、技术应用 1、胎儿性别鉴定。 利用孕妇血浆胎儿DNA进行性别判定对排除X连锁遗传病具有重要意义。应用现代分 子生物学技术,通过胎儿DNA判断胎儿性别已经达到很高的灵敏度。 Honda等先通过常规 PCR检测13~14周孕龄的胎儿性别,敏感性达100%,后用实时定量PCR检测5周孕龄的 胎儿性别,敏感性也接近100%。 通过性别判定,可进一步排除患性连锁遗传病的风险。 Bartha等从妊娠6周的孕妇血浆 中检出了男性胎儿的SRY基因,从而排除了女性胎儿因21-羟化酶缺陷而患上先天性肾上腺 增生的危险性。肌营养不良症是常见的Ⅹ连锁隐性遗传病,利用游离胎儿DNA进行胎儿性 别鉴定后,只需对孕男胎的妇女进行创伤性产前诊断,避免了孕女胎妇女进行创伤性产前诊 断导致的不必要的流产致畸风险 2、胎儿RhD血型判断。 HD-的孕妇如果第二胎生育RHD+的胎儿,就有可能引起胎儿红细胞破坏,进而出现 严重的贫血症状,所以对RHD-孕妇产前胎儿的RhD血型检测非常重要,并对孕妇的抗D 免疫球蛋白治疗方案有重要指导意义。胎儿游离DNA的方法很早就被应用于胎儿RhD血型 的检测。目前,此项技术的敏感度有了很大提高。 Chinen等对97名RHD-的孕妇进行胎儿 RhD血型检测,对RHD基因的第7外显子进行扩增,敏感度达到100%,特异性909%,假 阴性0%。 3、妊娠相关疾病筛查。 一些学者研究发现,很多妊娠相关疾病都伴随胎儿游离DNA浓度的增加,如早产、先 兆子痫、妊娠剧吐、侵入性胎盘等。其中研究最多最深入的是先兆子痫。在先兆子痫患者中 胎儿游离DNA的量高于正常孕妇,且胎儿游离DNA的升高使先兆子痫症状出现的时间提 前,而且升高的程度和先兆子痫的严重性相关。所以胎儿游离DNA可能是一种有应用价值 潜力的先兆子痫患者筛检物 4、染色体疾病筛查。随着母血中DNA分离和检测技术的改进,胎儿游离DNA成为检测非 整倍体疾病的一项参考指标。 Go等首先发现了母血浆中存在21号染色体特异表达mRNA片段LOC90625,这为通 过定量检测mRNA的表达异常来筛查唐氏综合征提供了可能。Lau等也在母血浆中发现了 位于21号染色体上胎盘特异表达的PLCA4基因片段。为了通过mRNA来说明21号染色体 含量上的差异,Lau等选择了PLCA4编码区域一个SNP位点,由于在一个正常胎儿,人类 染色体的二倍体性使得杂合性SNP其等位基因含量比例将会出现1:1,而对于一个21-三 体患儿,其等位基因的含量比例将会为1:2或2:1因此可以用母血浆中胎盘表达的mRNA 来无创性的评估胎盘细胞染色体含量的异常与否,也可以评估胎儿染色体数目异常与否。 前述2005年Chm等发现的在胎盘细胞中处于低甲基化状态而母血细胞中高甲基化状 态的 maspin基因,为表观遗传学用于发展孕期通用的胎儿DNA标记奠定了基础,在此研 究思路下,Tong等通过对母血浆中 maspIn基因进行表观遗传学检测并对低甲基化的 maspin 基因序列上的等位基因进行了分析,由于 maspin基因位于18号染色体,即可对18-三体的 存在进行确认。 唐氏综合征由于其发病率高而备受人们关注,为了寻找21号染色体可用诊断的表观遗 传标记, Hulten等采取了3种策略筛选差异甲基化的DNA序列:(1)在母血细胞和胎儿中高 度差异表达基因的启动子序列(2)随机的启动子区域;(3)随机的非启动子区域。用甲基化特 异性限制性酶分析了200多个候选DNA序列,结果在21q223发现了3个差异甲基化序 列ARE、SM2和ERG基因。其中ARE基因启动子区域的CpG位点是高度差异甲基化的二、技术应用 1、胎儿性别鉴定。 利用孕妇血浆胎儿 DNA 进行性别判定对排除 X 连锁遗传病具有重要意义。应用现代分 子生物学技术，通过胎儿 DNA 判断胎儿性别已经达到很高的灵敏度。Honda 等先通过常规 PCR 检测 13～14 周孕龄的胎儿性别，敏感性达 100%，后用实时定量 PCR 检测 5 周孕龄的 胎儿性别，敏感性也接近 100%。 通过性别判定，可进一步排除患性连锁遗传病的风险。Bartha 等从妊娠 6 周的孕妇血浆 中检出了男性胎儿的 SRY 基因，从而排除了女性胎儿因 21-羟化酶缺陷而患上先天性肾上腺 增生的危险性。肌营养不良症是常见的 X 连锁隐性遗传病，利用游离胎儿 DNA 进行胎儿性 别鉴定后，只需对孕男胎的妇女进行创伤性产前诊断，避免了孕女胎妇女进行创伤性产前诊 断导致的不必要的流产致畸风险。 2、胎儿 RhD 血型判断。 RHD-的孕妇如果第二胎生育 RHD+的胎儿，就有可能引起胎儿红细胞破坏，进而出现 严重的贫血症状，所以对 RHD-孕妇产前胎儿的 RhD 血型检测非常重要，并对孕妇的抗 D 免疫球蛋白治疗方案有重要指导意义。胎儿游离 DNA 的方法很早就被应用于胎儿 RhD 血型 的检测。目前，此项技术的敏感度有了很大提高。Chinena 等对 97 名 RHD-的孕妇进行胎儿 RhD 血型检测，对 RHD 基因的第 7 外显子进行扩增，敏感度达到 100%，特异性 90.9%，假 阴性 0%。 3、妊娠相关疾病筛查。 一些学者研究发现，很多妊娠相关疾病都伴随胎儿游离 DNA 浓度的增加，如早产、先 兆子痫、妊娠剧吐、侵入性胎盘等。其中研究最多最深入的是先兆子痫。在先兆子痫患者中， 胎儿游离 DNA 的量高于正常孕妇，且胎儿游离 DNA 的升高使先兆子痫症状出现的时间提 前，而且升高的程度和先兆子痫的严重性相关。所以胎儿游离 DNA 可能是一种有应用价值 潜力的先兆子痫患者筛检物。 4、染色体疾病筛查。随着母血中 DNA 分离和检测技术的改进，胎儿游离 DNA 成为检测非 整倍体疾病的一项参考指标。 Go 等首先发现了母血浆中存在 21 号染色体特异表达 mRNA 片段 LOC90625，这为通 过定量检测 mRNA 的表达异常来筛查唐氏综合征提供了可能。Lau 等也在母血浆中发现了 位于 21 号染色体上胎盘特异表达的 PLCA4 基因片段。为了通过 mRNA 来说明 21 号染色体 含量上的差异，Lau 等选择了 PLCA4 编码区域一个 SNP 位点，由于在一个正常胎儿，人类 染色体的二倍体性使得杂合性 SNP 其等位基因含量比例将会出现 1：1，而对于一个 21-三 体患儿，其等位基因的含量比例将会为 1：2 或 2：1。因此可以用母血浆中胎盘表达的 mRNA 来无创性的评估胎盘细胞染色体含量的异常与否，也可以评估胎儿染色体数目异常与否。 前述 2005 年 Chim 等发现的在胎盘细胞中处于低甲基化状态而母血细胞中高甲基化状 态的 maspin 基因，为表观遗传学用于发展孕期通用的胎儿 DNA 标记奠定了基础，在此研 究思路下，Tong等通过对母血浆中maspin 基因进行表观遗传学检测并对低甲基化的maspin 基因序列上的等位基因进行了分析，由于 maspin 基因位于 18 号染色体，即可对 18-三体的 存在进行确认。 唐氏综合征由于其发病率高而备受人们关注，为了寻找 21 号染色体可用诊断的表观遗 传标记，Hultén 等采取了 3 种策略筛选差异甲基化的 DNA 序列：(1)在母血细胞和胎儿中高 度差异表达基因的启动子序列；(2)随机的启动子区域；(3)随机的非启动子区域。用甲基化特 异性限制性酶分析了 200 多个候选 DNA 序列，结果在 21q22.3 发现了 3 个差异甲基化序 列：AIRE、SIM2 和 ERG 基因。其中 AIRE 基因启动子区域的 CpG 位点是高度差异甲基化的