植物遗传学实验指导书二〇一八年九月
植物遗传学实验指导书 二〇一八年九月
实验一植物细胞有丝分裂染色体制片与观察一、实验目的学习和掌握植物细胞有丝分裂制片技术；观察植物细胞有丝分裂过程中染色体的形态特征及染色体的动态行为变化：学会通过染色体形态辨认有丝分裂的各个时期。二、实验原理有丝分裂是植物体细胞进行的一种主要分裂方式。通过有丝分裂，细胞的数量得以增加，植物有机体才能不断生长。一般来讲，植物细胞要经过十几个小时的间期，而分裂期只有2-3h。经过间期的复制细胞的每一条染色体都获得了一份拷贝，一个复合着丝粒上附着了两个完全一样的姊妹染色单体。在细胞分裂的后期，这两条姊妹染色单体会被分别分配到两个子细胞中去，从而形成在遗传组成上完全一样的两个细胞。依据染色体在细胞中的形态变化和行为特征可以将分裂期分为前期、中期、后期和未期四个时期（图1-1）。前期，细胞核内出现细长而卷曲的染色体，两极出现纺锤丝：中期，各个染色体的着丝点均排列在细胞中央的赤道板上，纺锤丝已经附着在染色体的着丝粒上，此时染色体具有典型的形态，此期是采用适当的制片技术进行染色体鉴别和染色体计数的最佳时期；后期，着丝点分裂为二，娣妹染色单体在纺锤丝的牵引下开始向细胞两极移动；末期，染色体到达两极，染色体又变得松散细长，核仁重新出现，形成新的细胞壁，分裂为两个细胞
实验一 植物细胞有丝分裂染色体制片与观察 一、 实验目的 学习和掌握植物细胞有丝分裂制片技术；观察植物细胞有丝分裂 过程中染色体的形态特征及染色体的动态行为变化；学会通过染色体 形态辨认有丝分裂的各个时期。 二、 实验原理 有丝分裂是植物体细胞进行的一种主要分裂方式。通过有丝分裂， 细胞的数量得以增加，植物有机体才能不断生长。一般来讲，植物细 胞要经过十几个小时的间期，而分裂期只有 2-3 h。经过间期的复制， 细胞的每一条染色体都获得了一份拷贝，一个复合着丝粒上附着了两 个完全一样的姊妹染色单体。在细胞分裂的后期，这两条姊妹染色单 体会被分别分配到两个子细胞中去，从而形成在遗传组成上完全一样 的两个细胞。 依据染色体在细胞中的形态变化和行为特征可以将分裂期分为前 期、中期、后期和末期四个时期（图 1-1）。前期，细胞核内出现细长 而卷曲的染色体，两极出现纺锤丝；中期，各个染色体的着丝点均排 列在细胞中央的赤道板上，纺锤丝已经附着在染色体的着丝粒上，此 时染色体具有典型的形态，此期是采用适当的制片技术进行染色体鉴 别和染色体计数的最佳时期；后期，着丝点分裂为二，姊妹染色单体 在纺锤丝的牵引下开始向细胞两极移动；末期，染色体到达两极，染 色体又变得松散细长，核仁重新出现，形成新的细胞壁，分裂为两个 细胞
晚前期早前期间期末期中期后期图1-1洋葱根尖细胞有丝分裂染色体形态植物有丝分裂主要在根尖、茎尖的生长点、节间及其他分生组织里进行。因此，将生长旺盛的植物分生组织经过固定、解离、染色、压片等处理即可以观察到细胞内有丝分裂的图像。植物的根尖中只有一小部分区域是处于旺盛的有丝分裂阶段的分生区（1-2）。如果需要清晰地看到每一条染色体并进行染色体计数，则需进行预处理，取材之后采用物理或化学的方法，阻止细胞分裂过程中纺锤体的形成，使细胞分裂停止在中期，这时染色体不排列到赤道板上，而是分散在整个细胞质中，十分便于对染色体的形态和数目进行观察。仲长区分生区根冠图1-2洋葱根尖的结构
图 1-1 洋葱根尖细胞有丝分裂染色体形态 植物有丝分裂主要在根尖、茎尖的生长点、节间及其他分生组织 里进行。因此，将生长旺盛的植物分生组织经过固定、解离、染色、 压片等处理即可以观察到细胞内有丝分裂的图像。植物的根尖中只有 一小部分区域是处于旺盛的有丝分裂阶段的分生区（1-2）。如果需要 清晰地看到每一条染色体并进行染色体计数，则需进行预处理，取材 之后采用物理或化学的方法，阻止细胞分裂过程中纺锤体的形成，使 细胞分裂停止在中期，这时染色体不排列到赤道板上，而是分散在整 个细胞质中，十分便于对染色体的形态和数目进行观察。 图 1-2 洋葱根尖的结构
对根尖组织进行染色体压片，是观察植物染色体最常用的方法，也是研究染色体组型、染色体分带、染色体畸变和姊妹染色单体交换的基础。三、实验材料以蚕豆(Viclafaba2n=12)根尖为实验材料。四、实验用品1.试剂95%乙醇、冰醋酸、卡宝品红、1mol/LHCl、秋水仙素、对二氯苯和8-羟基喹啉。2.器材及用具培养皿、量筒、恒温培养箱、水浴锅、载玻片、盖玻片、单面刀片、镊子、吸水纸、显微镜。四、实验步骤与方法1.生根植物根尖是植物的分生组织，取材容易，操作方便。植物根尖细胞分裂旺盛，因此，它是细胞有丝分裂相制备与观察的理想选取部位。蚕豆种子可先用温水浸泡1d后，再转入铺有多层吸水纸或纱布的培养血中，上面盖双层湿纱布置于24～26℃温箱中培养，每天换水二次。2.取材待蚕豆根长至1.5~2.0cm时，将其取下。如果实验只观察细胞有丝分裂的过程和各时期的特征，可将根尖直接放入Carnoy固定液（95%乙醇：冰乙酸=3：1，现配现用）中固定。如果要观察染色体形态和数目，则必须对根尖进行前处理（预处理）后才能固定。取材和固定必须在细胞分裂高峰期进行，即分裂细胞占细胞总数最大值时进行，便于选择和观察。3.前处理
对根尖组织进行染色体压片，是观察植物染色体最常用的方法， 也是研究染色体组型、染色体分带、染色体畸变和姊妹染色单体交换 的基础。 三、实验材料 以蚕豆(Vicla faba 2n=12)根尖为实验材料。 四、实验用品 1. 试剂 95%乙醇、冰醋酸、卡宝品红、l mol／L HCl、秋水仙素、对二氯 苯和 8-羟基喹啉。 2．器材及用具 培养皿、量筒、恒温培养箱、水浴锅、载玻片、盖玻片、单面刀 片、镊子、吸水纸、显微镜。 四、实验步骤与方法 1．生根 植物根尖是植物的分生组织，取材容易，操作方便。植物根尖细 胞分裂旺盛，因此，它是细胞有丝分裂相制备与观察的理想选取部位。 蚕豆种子可先用温水浸泡 1d 后，再转入铺有多层吸水纸或纱布的培养 皿中，上面盖双层湿纱布置于 24～26℃温箱中培养，每天换水二次。 2．取材 待蚕豆根长至 l.5~2.0 cm 时，将其取下。如果实验只观察细胞有 丝分裂的过程和各时期的特征，可将根尖直接放入Carnoy固定液（95％ 乙醇：冰乙酸=3：1，现配现用）中固定。如果要观察染色体形态和数 目，则必须对根尖进行前处理（预处理）后才能固定。取材和固定必 须在细胞分裂高峰期进行，即分裂细胞占细胞总数最大值时进行，便 于选择和观察。 3．前处理
一般采用低温处理和化学药剂处理的方法，可以降低细胞质的黏度，使染色体缩短分散，防止纺锤体形成，使更多的细胞处于有丝分裂中期，便于进行染色体计数。（1）低温处理：将取材的蚕豆根尖放入盛有蒸馏水的烧杯内，放置于4℃冰箱中处理24h。不同的植物对低温的敏感程度不同，效果也不同。（2）化学药剂处理：常用药剂有0.05%-0.1%的秋水仙素水溶液；饱和对二氯苯溶液：0.002-0.004mol/L8-羟基喹啉等。秋水仙素溶液对纺继体的抑制效果最好，一般在室温条件下处理2-4h可达到理想的效果。如果处理时间过长，染色体会变得太短，不利于对染色体结构的研究。对二氯苯和8-轻基喹琳对不同的植物效果也不相同。植物染色体数目多，个体小的适合使用对二氯苯，而染色体中等长度的更适合于8-羟基喹啉，同时能使缢痕区更为清晰。4.固定固定是借助化学药品的作用，使细胞保持原有形态、结构的一种手段。植物常用的固定剂是Carnoy固定剂，是用95%的乙醇和冰乙酸按照3：1的比例配制成。固定的时间可根据被固定的材料大小而定，一般根尖组织固定424h可达到固定效果，但固定时间不易过长，否则易使材料变脆、变硬，给实验操作带来一定困难。固定材料可以转入70%酒精内于4℃冰箱中保存，保存时间最好不超过2个月。5.解离解离的目的是使分生组织细胞间的果胶质分解，细胞壁软化或部分分解，使制片过程中细胞和染色体容易分散压平。将1mol/LHCI放在60℃恒温水浴锅中预热，再将根尖放入HC溶液中解离4-5min。解离时间应严格控制，若解离时间过长，分生组织会与伸长区脱离，使得分生区解离过软，很难操作，且染色效果不好。6.漂洗解离后的材料要用蒸溜水冲洗3～5次。漂洗时一定要洗净，否则会影响染色效果。7.染色与压片
一般采用低温处理和化学药剂处理的方法，可以降低细胞质的黏 度，使染色体缩短分散，防止纺锤体形成，使更多的细胞处于有丝分 裂中期，便于进行染色体计数。 （1）低温处理：将取材的蚕豆根尖放入盛有蒸馏水的烧杯内，放 置于 4℃冰箱中处理 24 h。不同的植物对低温的敏感程度不同，效果 也不同。 （2）化学药剂处理：常用药剂有 0.05%-0.1%的秋水仙素水溶液； 饱和对二氯苯溶液；0.002-0.004mol/L 8-羟基喹啉等。秋水仙素溶液对 纺缍体的抑制效果最好，一般在室温条件下处理 2-4h 可达到理想的效 果。如果处理时间过长，染色体会变得太短，不利于对染色体结构的 研究。对二氯苯和 8-羟基喹啉对不同的植物效果也不相同。植物染色 体数目多，个体小的适合使用对二氯苯，而染色体中等长度的更适合 于 8-羟基喹啉，同时能使缢痕区更为清晰。 4．固定 固定是借助化学药品的作用，使细胞保持原有形态、结构的一种 手段。植物常用的固定剂是 Carnoy 固定剂，是用 95％的乙醇和冰乙酸 按照 3：1 的比例配制成。固定的时间可根据被固定的材料大小而定， 一般根尖组织固定 4～24h 可达到固定效果，但固定时间不易过长，否 则易使材料变脆、变硬，给实验操作带来一定困难。固定材料可以转 入 70%酒精内于 4℃冰箱中保存，保存时间最好不超过 2 个月。 5. 解离 解离的目的是使分生组织细胞间的果胶质分解，细胞壁软化或部 分分解，使制片过程中细胞和染色体容易分散压平。将 l mol／L HCl 放在 60℃恒温水浴锅中预热，再将根尖放入 HCl 溶液中解离 4-5min。 解离时间应严格控制，若解离时间过长，分生组织会与伸长区脱离， 使得分生区解离过软，很难操作，且染色效果不好。 6．漂洗 解离后的材料要用蒸溜水冲洗 3～5 次。漂洗时一定要洗净，否则 会影响染色效果。 7．染色与压片
用刀片切去根冠及伸长区部分，只留下分生区置于载玻片上，先用镊子将分生组织碾碎，尽量铺开。再滴上卡宝品红染液，染色5min左右。压片时盖上盖玻片，用手固定住盖玻片，手指用力按压盖玻片，再用铅笔的橡皮头轻轻敲打有材料的部位，使细胞铺展成薄薄的一层。8.镜检压好的片子要先放在10×物镜下观察，找到不同分裂时期的典型细胞分裂相，然后转到40×高倍镜观察，判断细胞的分裂时期。五、作业参照显微镜的观察结果，绘制植物根尖细胞有丝分裂过程不同分裂时期典型的细胞及染色体的生物图
用刀片切去根冠及伸长区部分，只留下分生区置于载玻片上，先 用镊子将分生组织碾碎，尽量铺开。再滴上卡宝品红染液，染色 5 min 左右。压片时盖上盖玻片，用手固定住盖玻片，手指用力按压盖玻片， 再用铅笔的橡皮头轻轻敲打有材料的部位，使细胞铺展成薄薄的一层。 8．镜检 压好的片子要先放在 10×物镜下观察，找到不同分裂时期的典型 细胞分裂相，然后转到 40×高倍镜观察，判断细胞的分裂时期。 五、作业 参照显微镜的观察结果，绘制植物根尖细胞有丝分裂过程不同分 裂时期典型的细胞及染色体的生物图
实验二染色体核型分析一、实验目的掌握染色体核型分析方法，为细胞遗传学和作物育种学研究奠定基础。二、实验原理各种生物染色体的形态、结构和数目都是相对稳定的。我们可以通过显微镜观察到物种染色体的基本特征，而在光学显微镜下可测定的染色体的表型特征的总称称之为染色体核（组）型，一般包括染色体数目、大小、形态及结构。染色体核（组）型是物种特有的染色体信息之一，各种动植物的体细胞都有其特定的染色体组型，具有很高的稳定性和再现性。染色体核（组）型分析就是对染色体组中的染色体作上述各种形态特征的描述，选用分裂旺盛细胞的有丝分裂中期的染色体制成染色体组型图，测定各染色体的长度（微米）或相对长度（%），着丝粒位置及染色体两臂长的比例（臂比），观察随体及副继痕的有无。染色体核（组）型分析可以鉴别出染色体结构和数自变异，是细胞遗传学研究中的基本方法，也是研究物种的起源、生物的遗传与进化、细胞遗传学和现代分类学的重要手段之一。本实验是在获得清晰染色体显微照片的基础上，对染色体进行测量、配对、排列并最终得出核型公式，得到较为完整的染色体核型信息。三、实验材料洋葱（Alliuncepa，2n=16）细胞有丝分裂中期染色体玻片标本
实验二 染色体核型分析 一、 实验目的 掌握染色体核型分析方法，为细胞遗传学和作物育种学研究奠定 基础。 二、 实验原理 各种生物染色体的形态、结构和数目都是相对稳定的。我们可以 通过显微镜观察到物种染色体的基本特征，而在光学显微镜下可测定 的染色体的表型特征的总称称之为染色体核（组）型，一般包括染色 体数目、大小、形态及结构。染色体核（组）型是物种特有的染色体 信息之一，各种动植物的体细胞都有其特定的染色体组型，具有很高 的稳定性和再现性。 染色体核（组）型分析就是对染色体组中的染色体作上述各种形 态特征的描述，选用分裂旺盛细胞的有丝分裂中期的染色体制成染色 体组型图，测定各染色体的长度（微米）或相对长度（％），着丝粒位 置及染色体两臂长的比例（臂比），观察随体及副缢痕的有无。 染色体核（组）型分析可以鉴别出染色体结构和数目变异，是细 胞遗传学研究中的基本方法，也是研究物种的起源、生物的遗传与进 化、细胞遗传学和现代分类学的重要手段之一。 本实验是在获得清晰染色体显微照片的基础上，对染色体进行测 量、配对、排列并最终得出核型公式，得到较为完整的染色体核型信 息。 三、 实验材料 洋葱（Alliun cepa，2n=16) 细胞有丝分裂中期染色体玻片标本
要求：染色体分散良好，无重叠或重叠很少，着丝粒、随体等形态清晰可辨。四、实验用品剪刀、胶水、镊子、白纸、圆规、坐标纸、毫米尺、计算器、铅笔。五、实验步骤与方法1.测量利用放大的显微照片进行染色体测量和描述，记录染色体测量数据。有随体的染色体，随体长度可不计入总长度之内，但应该备注说明。弯曲的染色体可用细线辅助测量。2. 配对根据测量数据，比较染色体的形态和大小、次痕的有无和位置、随体的形态和大小等，进行同源染色体配对。3.染色体排列将配对的染色体按由大到小的顺序进行排列并编号。对于等长的染色体，以短臂长的在前，有特殊标记的染色体（如含有随体的）及性染色体排在最后。4.染色体核型参数表染色体经配对并编号排列后即可根据所测量数据换算核型参数并完成核型参数表。根据染色体长度测量结果，计算出染色体的相对长度、臂比和着丝粒。臂比=长臂/短臂染色体组总长度=该细胞单倍体全部染色体长度之和相对长度=每一个染色体的长度/染色体组总长度
要求：染色体分散良好，无重叠或重叠很少，着丝粒、随体等形 态清晰可辨。 四、实验用品 剪刀、胶水、镊子、白纸、圆规、坐标纸、毫米尺、计算器、铅 笔。 五、实验步骤与方法 1. 测量 利用放大的显微照片进行染色体测量和描述，记录染色体测量数 据。有随体的染色体，随体长度可不计入总长度之内，但应该备注说 明。弯曲的染色体可用细线辅助测量。 2. 配对 根据测量数据，比较染色体的形态和大小、次缢痕的有无和位置、 随体的形态和大小等，进行同源染色体配对。 3. 染色体排列 将配对的染色体按由大到小的顺序进行排列并编号。对于等长的 染色体，以短臂长的在前，有特殊标记的染色体（如含有随体的）及 性染色体排在最后。 4. 染色体核型参数表 染色体经配对并编号排列后即可根据所测量数据换算核型参数并 完成核型参数表。根据染色体长度测量结果，计算出染色体的相对长 度、臂比和着丝粒。 臂比=长臂/短臂 染色体组总长度=该细胞单倍体全部染色体长度之和 相对长度=每一个染色体的长度/染色体组总长度
表2-1染色体臂比与着丝粒位置和染色体类型的关系臂比（长臂/短臂）着丝粒的位置染色体类型1M正中部着丝粒1.01-1.70中部着丝粒m近中部着丝粒1.71-3.00smst3.01-7.00近端部着丝粒t>7.01端部着丝粒计算以上各参数则可填写染色体核型分析参数表（表2-2）：表2-2染色体核型分析参数表染色体染色体照相长度（mm）臂比备注相对长度编号长臂短臂全长类型123456785.制作核型图剪下显微照片上的每一条染色体，按照已确定的同源关系和序号，粘贴在坐标纸上，粘贴时应使着丝粒处于同一水平线上。短臂向上，长臂向下。此即为该细胞的核型图（Karyogram)。有条件的也可进行翻拍
表 2-1 染色体臂比与着丝粒位置和染色体类型的关系 臂比（长臂/短臂） 着丝粒的位置 染色体类型 1 正中部着丝粒 M 1.01-1.70 中部着丝粒 m 1.71-3.00 近中部着丝粒 sm 3.01-7.00 近端部着丝粒 st ＞7.01 端部着丝粒 t 计算以上各参数则可填写染色体核型分析参数表（表 2-2）： 表 2-2 染色体核型分析参数表 染色体 编号 照相长度（mm） 相对长度 臂比 染色体 类型 备注 长臂 短臂 全长 1 2 3 4 5 6 7 8 . . 5. 制作核型图 剪下显微照片上的每一条染色体，按照已确定的同源关系和序号， 粘贴在坐标纸上，粘贴时应使着丝粒处于同一水平线上。短臂向上， 长臂向下。此即为该细胞的核型图（Karyogram)。有条件的也可进行 翻拍
6.制作核型模式图根据核型参数表中染色体相对长度的数值，可利用坐标纸或者利用excel软件绘制核型模式图。核型模式图要求各个染色体依横坐标方向按序号排列，纵坐标零点与着丝粒对应，横坐标与纵坐标交叉于纵坐标最小值（图2-1）。%0910111235图2-1核型模式图7.核型公式综合核型分析的结果，将物种核型的主要特征以公式表示。例如玉米(zeaMays)2n=2x=20=10m+10sm(2SAT)8.核型分类Stebbins(1971)参照生物界现有的核型资料，根据核型中染色体长度比和臂比两项主要特征，用以区分核型的对称和不对称程度，并将其分为12种类型（表3）。表2-3染色体核型对称性分类臂比大于2：1的染色体的百分比最长/最短00.010.50.51—0.9911A4A小于2：12A3A1B2 B3 B4B(2-4):1大于4：11C2C3C4C在表2-3中，1A为最对称核型，4C为最不对称核型。该分类法在分析和讨论核型进化方面是有参考价值的
6. 制作核型模式图 根据核型参数表中染色体相对长度的数值，可利用坐标纸或者利 用 excel 软件绘制核型模式图。核型模式图要求各个染色体依横坐标方 向按序号排列，纵坐标零点与着丝粒对应，横坐标与纵坐标交叉于纵 坐标最小值（图 2-1）。 7. 核型公式 综合核型分析的结果，将物种核型的主要特征以公式表示。例如 玉米(zeaMays)2n=2x=20=10m+10sm(2SAT) 8. 核型分类 Stebbins(1971)参照生物界现有的核型资料，根据核型中染色体长 度比和臂比两项主要特征，用以区分核型的对称和不对称程度，并将 其分为 12 种类型（表 3）。 表 2-3 染色体核型对称性分类 最长/最短 臂比大于 2： 1 的染色体的百分比 0 0.01—0.5 0.51 —0.99 1 小 于 2 ： 1 1A 2A 3A 4A ( 2 - 4 ) ： 1 1 B 2 B 3 B 4 B 大 于 4 ： 1 1 C 2 C 3 C 4 C 在表 2-3 中，1A 为最对称核型，4C 为最不对称核型。该分 类法在分析和讨论核型进化方面是有参考价值的。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 图 2-1 核型模式图