后3000pm离心5分钟。 7.取上层水相至干净离心管,加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。 8.移去上层乙醚保留下层水相 9.加/10体积3 mol/L NaAc,及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室 温下静止10-20分钟,DNA沉淀形成白色絮状物。 10.用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后在吸水纸上吸干溶解于1n 正中-20℃保存 1l.如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000pm短暂离心取上清;如要除 去其中的RNA,可加5μ1 RNasea(10μg/μ),37℃保温30分钟,用酚抽提后,按 步骤9-10重沉淀DNA。 第四节细菌基因组DNA的制备 、材料 细菌培养物。 设备 移液管,高速冷冻离心机,台式离心机,水浴锅。 试剂 1、 CTAB/NaCl溶液:4 Ig NaCl溶解于80mlH2O,缓慢加入10 g CTAB加水 至100ml。 2、其它试剂:氯仿:异戊醇(24:1),酚氯仿异戊醇(25241),异丙醇,70%乙 醇,TE,10%SDS,蛋白酶K(20mg/ml或粉剂),5 mol/L NaCl 四、操作步骤 l.100ml细菌过夜培养液,5000pm离心10分钟,去上清液 2.加9.5mlTE悬浮沉淀,并加05ml10%SDS,50u120mgml(或1mg干粉) 蛋白酶K,混匀,37℃保温1小时。 3.加1.5ml5 mol/L NaCl,混匀 4.加1.5 mI ctAB∧NaCl溶液,混匀,65℃保温20分钟 5.用等体积酚氯仿:异戊醇(2524:1)抽提,5000pm离心10分钟,将上清液 移至干净离心管后,3000rpm 离心 5 分钟。 7. 取上层水相至干净离心管, 加 2 倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。 8. 移去上层乙醚,保留下层水相。 9. 加 1/10 体积 3mol/L NaAc, 及 2 倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀 DNA。室 温下静止 10-20 分钟，DNA 沉淀形成白色絮状物。 10. 用玻棒钩出 DNA 沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于 1ml TE 中,-20℃保存。 11. 如果 DNA 溶液中有不溶解颗粒,可在 5000rpm短暂离心,取上清; 如要除 去其中的 RNA,可加 5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温 30 分钟, 用酚抽提后, 按 步骤 9-10 重沉淀 DNA。 第四节 细菌基因组 DNA 的制备 一、材料 细菌培养物。 二、设备 移液管, 高速冷冻离心机, 台式离心机，水浴锅。 三、试剂 1、CTAB/NaCl 溶液：4.1g NaCl 溶解于 80ml H2 O,缓慢加入 10g CTAB,加水 至 100ml。 2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙 醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml 或粉剂)，5mol/L NaCl。 四、操作步骤： 1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm 离心 10 分钟, 去上清液。 2. 加 9.5ml TE 悬浮沉淀, 并加 0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或 1mg 干粉) 蛋白酶 K, 混匀, 37℃保温 1 小时。 3. 加 1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。 4. 加 1.5ml CTAB/NaCl 溶液, 混匀, 65℃保温 20 分钟。 5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm 离心 10 分钟, 将上清液 移至干净离心管