郭宗儒:首创性的“跟踪”药物色瑞替尼 针对ALK-NPM激酶为靶标的抑制剂,用已有针对其 Schindler t, Bornmann v, Pellicena p,etal. Structural 他激酶而合成的小分子化合物库进行了随机筛选, mechanism for STi-57 I inhibition of abelson tyrosine 从中发现了化合物2(代号TAE684)对高表达 ALk- kinase. Science,,2000289:1938-1942)。然而,化合物 NPM的Ba/F3细胞有强抑制活性,ICs0=3 nmol. L-1,2结合于ATP位点却显示有高选择性抑制活性,推测 而对野生型Ba/F3细胞在1pmoL浓度下没有抑制可能是由于在苯胺片段的2位存在甲氧基,该甲氧基 作用,提示该先导物是选择性高的强效抑制剂。图1处于ALK铰链处的Leu258和Me259残基侧链构 是化合物2与ALK激酶分子对接图。 的疏水性沟槽内,而其他激酶的相应氨基酸尺寸都 比较大,位阻效应阻止了化合物2的甲氧基进入。分 子模拟揭示了甲氧基的重要性( Galkin Av, Melnick JS. Kim S. et al. Identification of NVP-TAE684. a potent, selective, and efficacious inhibitor of NPM ALK. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104: 270-275) 4先导化合物的优化 4.1甲氧基的变换分子模拟揭示了苯胺环上的2 甲氧基对于选择性作用的重要性,首先考察其他的 烷氧基对活性的影响。在合成的化合物中,2-异丙氧 基化合物3仍保持高活性和选择性(疏水性沟槽可容 纳异丙氧基),同时还降低了氧化代谢的程度,表明 2-异丙氧基是一个可替换甲氧基的优选基团。 4.2消除警戒结构化合物2对体外ALK激酶、高 表达ALK的细胞以及体内接种 Karpas-299或BaF3 图1化合物2与ALK激酶分子对接图 NPM-ALK-细胞的小鼠都有强效抑制活性,药代动力 学性质也可以,但却不能作为候选药物。这是因为2 32分子模拟一解析先导物的结合方式用分子模在体内发生氧化代谢,产生有反应活性的代谢产物 拟方法研究了化合物2与ALK激酶的结合特征,以2与肝微粒体温孵,LCMS证明有20%原药转化为有 揭示2在ALK活性部位的定位和取向,以及各个基反应活性的亲电性物质,例如可被谷胱甘肽捕获生 团和片段的结合模式,指导新化合物的设计。由于当成加合物(图2)。 时尚未解析ALK激酶的三维结构,故采用同源模建 亲电性物质源于分子中的对苯二胺结构(称作 方法,根据同源性强的已知InsR的三维结构,构建警戒结构, structural alert),对苯二胺有较高的电荷密 了ALK三维结构。分子对接显示,化合物2占据的度,是细胞色素P450的氧化位点,生成带有正电荷 位置是ATP结合腔,结构中2-氨基嘧啶片段通过两的1,4亚胺醌,为强亲电性基团,容易同体内亲核基 个氢键结合固定于ALK的铰链处,2并没有延伸到团发生亲核取代反应,具有产生特质性药物毒性 变构区的疏水腔中。皆知,Abl特异性抑制剂伊马替D)的风险( Orhan h, Vermeulen NPe. Conventional 尼与激酶的结合位点是ATP旁边的变构区的疏水腔, and novel approaches in generating and characterization 与激酶的非活性“DFG-out”构象结合,因而呈现出 of reactive intermediates from drugs/drug candidates 比结合于ATP位点的抑制剂具有更高的选择性活性 Curr Drug metab,20ll,12:383-394) Hc O oHNN NS 对苯二胺被氧化 生成亲电性醌式亚铵离子 与亲核基团生成加合物 图2化合物2氧化产物和与谷胱甘肽(GSH)的加合物郭宗儒: 首创性的“跟踪”药物色瑞替尼 · 501 · 针对 ALK-NPM 激酶为靶标的抑制剂, 用已有针对其 他激酶而合成的小分子化合物库进行了随机筛选, 从中发现了化合物 2 (代号 TAE684) 对高表达 ALK￾NPM 的 Ba/F3 细胞有强抑制活性, IC50 = 3 nmol·L −1 , 而对野生型 Ba/F3 细胞在 1 μmol·L −1 浓度下没有抑制 作用, 提示该先导物是选择性高的强效抑制剂。图 1 是化合物 2 与 ALK 激酶分子对接图。 图 1 化合物 2 与 ALK 激酶分子对接图 3.2 分子模拟—解析先导物的结合方式 用分子模 拟方法研究了化合物 2 与 ALK 激酶的结合特征, 以 揭示 2 在 ALK 活性部位的定位和取向, 以及各个基 团和片段的结合模式, 指导新化合物的设计。由于当 时尚未解析 ALK 激酶的三维结构, 故采用同源模建 方法, 根据同源性强的已知 InsR 的三维结构, 构建 了 ALK 三维结构。分子对接显示, 化合物 2 占据的 位置是 ATP 结合腔, 结构中 2-氨基嘧啶片段通过两 个氢键结合固定于 ALK 的铰链处, 2 并没有延伸到 变构区的疏水腔中。皆知, Abl 特异性抑制剂伊马替 尼与激酶的结合位点是 ATP 旁边的变构区的疏水腔, 与激酶的非活性“DFG-out”构象结合, 因而呈现出 比结合于 ATP 位点的抑制剂具有更高的选择性活性 (Schindler T, Bornmann W, Pellicena P, et al. Structural mechanism for STI-571 inhibition of abelson tyrosine kinase. Science, 2000, 289: 1938−1942)。然而, 化合物 2 结合于 ATP 位点却显示有高选择性抑制活性, 推测 可能是由于在苯胺片段的 2 位存在甲氧基, 该甲氧基 处于 ALK 铰链处的 Leu258 和 Met259 残基侧链构成 的疏水性沟槽内, 而其他激酶的相应氨基酸尺寸都 比较大, 位阻效应阻止了化合物 2 的甲氧基进入。分 子模拟揭示了甲氧基的重要性 (Galkin AV, Melnick JS, Kim SJ, et al. Identification of NVP-TAE684, a potent, selective, and efficacious inhibitor of NPM￾ALK. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104: 270−275)。 4 先导化合物的优化 4.1 甲氧基的变换 分子模拟揭示了苯胺环上的 2- 甲氧基对于选择性作用的重要性, 首先考察其他的 烷氧基对活性的影响。在合成的化合物中, 2-异丙氧 基化合物 3 仍保持高活性和选择性 (疏水性沟槽可容 纳异丙氧基), 同时还降低了氧化代谢的程度, 表明 2-异丙氧基是一个可替换甲氧基的优选基团。 4.2 消除警戒结构 化合物 2 对体外 ALK 激酶、高 表达 ALK 的细胞以及体内接种 Karpas-299-或 Ba/F3 NPM-ALK-细胞的小鼠都有强效抑制活性, 药代动力 学性质也可以, 但却不能作为候选药物。这是因为 2 在体内发生氧化代谢, 产生有反应活性的代谢产物, 2 与肝微粒体温孵, LC-MS 证明有 20%原药转化为有 反应活性的亲电性物质, 例如可被谷胱甘肽捕获生 成加合物 (图 2)。 亲电性物质源于分子中的对苯二胺结构 (称作 警戒结构, structural alert), 对苯二胺有较高的电荷密 度, 是细胞色素 P450 的氧化位点, 生成带有正电荷 的 1,4 亚胺醌, 为强亲电性基团, 容易同体内亲核基 团发生亲核取代反应, 具有产生特质性药物毒性 (ITD) 的风险 (Orhan H, Vermeulen NPE. Conventional and novel approaches in generating and characterization of reactive intermediates from drugs/drug candidates. Curr Drug Metab, 2011, 12: 383−394)。 图 2 化合物 2 氧化产物和与谷胱甘肽 (GSH) 的加合物