可疑菌落进行纯培养。 细菌的分离培养法 （一）需氧菌分离培养法 1．平板划线法 此法为最常用的细菌分离培养方法，其原则在于使被检材料充分分散， 以便经过培养后得到单个菌落，并可对菌落的形态、颜色、溶血与否等进行观察。 术式：右手似持毛笔的姿势持接种棒的塑料柄处，将接种环伸入酒精灯火焰中烧至通红， 再缓慢将接种棒其余金属部分均加以烧灼，准备蘸取材料；左手取琼脂平板，琼脂面与水平 面成 45°角，接种环同培养基平面也成 45°角。靠近酒精灯火焰操作。 方法：接种环经烧灼灭菌、冷却后，蘸取欲分离材料少许，按图实 5-2 中所示的几种划 线方式，选择其中一种进行划线。注意不要划破琼脂，不要划得太疏，不要过多重复划线， 以免形成菌苔。划毕，将培养基用皿盖盖好，接种环烧灼灭菌，于皿底用蜡笔标记被分离材 料名称及日期，倒转置 37℃恒温箱中培养。 2．倾注法 取 3 支预先准备的普通琼脂培养基管，水浴加热融化，冷至约 50℃，用火 焰灭菌接种环钓取待分离物接种至第 1 管内，充分摇匀后，自第 1 管取一接种环内容物至第 2 管，以同样方法自第 2 管移种至第 3 管。然后分别倾注一个已灭菌的平皿，凝固后倒转置 温箱内培养。结果多数细菌在琼脂内生长成菌落．仅少数菌落出现在表面，通常第一个平板 内的菌落数较多而密集，第二、三个平板则逐渐减少，可见单个菌落。此法目前已较少应用。 （二）厌氧菌分离培养法 厌氧菌生长繁殖的环境不能有游离氧的存在，故在培养厌氧菌时， 必须创造一个厌氧环境，一般以降低氧的张力或保持减低的氧张力为原则。目前，应用于厌 氧菌的分离培养方法颇多，现就其中较简便的几种方法介绍如下：
图5-2平板划线法的各种姿势 1焦性没食子酸法利用焦性没食子酸在碱性溶液内能大量地吸收氧的原理进行厌氧培 养。通常100cm3空间用焦性没食子酸1g,10%氢氧化钠或氢氧化钾10ml。具体方法有下列几 种： (1)平板培养法将厌氧菌划线接种于适宜的琼脂平板。取一小团直径约2cm的脱脂棉，置 于平皿盖的内面中央，其上滴加10%氢氧化钠溶液约5ml:在靠近脱脂棉的一侧放置焦性没 食子酸约0.5g,注意暂勿使两者接触。立即将已接种的平板覆盖于平皿盖上，迅速用融化的石 蜡密封平皿边缘周围。封毕，轻轻摇动平皿，使被氢氧化钠溶液浸湿的脱脂棉与焦性没食子 酸接触，然后置37℃恒温箱中培养。 (2)干燥器培养法于干燥器底部放入氢氧化钠溶液适量，然后再放入2-3个略高于液面 的玻璃圆柱（可利用链霉素小瓶），将适量焦性没食子酸用纸或纱布包好，放置于圆柱上面使 暂勿与氢氧化钠接触。然后放下隔板，将己接种的培养皿或试管置于隔板上，待一切准备好 后，将盖盖好密封，并轻轻摇动干燥器，使焦性没食子酸落入氢氧化钠溶液中。 2.高层琼脂柱摇震培养分离法 (I)取长约15cm的玻璃管一支，一端塞以小胶塞或小木塞，另一端塞以棉花塞，高压灭 菌备用。 (2)加热融化一管适合分离厌氧菌用的琼脂培养基，待冷至50℃左右，接入少许经适当稀 释的待分离的培养物或含菌材料，充分摇震均匀。 ()在琼脂凝固前，迅速以无菌滴管吸取上述已接种的琼脂培养基，注入上述(1)准备 好的玻璃管内，装至4/5左右之处，塞好棉花塞，放在大试管或玻璃筒内，置37℃恒温箱中 培养。 (4)长出菌落后，拔去胶塞和棉花塞，以无茵玻棒将琼脂柱推出于无菌平皿中，再用灭菌 接种环钓取独立菌落作厌氧纯培养。 3.连二亚硫酸钠法将已接种的平板或斜面培养基，置于一玻璃干燥器内（预先测出体 积)，按每1000ml容积称取连二亚硫酸钠（又称保险粉）和无水碳酸钠各4g,并分别研细均
10 图 5-2 平板划线法的各种姿势 1.焦性没食子酸法 利用焦性没食子酸在碱性溶液内能大量地吸收氧的原理进行厌氧培 养。通常 100cm3 空间用焦性没食子酸 1g，10%氢氧化钠或氢氧化钾 l0ml。具体方法有下列几 种： (1)平板培养法将厌氧菌划线接种于适宜的琼脂平板。取一小团直径约 2cm 的脱脂棉，置 于平皿盖的内面中央，其上滴加 10%氢氧化钠溶液约 5ml；在靠近脱脂棉的一侧放置焦性没 食子酸约 0.5g,注意暂勿使两者接触。立即将已接种的平板覆盖于平皿盖上，迅速用融化的石 蜡密封平皿边缘周围。封毕，轻轻摇动平皿，使被氢氧化钠溶液浸湿的脱脂棉与焦性没食子 酸接触，然后置 37℃恒温箱中培养。 (2)干燥器培养法 于干燥器底部放入氢氧化钠溶液适量，然后再放入 2-3 个略高于液面 的玻璃圆柱（可利用链霉素小瓶），将适量焦性没食子酸用纸或纱布包好，放置于圆柱上面使 暂勿与氢氧化钠接触。然后放下隔板，将已接种的培养皿或试管置于隔板上，待一切准备好 后，将盖盖好密封，并轻轻摇动干燥器，使焦性没食子酸落入氢氧化钠溶液中。 2．高层琼脂柱摇震培养分离法 (1)取长约 15 cm 的玻璃管一支，一端塞以小胶塞或小木塞，另一端塞以棉花塞，高压灭 菌备用。 (2)加热融化一管适合分离厌氧菌用的琼脂培养基，待冷至 50℃左右，接入少许经适当稀 释的待分离的培养物或含菌材料，充分摇震均匀。 (3)在琼脂凝固前，迅速以无菌滴管吸取上述已接种的琼脂培养基，注入上述（1）准备 好的玻璃管内，装至 4/5 左右之处，塞好棉花塞，放在大试管或玻璃筒内，置 37℃恒温箱中 培养。 (4)长出菌落后，拔去胶塞和棉花塞，以无菌玻棒将琼脂柱推出于无菌平皿中，再用灭菌 接种环钓取独立菌落作厌氧纯培养。 3．连二亚硫酸钠法 将已接种的平板或斜面培养基，置于一玻璃干燥器内（预先测出体 积），按每 1000rnI 容积称取连二亚硫酸钠（又称保险粉）和无水碳酸钠各 4g，并分别研细均