无创产前诊断的福音 一孕妇外周血胎儿游离DNA检测技术 周思瑶17307110460 产前筛查与诊断是妇产科保健的重要部分,对正常怀孕的妇女,通过孕期检查时的病史 询问、母血清生化指标的检测、超声影像学的检查筛选出一部分高风险人群,再针对此组人 群选择适宜的方法进行相关的产前诊断。传统产前诊断方法一般都具有创伤性,有发生感染 出血甚至流产、死胎的可能。无创性产前诊断长久以来致力于利用孕妇外周血中存在的胎儿 有核细胞,但由于母体外周血中胎儿有核细胞极少,其分离、富集方法繁琐复杂,且价格昂 贵,其临床应用至今不能推广。孕妇外周血中胎儿游离DNA的发现为无创性产前诊断带来 了新的希望。 技术原理 孕妇外周血胎儿游离DNA检测技术的具体操作为:采集孕妇外周血10m于EDTA抗 凝管中,样本收集后4℃°条件下进行血浆分离,提取血浆中游离DNA,PCR扩增,获得对应 样本的DNA文库,高通量检测,将测序结果进行生物信息学分析。 1、胎儿游离DNA的制备:在胎儿游离DNA提取过程中,血样的放置时间、抗凝剂的使用、 离心速度等都会影响提取DNA的量和实验结果的准确性、可靠性。 放置时间对DNA总量有影响,而对胎儿游离DNA无影响,胎儿游离DNA在抽血后 24h内都是稳定的,总DNA的增加可能是由于细胞凋亡、细胞死亡和溶解引起的母源DNA 的增加。DNA总量与胎儿游离DNA检出的敏感性有关,母亲DNA量的增加会降低拷贝数 目胎儿游离DNA的检出 在血液样本抗凝剂的选择方面,大多数学者选用EDTA来抗凝,经证实,6h内EDTA和 肝素、柠檬酸钠效果无明显差别;而血样放置超过6,EDTA的效果优于肝素和柠檬酸钠等 抗凝剂。目前胎儿游离DNA一般采用2次离心之后取上层血浆用试剂盒来提取,然后应用 实时定量PCR对胎儿游离DNA进行定量分析。 第一次离心速度一般为1600×g左右,主要目的是将存在于血浆中的细胞沉淀初步分离 出来同时又要防止细胞破损导致基因组DNA释放到血浆中。第二次离心一般为13000~ 16000×g的高速离心,进一步将残留血细胞去除。离心速度对胎儿游离DNA的提取至关重 要,离心速度过快或在提取DNA之前血液放置时间过久都会导致完整细胞破坏溶解,从而 母血DNA量增加,造成胎儿游离DNA的相对稀释,影响后续实验如实时定量PCR对其的 检测。因此胎儿游离DNA提取时应尽量减少血样放置时间,以减少细胞坏死和溶解,提高 胎儿游离DNA的检出率。 2、PCR技术:孕妇外周血胎儿游离DNA检测技术中的关键步骤其实是PCR扩增,虽然该 技术较为普遍广知,仍旧单独对该技术的基本原理作一介绍。 PCR技术是模拟体内DNA的天然复制过程,在体外扩增DNA分子的一种分子生物学 技术,主要用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。在待扩增的DNA片段两侧和与 其两侧互补的两个寡核苷酸引物,经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增2倍。 PCR的每个循环过程包括高温变性、低温退火、中温延伸三个不同的事件 ①变性:加热使模板DNA在高温下(94C°左右)双链间的氢键断裂而形成两条单链 ②退火;使溶液温度降至50-60℃,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合 ③延伸溶液反应温度升至72C,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物的引导下 利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP),按5-3′方向复制出互补DNA
无创产前诊断的福音 ——孕妇外周血胎儿游离 DNA 检测技术 周思瑶 17307110460 产前筛查与诊断是妇产科保健的重要部分，对正常怀孕的妇女，通过孕期检查时的病史 询问、母血清生化指标的检测、超声影像学的检查筛选出一部分高风险人群，再针对此组人 群选择适宜的方法进行相关的产前诊断。传统产前诊断方法一般都具有创伤性，有发生感染、 出血甚至流产、死胎的可能。无创性产前诊断长久以来致力于利用孕妇外周血中存在的胎儿 有核细胞，但由于母体外周血中胎儿有核细胞极少，其分离、富集方法繁琐复杂，且价格昂 贵，其临床应用至今不能推广。孕妇外周血中胎儿游离 DNA 的发现为无创性产前诊断带来 了新的希望。 一、技术原理 孕妇外周血胎儿游离 DNA 检测技术的具体操作为：采集孕妇外周血 10ml 于 EDTA 抗 凝管中，样本收集后 4℃条件下进行血浆分离，提取血浆中游离 DNA，PCR 扩增，获得对应 样本的 DNA 文库，高通量检测，将测序结果进行生物信息学分析。 1、胎儿游离 DNA 的制备：在胎儿游离 DNA 提取过程中，血样的放置时间、抗凝剂的使用、 离心速度等都会影响提取 DNA 的量和实验结果的准确性、可靠性。 放置时间对 DNA 总量有影响，而对胎儿游离 DNA 无影响，胎儿游离 DNA 在抽血后 24h 内都是稳定的，总 DNA 的增加可能是由于细胞凋亡、细胞死亡和溶解引起的母源 DNA 的增加。DNA 总量与胎儿游离 DNA 检出的敏感性有关，母亲 DNA 量的增加会降低拷贝数 目胎儿游离 DNA 的检出。 在血液样本抗凝剂的选择方面，大多数学者选用 EDTA 来抗凝，经证实，6h 内 EDTA 和 肝素、柠檬酸钠效果无明显差别；而血样放置超过 6h，EDTA 的效果优于肝素和柠檬酸钠等 抗凝剂。目前胎儿游离 DNA 一般采用 2 次离心之后取上层血浆用试剂盒来提取，然后应用 实时定量 PCR 对胎儿游离 DNA 进行定量分析。 第一次离心速度一般为 1600×g 左右，主要目的是将存在于血浆中的细胞沉淀初步分离 出来同时又要防止细胞破损导致基因组 DNA 释放到血浆中。第二次离心一般为 13000～ 16000×g 的高速离心，进一步将残留血细胞去除。离心速度对胎儿游离 DNA 的提取至关重 要，离心速度过快或在提取 DNA 之前血液放置时间过久都会导致完整细胞破坏溶解，从而 母血 DNA 量增加，造成胎儿游离 DNA 的相对稀释，影响后续实验如实时定量 PCR 对其的 检测。因此胎儿游离 DNA 提取时应尽量减少血样放置时间，以减少细胞坏死和溶解，提高 胎儿游离 DNA 的检出率。 2、PCR 技术：孕妇外周血胎儿游离 DNA 检测技术中的关键步骤其实是 PCR 扩增，虽然该 技术较为普遍广知，仍旧单独对该技术的基本原理作一介绍。 PCR 技术是模拟体内 DNA 的天然复制过程，在体外扩增 DNA 分子的一种分子生物学 技术，主要用于扩增位于两段已知序列之间的 DNA 区段。在待扩增的 DNA 片段两侧和与 其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA 扩增 2ⁿ倍。 PCR 的每个循环过程包括高温变性、低温退火、中温延伸三个不同的事件： ①变性：加热使模板 DNA 在高温下（94℃左右）双链间的氢键断裂而形成两条单链； ②退火；使溶液温度降至 50~60℃，模板 DNA 与引物按碱基配对原则互补结合； ③延伸：溶液反应温度升至 72℃，耐热 DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板，在引物的引导下， 利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按 5'一 3’方向复制出互补 DNA
3 53535353 53535353 3、胎儿游离DNA的检测 ①检测继承自父亲一方的基因或突变。 目前对孕妇外周血中胎儿游离DNA的应用大多局限于检测胎儿从父亲一方继承来的基因或 突变,如Y染色体上的SRY、DYS14基因,Rh抗原基因等。 ②2利用表观遗传学检测从母亲继承来的胎儿等位基因 由于母亲外周血中的胎儿DNA处于一种高母体DNA的背景下,这使得检测从母亲继承来 的胎儿等位基因曾被认为是不可能的,但近来表观遗传学的发展提供了打破这些限制的可 能 表观遗传学是指DNA序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变,即基因型未变而 表型却发生了改变。DNA甲基化是最早发现也是最重要的基因表观修饰方式之一。2005年 Chim等研究发现, maspIn基因在胎盘细胞中处于低甲基化,而在母血细胞中处于高甲基化, 这种不同甲基化状态为其作为母血浆中胎儿游离DNA的筛选标记奠定了基础。同时发现, 血浆中低甲基化的 maspin序列中存在胎儿SNPs基因型。应用胎儿与母体DNA甲基化差异 联合等位基因比例可用来无创诊断胎儿染色体异常疾病,如18-三体、21-三体征。这表明, 表观遗传学的方法能够用来发展孕期通用的胎儿DNA标记,且不受胎儿性别和胎儿与母亲 遗传多态性的影响
3、胎儿游离 DNA 的检测： ①检测继承自父亲一方的基因或突变。 目前对孕妇外周血中胎儿游离 DNA 的应用大多局限于检测胎儿从父亲一方继承来的基因或 突变，如 Y 染色体上的 SRY、DYS14 基因，Rh 抗原基因等。 ②利用表观遗传学检测从母亲继承来的胎儿等位基因。 由于母亲外周血中的胎儿 DNA 处于一种高母体 DNA 的背景下，这使得检测从母亲继承来 的胎儿等位基因曾被认为是不可能的，但近来表观遗传学的发展提供了打破这些限制的可 能。 表观遗传学是指 DNA 序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变，即基因型未变而 表型却发生了改变。DNA 甲基化是最早发现也是最重要的基因表观修饰方式之一。2005 年 Chim 等研究发现，maspin 基因在胎盘细胞中处于低甲基化，而在母血细胞中处于高甲基化， 这种不同甲基化状态为其作为母血浆中胎儿游离 DNA 的筛选标记奠定了基础。同时发现， 血浆中低甲基化的 maspin 序列中存在胎儿 SNPs 基因型。应用胎儿与母体 DNA 甲基化差异 联合等位基因比例可用来无创诊断胎儿染色体异常疾病，如 18-三体、21-三体征。这表明， 表观遗传学的方法能够用来发展孕期通用的胎儿 DNA 标记，且不受胎儿性别和胎儿与母亲 遗传多态性的影响
、技术应用 1、胎儿性别鉴定。 利用孕妇血浆胎儿DNA进行性别判定对排除X连锁遗传病具有重要意义。应用现代分 子生物学技术,通过胎儿DNA判断胎儿性别已经达到很高的灵敏度。 Honda等先通过常规 PCR检测13~14周孕龄的胎儿性别,敏感性达100%,后用实时定量PCR检测5周孕龄的 胎儿性别,敏感性也接近100%。 通过性别判定,可进一步排除患性连锁遗传病的风险。 Bartha等从妊娠6周的孕妇血浆 中检出了男性胎儿的SRY基因,从而排除了女性胎儿因21-羟化酶缺陷而患上先天性肾上腺 增生的危险性。肌营养不良症是常见的Ⅹ连锁隐性遗传病,利用游离胎儿DNA进行胎儿性 别鉴定后,只需对孕男胎的妇女进行创伤性产前诊断,避免了孕女胎妇女进行创伤性产前诊 断导致的不必要的流产致畸风险 2、胎儿RhD血型判断。 HD-的孕妇如果第二胎生育RHD+的胎儿,就有可能引起胎儿红细胞破坏,进而出现 严重的贫血症状,所以对RHD-孕妇产前胎儿的RhD血型检测非常重要,并对孕妇的抗D 免疫球蛋白治疗方案有重要指导意义。胎儿游离DNA的方法很早就被应用于胎儿RhD血型 的检测。目前,此项技术的敏感度有了很大提高。 Chinen等对97名RHD-的孕妇进行胎儿 RhD血型检测,对RHD基因的第7外显子进行扩增,敏感度达到100%,特异性909%,假 阴性0%。 3、妊娠相关疾病筛查。 一些学者研究发现,很多妊娠相关疾病都伴随胎儿游离DNA浓度的增加,如早产、先 兆子痫、妊娠剧吐、侵入性胎盘等。其中研究最多最深入的是先兆子痫。在先兆子痫患者中 胎儿游离DNA的量高于正常孕妇,且胎儿游离DNA的升高使先兆子痫症状出现的时间提 前,而且升高的程度和先兆子痫的严重性相关。所以胎儿游离DNA可能是一种有应用价值 潜力的先兆子痫患者筛检物 4、染色体疾病筛查。随着母血中DNA分离和检测技术的改进,胎儿游离DNA成为检测非 整倍体疾病的一项参考指标。 Go等首先发现了母血浆中存在21号染色体特异表达mRNA片段LOC90625,这为通 过定量检测mRNA的表达异常来筛查唐氏综合征提供了可能。Lau等也在母血浆中发现了 位于21号染色体上胎盘特异表达的PLCA4基因片段。为了通过mRNA来说明21号染色体 含量上的差异,Lau等选择了PLCA4编码区域一个SNP位点,由于在一个正常胎儿,人类 染色体的二倍体性使得杂合性SNP其等位基因含量比例将会出现1:1,而对于一个21-三 体患儿,其等位基因的含量比例将会为1:2或2:1因此可以用母血浆中胎盘表达的mRNA 来无创性的评估胎盘细胞染色体含量的异常与否,也可以评估胎儿染色体数目异常与否。 前述2005年Chm等发现的在胎盘细胞中处于低甲基化状态而母血细胞中高甲基化状 态的 maspin基因,为表观遗传学用于发展孕期通用的胎儿DNA标记奠定了基础,在此研 究思路下,Tong等通过对母血浆中 maspIn基因进行表观遗传学检测并对低甲基化的 maspin 基因序列上的等位基因进行了分析,由于 maspin基因位于18号染色体,即可对18-三体的 存在进行确认。 唐氏综合征由于其发病率高而备受人们关注,为了寻找21号染色体可用诊断的表观遗 传标记, Hulten等采取了3种策略筛选差异甲基化的DNA序列:(1)在母血细胞和胎儿中高 度差异表达基因的启动子序列(2)随机的启动子区域;(3)随机的非启动子区域。用甲基化特 异性限制性酶分析了200多个候选DNA序列,结果在21q223发现了3个差异甲基化序 列ARE、SM2和ERG基因。其中ARE基因启动子区域的CpG位点是高度差异甲基化的
二、技术应用 1、胎儿性别鉴定。 利用孕妇血浆胎儿 DNA 进行性别判定对排除 X 连锁遗传病具有重要意义。应用现代分 子生物学技术，通过胎儿 DNA 判断胎儿性别已经达到很高的灵敏度。Honda 等先通过常规 PCR 检测 13～14 周孕龄的胎儿性别，敏感性达 100%，后用实时定量 PCR 检测 5 周孕龄的 胎儿性别，敏感性也接近 100%。 通过性别判定，可进一步排除患性连锁遗传病的风险。Bartha 等从妊娠 6 周的孕妇血浆 中检出了男性胎儿的 SRY 基因，从而排除了女性胎儿因 21-羟化酶缺陷而患上先天性肾上腺 增生的危险性。肌营养不良症是常见的 X 连锁隐性遗传病，利用游离胎儿 DNA 进行胎儿性 别鉴定后，只需对孕男胎的妇女进行创伤性产前诊断，避免了孕女胎妇女进行创伤性产前诊 断导致的不必要的流产致畸风险。 2、胎儿 RhD 血型判断。 RHD-的孕妇如果第二胎生育 RHD+的胎儿，就有可能引起胎儿红细胞破坏，进而出现 严重的贫血症状，所以对 RHD-孕妇产前胎儿的 RhD 血型检测非常重要，并对孕妇的抗 D 免疫球蛋白治疗方案有重要指导意义。胎儿游离 DNA 的方法很早就被应用于胎儿 RhD 血型 的检测。目前，此项技术的敏感度有了很大提高。Chinena 等对 97 名 RHD-的孕妇进行胎儿 RhD 血型检测，对 RHD 基因的第 7 外显子进行扩增，敏感度达到 100%，特异性 90.9%，假 阴性 0%。 3、妊娠相关疾病筛查。 一些学者研究发现，很多妊娠相关疾病都伴随胎儿游离 DNA 浓度的增加，如早产、先 兆子痫、妊娠剧吐、侵入性胎盘等。其中研究最多最深入的是先兆子痫。在先兆子痫患者中， 胎儿游离 DNA 的量高于正常孕妇，且胎儿游离 DNA 的升高使先兆子痫症状出现的时间提 前，而且升高的程度和先兆子痫的严重性相关。所以胎儿游离 DNA 可能是一种有应用价值 潜力的先兆子痫患者筛检物。 4、染色体疾病筛查。随着母血中 DNA 分离和检测技术的改进，胎儿游离 DNA 成为检测非 整倍体疾病的一项参考指标。 Go 等首先发现了母血浆中存在 21 号染色体特异表达 mRNA 片段 LOC90625，这为通 过定量检测 mRNA 的表达异常来筛查唐氏综合征提供了可能。Lau 等也在母血浆中发现了 位于 21 号染色体上胎盘特异表达的 PLCA4 基因片段。为了通过 mRNA 来说明 21 号染色体 含量上的差异，Lau 等选择了 PLCA4 编码区域一个 SNP 位点，由于在一个正常胎儿，人类 染色体的二倍体性使得杂合性 SNP 其等位基因含量比例将会出现 1：1，而对于一个 21-三 体患儿，其等位基因的含量比例将会为 1：2 或 2：1。因此可以用母血浆中胎盘表达的 mRNA 来无创性的评估胎盘细胞染色体含量的异常与否，也可以评估胎儿染色体数目异常与否。 前述 2005 年 Chim 等发现的在胎盘细胞中处于低甲基化状态而母血细胞中高甲基化状 态的 maspin 基因，为表观遗传学用于发展孕期通用的胎儿 DNA 标记奠定了基础，在此研 究思路下，Tong等通过对母血浆中maspin 基因进行表观遗传学检测并对低甲基化的maspin 基因序列上的等位基因进行了分析，由于 maspin 基因位于 18 号染色体，即可对 18-三体的 存在进行确认。 唐氏综合征由于其发病率高而备受人们关注，为了寻找 21 号染色体可用诊断的表观遗 传标记，Hultén 等采取了 3 种策略筛选差异甲基化的 DNA 序列：(1)在母血细胞和胎儿中高 度差异表达基因的启动子序列；(2)随机的启动子区域；(3)随机的非启动子区域。用甲基化特 异性限制性酶分析了 200 多个候选 DNA 序列，结果在 21q22.3 发现了 3 个差异甲基化序 列：AIRE、SIM2 和 ERG 基因。其中 AIRE 基因启动子区域的 CpG 位点是高度差异甲基化的
可作为无创性产前诊断唐氏综合征重要的候选表观遗传标记 5、单基因遗传病筛查。 单基因遗传病是我国常见出生缺陷的重要原因之一,较为常见且研究较多的有地中海贫 血、苯丙酮尿症、肝豆状核变性、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷、软骨发育不良、囊性纤维化 等。除部分单基因遗传病可通过手术加以矫正外,绝大部分是致死、致残、致畸性疾病,且 目前均无法治疗,产前诊断则是避免致死、致残、致畸性疾病胎儿出生的重要手段 在β珠蛋白生成障碍性贫血的诊断中, Galbiati等采用PNA针夹术(PNA- clamping),以 微电子芯片技术对32例孕妇诊断中通过检测7个常见的β珠蛋白突变得到100%的准确度 和983%的特异性,这一研究日后若应用于临床,将对出生前临床干预具有重大指导意义。 技术优缺点 优点 传统产前诊断方法一般采用羊膜腔穿刺、绒毛膜取样和脐静脉穿刺等,它们都具有创伤 性,有发生感染、出血甚至流产、死胎的可能 长久以来人们致力于利用孕妇外周血中存在的胎儿有核细胞进行无创性产前诊断,但由 于母体外周血中胎儿有核细胞极少,每毫升血中仅有1~2个,其分离、富集方法繁琐复杂 且价格昂贵,其临床应用至今不能推广。 孕妇外周血中胎儿游离DNA的发现为无创性产前诊断带来了新的希望,胎儿游离DNA 含量相对高,提取及分析过程简单,易于发展为可应用于临床的大样本高通量的检测方法。 抽取孕妇外周血检测胎儿游离DNA来进行产前诊断,无创伤取样,准确率高、灵敏度高、 特异性强,且结果不受母体孕周(孕12周后即可检测)、生育年龄等因素影响,不会对孕 妇及胎儿产生伤害。另外胎儿DNA分娩后很快被清除,不会受前次妊娠的影响。无创性产 前基因检测不仅能够提高检测的准确率与效率,而且消除了传统检测方法给亼们带来的精神 负担。 因此,对孕妇外周血中胎儿游离DNA的检测及其临床应用研究将对无创性产前诊断技 术的发展产生重大影响。同时,将基因组测序技术应用于临床诊断,也将更好地加强我国出 生缺陷的二级预防。 缺点 1、尽管胎儿游离DNA具有众多的优势,但仍存在一些问题有待解决,如胎儿游离D№A的 来源及清除机制还不甚清楚。 关于胎儿DNA的来源与释放机制研究 一般认为胎儿游离DNA释放到母血中的机制可能有以下3种 (1)胎儿有核细胞进入母体外周血后发生凋亡释放出游离DNA。 妊娠期进入母体血循环的胎儿细胞包括淋巴细胞、粒细胞和有核红细胞等。胎儿细胞有 穿越绒毛毛细血管内皮和滋养层基膜的现象,胎儿细胞在穿越胎盘时可能发生凋亡。因此孕 妇血浆中的游离胎儿DNA可来源于进入母体血的胎儿有核细胞。但无法解释母体外周血中 胎儿细胞很少而血浆中游离胎儿DNA含量丰富。 (2)胎儿DNA经母-胎界面进入母血 游离胎儿DNA在羊水中的浓度近乎于母体血浆中的200倍,推测浓度梯度可能导致 DNA分子的直接传输。虽然在脐血浆中可测得母源性DNA,但仅占胎儿血循环总游离DNA 的09%(0.2%~84%),而母血中胎儿游离DNA占母体血循环总游离DNA的143%(2.3% 54%),说明游离DNA虽可直接穿越胎盘屏障,但此来源的可能也很少。 (3)胎盘滋养层细胞凋亡后释放游离的胎儿DNA。该说法获得了较多的实验支持
可作为无创性产前诊断唐氏综合征重要的候选表观遗传标记。 5、单基因遗传病筛查。 单基因遗传病是我国常见出生缺陷的重要原因之一，较为常见且研究较多的有地中海贫 血、苯丙酮尿症、肝豆状核变性、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷、软骨发育不良、囊性纤维化 等。除部分单基因遗传病可通过手术加以矫正外，绝大部分是致死、致残、致畸性疾病，且 目前均无法治疗，产前诊断则是避免致死、致残、致畸性疾病胎儿出生的重要手段。 在β珠蛋白生成障碍性贫血的诊断中，Galbiati 等采用 PNA 钳夹术(PNA-clamping)，以 微电子芯片技术对 32 例孕妇诊断中通过检测 7 个常见的 β 珠蛋白突变得到 100%的准确度 和 98.3%的特异性，这一研究日后若应用于临床，将对出生前临床干预具有重大指导意义。 三、技术优缺点 优点： 传统产前诊断方法一般采用羊膜腔穿刺、绒毛膜取样和脐静脉穿刺等，它们都具有创伤 性，有发生感染、出血甚至流产、死胎的可能。 长久以来人们致力于利用孕妇外周血中存在的胎儿有核细胞进行无创性产前诊断，但由 于母体外周血中胎儿有核细胞极少，每毫升血中仅有 1～2 个，其分离、富集方法繁琐复杂， 且价格昂贵，其临床应用至今不能推广。 孕妇外周血中胎儿游离 DNA 的发现为无创性产前诊断带来了新的希望，胎儿游离 DNA 含量相对高，提取及分析过程简单，易于发展为可应用于临床的大样本高通量的检测方法。 抽取孕妇外周血检测胎儿游离 DNA 来进行产前诊断，无创伤取样，准确率高、灵敏度高、 特异性强，且结果不受母体孕周（孕 12 周后即可检测）、生育年龄等因素影响，不会对孕 妇及胎儿产生伤害。另外胎儿 DNA 分娩后很快被清除，不会受前次妊娠的影响。无创性产 前基因检测不仅能够提高检测的准确率与效率，而且消除了传统检测方法给人们带来的精神 负担。 因此，对孕妇外周血中胎儿游离 DNA 的检测及其临床应用研究将对无创性产前诊断技 术的发展产生重大影响。同时，将基因组测序技术应用于临床诊断，也将更好地加强我国出 生缺陷的二级预防。 缺点： 1、尽管胎儿游离 DNA 具有众多的优势，但仍存在一些问题有待解决，如胎儿游离 DNA 的 来源及清除机制还不甚清楚。 关于胎儿 DNA 的来源与释放机制研究： 一般认为胎儿游离 DNA 释放到母血中的机制可能有以下 3 种。 (1)胎儿有核细胞进入母体外周血后发生凋亡释放出游离 DNA。 妊娠期进入母体血循环的胎儿细胞包括淋巴细胞、粒细胞和有核红细胞等。胎儿细胞有 穿越绒毛毛细血管内皮和滋养层基膜的现象，胎儿细胞在穿越胎盘时可能发生凋亡。因此孕 妇血浆中的游离胎儿 DNA 可来源于进入母体血的胎儿有核细胞。但无法解释母体外周血中 胎儿细胞很少而血浆中游离胎儿 DNA 含量丰富。 (2)胎儿 DNA 经母-胎界面进入母血。 游离胎儿 DNA 在羊水中的浓度近乎于母体血浆中的 200 倍，推测浓度梯度可能导致 DNA 分子的直接传输。虽然在脐血浆中可测得母源性 DNA，但仅占胎儿血循环总游离 DNA 的 0.9%(0.2%～ 8.4%)，而母血中胎儿游离 DNA 占母体血循环总游离 DNA 的 14.3%(2.3%～ 64%)，说明游离 DNA 虽可直接穿越胎盘屏障，但此来源的可能也很少。 (3)胎盘滋养层细胞凋亡后释放游离的胎儿 DNA。该说法获得了较多的实验支持
胎盘滋养层是母体与胎儿之间进行物质交换的胎源组织,早期胚胎的滋养层发育很快 孕4周时滋养层间隙即被母血所充盈,滋养层细胞可侵入到子宫基层甚至充当子宫螺旋小 动脉的管壁,所以,合体滋养层细胞可直接深入母血中 许多研究表明整个正常妊娠期都存在着胎盘细胞的凋亡,晩期胎盘细胞的凋亡更加明显, 而且滋养层细胞占凋亡细胞的大多数(>50%)。滋养层细胞的不断凋亡对胎盘的正常发育、维 持胎盘的组织结构和功能完整性具有重要作用。 妊娠最早期的胎盘形成处于相对缺氧的环境,最近的研究发现缺氧使滋养细胞凋亡增加, 释放含有DNA的膜包裹凋亡小体。先兆子痫的患者由于胎盘浅着床而导致绒毛滋养细胞缺 氧损伤,进而诱发大量绒毛滋养细胞凋亡。 胎盘滋养层细胞在正常生理和病理状况下的凋亡和损伤是母血中胎儿DNA的重要来源 2、针对染色体疾病筛查,该方法目前因费用高,还不能广泛应用普及;同时此技术只能检 测胎儿染色体拷贝数异常,对于染色体中的嵌合体、易位型、微缺失、微重复等结枃异常则 不能检出,这将是研究者们今后努力的方向 3、需要寻找更多的胎源性DNA标记物来诊断临床众多的遗传病及妊娠相关疾病。 参考文献 []王文博张毅孙树汉孕妇外周血中胎儿游离DNA在产前诊断中的应用[第二军医大学学 报2009,3004)442-446 巴2]陆海燕郑建丽杨芳芳许孟军,管永娟周云,张晔季叶霞王凤施阳宁孕妇外周血胎儿游离 DNA检测在无创性产前诊断中的应用]中国优生与遗传杂志201422(10)78-79+8 3]王靖陈汉平母体外周血中的游离胎儿核酸物质在无创性产前诊断中的研究进展口]中国 优生与遗传杂志,2010,18(11)3-5 [ 4Bischoff F Z, Lewis D E, Simpson ]L. Cell free fetal DNA in maternal blood: kinetics, source and tructure[]. Hum Reprod Update, 2005, 11: 59-67 15 Anger R M, LeShane Es, Lo Y M, Chan LY, Delli-Bovi L C, Bianchi d W. Fetal cell-free plasma DNA concentrations in maternal blood are stable 24 hours after collection analysis of first and third-trimester samples[]. Clin Chem, 2003, 49: 195-198 [6] LamNY, Rainer TH, Chiu RW, Lo YM.EDTA isa better an-ticoagulant than heparin or citrate for delayed blood processing for plasma DNa analysis[]. Clin Chem, 2004, 50: 256-25 [7 ChimSS, Tong Y K, ChiuR W, Lau T K, Leung T N, Chan LY, et al. Detection of the placental epigenetic signature of the maspin gene in maternal plasma[j]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005. 102:14753-14758 [8 Bartha]L, Finning K, Soothill P W. Fetal sex determination from maternal blood at 6 weeks of gestation when at risk for 21-hydroxylase deficiency [].Obstet Gynecol, 2003, 101(5 Pt 2):1135-1136 9 Tong Y K, Ding C M, Chiu R W K, Gerovassili A, Chim SS C, Leung TY, et al. Noninvasive prenatal detection of fetal trisomy 18 by epigenetic allelic ratio analysis in maternal plasma Theoretical and empirical considerations [J]. Clin Chem, 2006, 52: 2194-2202 [10] Galbiati S, Foglieni B, Travi M, Curcio C, Restagno G, Sbaiz L, et al. Peptide-nucleic acid mediated enriched polymerase chain reaction as a key point for non-invasive prenatal diagnosis of beta-thalassemiap] Haematologica, 2008, 93: 610-614
胎盘滋养层是母体与胎儿之间进行物质交换的胎源组织，早期胚胎的滋养层发育很快， 孕 4 周时滋养层间隙即被母血所充盈，滋养层细胞可侵入到子宫基层甚至充当子宫螺旋小 动脉的管壁，所以，合体滋养层细胞可直接深入母血中。 许多研究表明整个正常妊娠期都存在着胎盘细胞的凋亡，晚期胎盘细胞的凋亡更加明显， 而且滋养层细胞占凋亡细胞的大多数(> 50%)。滋养层细胞的不断凋亡对胎盘的正常发育、维 持胎盘的组织结构和功能完整性具有重要作用。 妊娠最早期的胎盘形成处于相对缺氧的环境，最近的研究发现缺氧使滋养细胞凋亡增加， 释放含有 DNA 的膜包裹凋亡小体。先兆子痫的患者由于胎盘浅着床而导致绒毛滋养细胞缺 氧损伤，进而诱发大量绒毛滋养细胞凋亡。 胎盘滋养层细胞在正常生理和病理状况下的凋亡和损伤是母血中胎儿 DNA 的重要来源。 2、针对染色体疾病筛查，该方法目前因费用高，还不能广泛应用普及；同时此技术只能检 测胎儿染色体拷贝数异常，对于染色体中的嵌合体、易位型、微缺失、微重复等结构异常则 不能检出，这将是研究者们今后努力的方向。 3、需要寻找更多的胎源性 DNA 标记物来诊断临床众多的遗传病及妊娠相关疾病。 参考文献： [1]王文博,张毅,孙树汉.孕妇外周血中胎儿游离 DNA 在产前诊断中的应用[J].第二军医大学学 报,2009,30(04):442-446. [2]陆海燕,郑建丽,杨芳芳,许孟军,管永娟,周云,张晔,季叶霞,王凤,施阳宁.孕妇外周血胎儿游离 DNA 检测在无创性产前诊断中的应用[J].中国优生与遗传杂志,2014,22(10):78-79+8. [3]王靖,陈汉平.母体外周血中的游离胎儿核酸物质在无创性产前诊断中的研究进展[J].中国 优生与遗传杂志,2010,18(11):3-5. [4]Bischoff F Z, Lewis D E, Simpson J L. Cell free fetal DNA in maternal blood: kinetics,source and tructure[J]. Hum Reprod Update, 2005, 11:59-67. [5] Angert R M, LeShane E S, Lo Y M, Chan L Y, Delli-Bovi L C, Bianchi D W. Fetal cell-free plasma DNA concentrations in maternal blood are stable 24 hours after collection analysis of first and third-trimester samples[J]. Clin Chem, 2003, 49:195-198. [6] Lam N Y, Rainer TH,Chiu RW, Lo YM.EDTA isa better an- ticoagulant than heparin or citrate for delayed blood processing for plasma DNA analysis[J]. Clin Chem, 2004, 50:256-257. [7] Chim S S, Tong Y K, Chiu R W, Lau T K, Leung T N, Chan L Y, et al. Detection of the placental epigenetic signature of the maspin gene in maternal plasma[ J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102:14753-14758. [8] Bartha J L, Finning K, Soothill P W. Fetal sex determination from maternal blood at 6 weeks of gestation when at risk for 21-hydroxylase deficiency[J].Obstet Gynecol, 2003, 101(5 Pt 2):1135-1136. [9] Tong Y K, Ding C M, Chiu R W K, Gerovassili A, Chim S S C, Leung T Y, et al. Noninvasive prenatal detection of fetal trisomy 18 by epigenetic allelic ratio analysis in maternal plasma: Theoretical and empirical considerations [ J]. Clin Chem, 2006, 52:2194-2202. [10] Galbiati S, Foglieni B, Travi M, Curcio C, Restagno G, Sbaiz L, et al. Peptide-nucleic acidmediated enriched polymerase chain reaction as a key point for non-invasive prenatal diagnosis of beta-thalassemia[J]. Haematologica, 2008, 93:610-614