EDTA也能提高酶的通透量,而尿素有相反的作用 通过控制影响蛋白质超滤特性的因素,可使纯化倍数得到明显的提高,如经超滤可使大肠杆 菌青霉素酶的纯度提高7倍。超滤也可用于快速除去大量的低分子溶质,如从酶液中去掉乙醇或 脱盐,这种过程称为析滤。 334酶的进一步纯化 3.34l吸附层析 羟基磷灰石( hydroxyapatite,HA)是最常用于蛋白质分离的一种吸附剂,它是一种白色颗 粒,分子式为Ca(PO4)6(OH2,它非特异性地吸附蛋白质。羟基磷灰石分离大分子的机理还不完 全清楚,一般认为HA的结晶表面外露的Ca和PO43参与大分子的分级分离。酸性和中性的蛋 白质与HA上的Ca2+位点结合,高浓度的NaCl、KCl或CaCl2的存在既不影响两者的结合,也不 影响洗脱。酸性和中性蛋白质的洗脱一般是用pH约68的低浓度磷酸缓冲液(20~120 mmol/L)。 碱性蛋白质是结合在HA的PO43基团上,NaCl、KCl或CaCl2的存在会强烈影响吸附和洗脱。 一般可用这些盐或浓度为120~230mmo/L的磷酸缓冲液进行洗脱。但也有一些碱性蛋白质用浓 度很高的CaCl也洗不下来。总之,不同的蛋白质洗脱所需的条件不同。一般将酶在低浓度磷酸 缓冲液条件下上样,然后用逐渐增加磷酸盐浓度的阶段洗脱或浓度梯度洗脱,从而使各种蛋白质 分离。HA柱的再生方法是:500mmo仉L磷酸钾缓冲液→100 mmol/L磷酸钾缓冲液→水→起始缓 冲液平衡(起始缓冲液为5、10或20 mmol/L磷酸钾缓冲液)。 3342离子交换层析 离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两类,阳离子交换剂的衬质上带有阳离子交换 基团,常见的阳离子交换基团有-SOH、-COOH、CH2COOH(CM)等;阴离子交换剂的衬质 上带有阴离子交换基团,常见的阴离子交换基团有NH3C、二乙基胺乙基(DEAE)等。蛋白 质分子上具有各种阴阳离子基团,在一定的pH和离子强度下,这些基团可与离子交换剂上的相 应基团进行离子交换,使蛋白质分子通过静电引力吸附到离子交换剂上。改变pH和(或)离子 强度又可将这些吸附的蛋白质洗脱下来。在一定的上样和洗脱条件下,不同的蛋白质分子所带的 净电荷和电荷密度不同,分子大小也不同,它们与离子交换剂的结合力不同,结合力较弱的先洗 脱下来,结合力较强的后洗脱下来,从而达到分离的目的。洗脱的方式有单一溶液洗脱、阶段洗 脱和浓度梯度洗脱等。可改变洗脱液的pH,也可改变洗脱液的离子强度,或者二者同时改变。6 EDTA 也能提高酶的通透量，而尿素有相反的作用。 通过控制影响蛋白质超滤特性的因素，可使纯化倍数得到明显的提高，如经超滤可使大肠杆 菌青霉素酶的纯度提高 7 倍。超滤也可用于快速除去大量的低分子溶质，如从酶液中去掉乙醇或 脱盐，这种过程称为析滤。 3.3.4 酶的进一步纯化 3.3.4.1 吸附层析 羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）是最常用于蛋白质分离的一种吸附剂，它是一种白色颗 粒，分子式为 Ca10(PO4)6(OH)2，它非特异性地吸附蛋白质。羟基磷灰石分离大分子的机理还不完 全清楚，一般认为 HA 的结晶表面外露的 Ca 2+和 PO4 3－参与大分子的分级分离。酸性和中性的蛋 白质与 HA 上的 Ca 2+位点结合，高浓度的 NaCl、KCl 或 CaCl2的存在既不影响两者的结合，也不 影响洗脱。酸性和中性蛋白质的洗脱一般是用 pH 约 6.8 的低浓度磷酸缓冲液（20～120mmol/L）。 碱性蛋白质是结合在 HA 的 PO4 3－基团上，NaCl、KCl 或 CaCl2的存在会强烈影响吸附和洗脱。 一般可用这些盐或浓度为 120～230mmol/L 的磷酸缓冲液进行洗脱。但也有一些碱性蛋白质用浓 度很高的 CaCl2也洗不下来。总之，不同的蛋白质洗脱所需的条件不同。一般将酶在低浓度磷酸 缓冲液条件下上样，然后用逐渐增加磷酸盐浓度的阶段洗脱或浓度梯度洗脱，从而使各种蛋白质 分离。HA 柱的再生方法是：500mmol/L 磷酸钾缓冲液→100 mmol/L 磷酸钾缓冲液→水→起始缓 冲液平衡（起始缓冲液为 5、10 或 20 mmol/L 磷酸钾缓冲液）。 3.3.4.2 离子交换层析 离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两类，阳离子交换剂的衬质上带有阳离子交换 基团，常见的阳离子交换基团有-SO3H、-COOH、-CH2COOH（CM）等；阴离子交换剂的衬质 上带有阴离子交换基团，常见的阴离子交换基团有-NH3＋Cl－、二乙基胺乙基（DEAE）等。蛋白 质分子上具有各种阴阳离子基团，在一定的 pH 和离子强度下，这些基团可与离子交换剂上的相 应基团进行离子交换，使蛋白质分子通过静电引力吸附到离子交换剂上。改变 pH 和（或）离子 强度又可将这些吸附的蛋白质洗脱下来。在一定的上样和洗脱条件下，不同的蛋白质分子所带的 净电荷和电荷密度不同，分子大小也不同，它们与离子交换剂的结合力不同，结合力较弱的先洗 脱下来，结合力较强的后洗脱下来，从而达到分离的目的。洗脱的方式有单一溶液洗脱、阶段洗 脱和浓度梯度洗脱等。可改变洗脱液的 pH，也可改变洗脱液的离子强度，或者二者同时改变