第26卷第1期 核技术 Vol. 26. No. 1 2003年1月 NUCLEAR TECHNIQUES January 2003 揭示生命能量之源 —ATP合酶三维结构的同步辐射研究 田亮张新夷 (复旦大学同步辐射研究中心上海200433) 摘要在英国 Daresbury同步辐射实验室获得的线粒体F1- ATPase原子分辨率(0.28nm)的三维结构是1997年诺 贝尔化学奖成果之一,并且是第一个基于同步辐射研究而获得诺贝尔奖的研究成果。同步辐射具有的高通量、高 准直性以及波长连续可调等优点必将会在已经到来的后基因组时代发挥巨大的作用。 关键词同步辐射,生物大分子,ATP合酶,三维结构 中图分类号Q71 在英国CLRC( Central Laboratory of the Re- X射线源相比,同步辐射源产生的射线具有高通量、 search councils), Daresbury同步辐射实验室(Sym-高准直性以及波长连续可调等优点(参见图2),应 chrotron radiation Department)出版的1997年年报用于生物大分子晶体衍射将可以解决很多常规实验 中,当时任实验室主任的 David norman这么写道:装置无法解决的问题,主要有如下几点 “久负盛名的诺贝尔奖并不经常光顾英国,所以当在 英国 Daresbury实验室所完成的一项研究成果获得 诺贝尔奖后是如此的令人激动不已。英国剑桥医学 开究委员会( Medical Research Council)分子细胞实 验室的 John Walker与美国科学家 Paul Boyer因为 对细胞能量产生中的一种核心酶—ATP合酶所进 毒 行的开创性研究工作而共同分享了1997年诺贝尔 化学奖。经过12年的不懈努力, John Walker在 Daresbury实验室,与同事们一起利用同步辐射X射 图1牛心线粒体F1- ATPase不同视角下 线衍射技术,得到了(0.28m原子分辨率的)F 的品体结构示意图( (0.28mm) ATPase三维结构(如图1所示),证实了 Boyer提 数据收集于英国 Daresbury同步辐射实验室, F1- ATPase晶体结构PDB代码为1BMF 的关于ATP(三磷酸腺苷)是如何由ADP(二磷酸腺 侧视,右:从底部观察 苷)和P无机磷酸盐)形成的机理。 Fig. 1 The crystal structure of mitochondrial FI-ATPase determined with 0. 28nm resolution using data collected 这项成果不但对结构生物学而且对同步辐射研 at the SRS, Daresbury, UK. PDB accession code 1BMF 究本身来说都有极其重要的意义(2。作为第一个基 Left: Side view, Right: View from the bottom j 于同步辐射的研究而获得诺贝尔奖的研究成果,国 (1)大分子晶体对射线的衍射能力相对于小分 际晶体学会(IUCr)刊物《 Journal of Synchrotron Ra-子晶体弱得多,常规光源测定分子量超过几十万,甚 diation)给予了很高的评价,并认为随着诺贝尔奖授至几百万道尔顿的超分子复合体时,X射线干涉距 予 John Walker利用同步辐射所进行的研究工作,必离非常大,造成衍射斑点不尖锐,空间分辨率不够, 将会使正在到来的同步辐射时代的发展进一步得到且衍射数据不易收集;同步辐射光源的高通量及高 加强和提高 准直性,可以显著的提高晶体衍射分辨率,数据精度 近年来国际上利用同步辐射光源在膜蛋白、病明显优于常规光源。 毒、核糖体结构以及其它在生物学上具有重要意义 (2)蛋白质晶体的培养目前仍找不到内在规 的大分子结构几个方面开展了大量的研究工作,并律,依然是整个X射线衍射测量方法的瓶颈所在。 已经得到了一批很重要的研究结果。与常规的转靶对于有重要意义的大分子晶体而言,难以提供用常 一作者:田亮,男,1976年11月出生,复且大学在读硕士研究生,凝聚态物理专业 收稿日期:2002-12-03
~26 ~ ~ 1 AA ~ Vol. 26, No.1 it * 2003 1f: 1 Ji NUCLEAR TECHNIQUES January 2003 tEl - J+- A. A~ E:I , ~Ji5' 11Zg ::t:. RP fj~.m Z 11,l' -ATP Il-£1 *tJ fiiJ tI7 *I ~t iiJf ~ \fl 1E *t!f~ ( ~.E!.*~1PJ 84MMWf1E9=t'L' J:.#J 200433) 1llr~ tE~ OO Daresbury ~tVmM~~*ttH~I¥.J~t'L-f* FJ - ATPase ~T5tm$(O. 28nm) l¥.J .=: gi~#g~ 19971f:* m~~~~~*Z ,#~~~ ~~T~tVmM~~W~~*m~~I¥.J~~~* o ~tVmMA~I¥.J~~.,~ ~~tt~&.*~~~~.~~~~~tEB~~*I¥.J§~~m~~~~§*I¥.J~mo ~.~ ~tVmM ,~!fm*5tT , ATP itM ,.=:gi~f~ qt\ll~~~ Q71 {E * 00 CLRC ( Central Laboratory of the Research Councils) ,Daresbury IPJ tV m M ( Synchrotron radiation Department) ill JflR B9 1997 1f: 1f: * 9=t , Btif ± if B9 David Norman )!,z,. Eg :iJ! : "!At!! ~~ B9it.D:! ~#~~1itJ'tJ®r* 00 ,Yf lV. {E *oo~re~~~~~Yf%~B9 ~~~~*~m *.D:!~~€~~~B9~A.~~B o *oo~m~~ ~~~~ ~(Medical Research Council) ?t-=f~J1E!~ ~~B9 John Walker l=5 00 f4 * Paul Boyer ~-Jg xt~J1E! ~~.F!£ 9=t B9-f* JL' fH-ATP itfHJW;itt frB97f,g~'Ij:~~IfFmJ~IPJ?t* T 1997 1f:itJJ1 ~ 1t~ ~o it 12 1f: B9 I/J:g JJ ,John Walker {E Daresbury ~~~ ,l=51PJ $1f1- ®flJffl lPJ tVm M X M ~JHrr Mit* , ~~ j1J T ( O. 28 nm )]'{ -=f5t m.$ B9 ) F1 - ATPase .:=. tt~#J ( ~ll 00 1 JW7f\) ,liE~ T Boyer tlill B9*T ATP( .:=. ~~~tr) ~~ll1ilJEE ADP( =~~~ tr )fll Pi(7Cm~~~)lB~B9fJlJlI![l J 0" )!~~*~@~~#J!£~~mJ~~lPJtVmM~ ~*~*iJtt~1f;fltltm~B9~)( [2J 0 fF-Jg~ 1'£ TlPJtVmMB9~~ mJ ~m*JJ1~~B9~~~*,OO ~~f*~~ (IUCr) f!J~ Journal of Synchrotron Radiation %S-T ~~B9if1fr ,#iA-JgmR~it JJ1 ~~f1 -T John Walker JffllPJtVmMJW;itt1-TB9~~IfF, 16' ~~~~{E~*B9lPJtVmM~~B9~~;itt tVm~ :b 5.ifll~~[3 J 0 JlI1f:*, OO~.t.flJffllPJtVmMJ't~{EJmmEI,~ ~,~~f*~#JlV.~~B{E!£~~.t.A1fm~~)( B9*?t-=f~#J~1'nOO7f~T*.B9~~IfF,# B~m~ T-m*m~B9~~~* o l=51it~B9ff~ X ~t~~f§ tt, IPJtVmM~F!£B9M~A1f~ji., ~{1El[,/ilV.~~*~~mlJJ~if[;}~ (~~oo 2) ,ill fflT!£~*5t-=f~f*mM~mlV.m~*~1itm~~ ~:i:7C~.~B9Ill]»!, ±~~~ll~~J~: \11 1 Lf::JL'~t'L-f* Fl - ATPase ~~tJt jfl ~ 1¥.J~-f*~~~~OO 0.28nm ) ~M1&~T~OO Daresbury ~tVm ~~*, FJ - ATPase ~-f*~~ PDB 1tJi!31>J IBMF tr. :19!UtJt ,13 :)A~$xw,~ Fig. 1 The crystal structure of mitochondrial F 1 - ATPase determined with o. 28nm resolution using data collected at the SRS, Daresbury, UK. PDB accession code IBMF. Left: Side view, Right: View from the bottom[J] (1) *?t-=f~f*xtM~B9~rrM ~JJf§xt /J\?t -=f~f*~~~~~, 1it~.mJ't~~~}E5t-=f.Jmit~+7J,~ ~~s7J:iJ!~tJ!B9Jm5t-=f~itf*Bt ,X M~T$Re ~~~1it*, :@~~rrM3~L~~~~.#., fa] ?tm$~$ , ~mM~M~~~.;lPJtVmMJ't~B9~ji.~ ~ f'tlI'lj:, mlV.l&lfB9tl~~f*~rrM5tm.$,~1mM~ 1!l3 1&if[;T 1it~.mJ't 0 (2) m EI rat ~f*B9:1::g:~ § lW1JJ1t~JU I*J {E~] 1$,t&~~~1' X M~~rrM1P!~.n~B9mt~JW{Eo ~T1fm~.)(B9*5t-=f~f*mJ~,.~~mffl1it fF1tf: fE ;Jt, 5Jg , 1976 if 11 YJ I±l ,~.E!.*~{£~1iJi ±Wf1E~, t~B~~!lm1Jl!-1f'!& l\5(fi\'Ii E3 M:2002 - 12 - 03
第1期 田亮等:揭示生命能量之源—ATP合酶三维结构的同步辐射研究 3 规X衍射源进行高分辨率测定的大晶体,而同步辐酸的相位测定 射X射线则用线性尺度比常规光源小几个数量级的 (6)同步辐射光源结合劳厄技术能在微秒的时 晶体即可 间尺度进行时间分辨的三维结构研究,由此发展了 (3)生物大分子晶体耐辐射能力很差,同步辐动态结构分析的手段。 射产生的高强度X射线使得晶体在因为X射线损 伤前的一段时间内即能收集到实验数据。 1ATP及ATP合酶 在1929年,K. Lohmann首先发现了ATP(三磷 1241240.124 酸腺苷)。几年之后,ATP的化学结构被确定。1948 年, Alexander todo因为对核酸及核酸辅酶的深入研 究(包括化学合成ATP)而获得了1957年诺贝尔化 学奖。在1939年至1941年期间, Fritz Lipmann (1953年诺贝尔奖得主)证实了ATP是细胞内所有 生物化学能量的储运者,并且证实能量是储藏于高 Bends 能磷酸键中(high- energy phosphate bonds)。 在所有的生物中,从细菌、霉菌一直到高等动 e.gEv 物、植物,包括人类在内,ATP都扮演了能量储运者 CuKI Mok 的角色,而这是由其分子结构所决定的。ATP结构 中的两个磷酸基团(y、B)可从y端依次移去而分别 生成ADP和AMP(单磷酸腺苷)(如图3所示)。 ATP在细胞能量产生和需求过程中起着重要的桥梁 作用。机体在生物氧化中,通过电子传递过程,还原 性辅酶(包括NADH和FADH2)上的氢以质子形式 Continuum 脱下,其电子沿着电子传递链转移,最终到达分子 氧。在此过程中放出的大量自由能往往储存于高能 磷酸化合物ATP中,再由ATP水解为ADP和P而 Photon energy /keV 释放出大量自由能供给需能反应(。 图2几种同步辐射光源的光谱亮度与常规X光源对比 常规X光源数值为估计值 Fig. 2 Spectral brightness for several synchrotron radiation HO-PNO-PNO-P-O sources and conventional X-ray sources The data for conventional X-ray tubes were rough estimates. 4) OH OHOH (4)很多生物大分子晶体晶胞边长达数十纳米 OH OH 甚至上百纳米,使得衍射斑点的空间分辨率相对减 小,常常要增加晶体与探测器之间的距离才能解决 ADP 衍射斑点重叠的问题,利用同步辐射高准直性单色 性的特点使得衍射斑点的发散度减小,可以收集到 巨大晶胞的衍射数据。另外通过晶体的移动而使一Fg3 Structure formula for adenosine triphosphate(ATP) 个晶体的不同部位依次受到照射,从而充分利用一 个(或少数)晶体收集全套数据,提高了晶体的利用 ATP的形成是借着生物细胞内养分的燃烧,而 效率。 后ATP被生物体用于合成细胞物质、肌肉收缩、神 (5)同步辐射波长可以任意改变,利用此特性经信息传递及其它多种生理反应,所以ATP被称为 采用“多波长反常散射(MAD)”技术,直接测定常规细胞的“能量货币”( Energy currency)。它在生物体 X射线晶体结构分析中麻烦的相位问题,以及用硒内的能量转换过程中扮演了重要角色。 代替甲硫氨酸中的硫、制备晶体重原子衍生物以及 在1940-1950年期间,实验证实了在植物中叶 采用溴化尿嘧啶等标记,可方便地用于蛋白质和核绿体的光合作用和线粒体的细胞呼吸作用中能产生
~nM EB ~~:f~7R!£-®-~~Il:Z~ ATP ~JJ=-f1E~f~l¥JlPJtl7mMMJt 3 .xmM.*fi~*m.~~~*H~,W~~. Mx M~JilUm~'/1:R1Jtt~1lt~J('.*~/J\JL~~.~~ ~1*llPPI 0 (3)~!/m**-TH~ jJ .M~~j]qR&, ~~. M~~~~~1JtXM~~~H~~~~xM~m {jj-ru-~-¥1BtrElJ I*J llP~~1&~JU~!KrZ~W o A / nm !O20 124 1.24 0.124 10 18 101(, :2' -6 ~ 1014 § .D ~ ~ 0) 1012 ~ S QI) g N 10 CuK I MoK ! ~~ ~ 10 -", CK I I ;g 10K B .8 .£:: I I'MK 10(' CuL Continuum 10· ] 02 , '" 1111 "ll" '" '''III """ 0.01 0.1 10 100 Photon energy / keV 002 n~lPJtl7mM*~I¥J*.~~~#mx*~~~ #~] X *~~{~L1g1ti 1i Fig. 2 Spectral brightness for several synchrotron radiation sources and conventional X - ray sources The data for conventional X - ray tubes were rough estimates. [4] (4) qR~~!/m**-TH~raJj@Jll *~~+~* ~~kw~*,~~mMm~~~~*m.ffi~~ IJ\, 1it1it~ijtjJO H~5ijf*¥Ji!tl~zrElJ ~~;t~~fWHR.: mMm~m~~ B,~m~~. ~~~tt.~ 't1:~*~,~1tq {rrMm,~~'it.~1Jt~/J\, PI 1&~JU §*~Jj@~mM~W o ~*mMra~~5~W~ ~H~~~~$&*~~~~M,Mw~*~m ~(~y~) H~1&~~~~W,~~T ra~~fIJm ~$o (5) ~~.~t~* PI ~1f~l!.t~, fljmll:t*~ /1: *m" ~~*~1it~M( MAD)" 11* ,~~¥Jl1 tl~1it~ xM~H1*~~*~~.~~ffi&~B,~&mm ft.'••• ~~.,~*H~m~-Tm~!/m~& *mm~*.~~5ill,PI~~~m~m~m~. .~ffi1:fz: ¥Jl1 tl~o (6) ~?V.M*~~.g.5I m:1i*~~iE~~~Bt ~R1Jt*fi~~*m~ .~~~~,~~'it.~T ~~~~*~~¥¥1 o 1 ATP &ATP~~ iE 1929 ~,K. Lohmann § JIG'it. T ATP (-= ~ .~=g:) 0 JL~Z)§ ,ATP ~~~~~i.!tfijij~o 1948 ~,Alexander Todd ~~xf••&•• fiJ~i*A1iJf (19Ji51-t~.g. JJJt ATP ) W q~ T 1957 it1J! 11\ ~ ~~ ] 0 iE 1939 ~ ~ 1941 ~m rElJ , Fritz Lipmann (1953 ~ilf 1J! 11\~q~.3::) iiE~ T ATP ~~mJj@ I*J J9T1f ~!/m~~W.~Mili~,# ~~W.~M.~~ ~~~.ifr:p(high - energy phosphate bonds )[6] ~JW1f~~!/m~, M~mlf ,.If ~JU~~i;fJ !/m,;f!!/m ,'0.mA~iEl*J, ATP t~tJJ~T~~.Mili~ ~j§~, W)!~~jt*-T~f1;JJ9Tlk.:JE~o ATP ~~ ~~W;j~~M£m( -y,(3) PIM-y YfM*rxf$*rm5tjJrJ ~JJJt ADP ~ AMP (1(!~M =g: ) (:tlO 00 3 J9Tffi ) 0 AW~~Jj@w.~~~m~Mfi~®.m~~m~ fFm o mf*~~!/m¥t~~ ,mi1~-T1~i3b'1fi,tt~ '/1:mjj( '0.115 NADH ~ FADH2 ) k~~~m-T%A mrF ,jt~ -Tnfff T1~J£bi~5, ~~JU:it*-T ¥to~~i1fir:p~ili~*.~~WttttM~~~W ~.~.g.!/m ATP r:p ,.¥J EE ATP 7j(M~ ADP ~ Pi W ~pxili*.§ ~~~1;!t~m~~~mz [7J 0 y P a o 0 0 A& RO - P", II 0 - P", II 0-pII - o - I I I 0 OR OR OH ./ OH OH _ _I- A~ p I ATP \113 ATP I¥J7tT~ft)A Fig.3 Structure formula for adenosine triphosphate ( ATP) AW ~%JJJt~1tf.~!/m~Jj@I*J~*~~~~, rm )§ ATP i.!t !/m f* m~.g. ,aX; gm Jff!l !JWJ £ , JlJL 1&!1a , f$ ~1~,~\1~J£&;lt£~#~JlI!~mz,J9T~ ATP t&:f$~ ~Jj@~" ~~.1#ffl" (Energy currency) 0 £iE~!JWJf* I*J~W.~.Mfi~m~Tm~j§~ o 1940- 1950 ~m ElJ ,~!KrZiiE~ TiE;f!!/m ot .~~*.g.fFm~~~~~~Jj@~~fFm~~~~ 0
核技术 第26卷 大量的ATP。1960年 Efraim Racker与合作者从牛 不同来源的ATP合酶基本上有相同的亚基组 心线粒体中分离出了“F1F0 ATPase",我们称之为成和结构,都是由多亚基装配形成的。F1为水溶性 ATP合酶( ATP Synthase又称F1Fo- ATPase)。它利球蛋白,有3a、3B、1y、18、1e等9个亚基组成(动物 用跨膜的电化学质子梯度按式(1)驱动ADP磷酸化线粒体还有寡霉素敏感蛋白(OSCP)亚基和抑制蛋 生成ATP(其中n在3-4之间): 白),相对分子质量为371000。其中每一个a、B、y、 ADP+Pi+H+nH(胞质)→ ATP+H2O+nH(基质) (1)0、8亚基的氨基酸残基数分别为510482、272、126 50。F1有6个核苷酸结合位点,其中的3个为催化 F1F- ATPase分子结构分为包含有催化中心的F1位点,催化ATP的合成或水解。F0是嵌合在内膜上 头部( F Complex或F1- ATPase)和嵌入膜内,耦合的疏水蛋白复合体,形成一个跨膜离子通道。F0的 F1头部的F基部( Fo Complex)。它广泛分布于线亚基类型和组成,在不同物种之间差异很大,只有细 粒体、光合细菌、叶绿体中,是生物体能量转换的核菌的被确定为ab2c9-1如图4所示,在水溶液中 心酶。如上所述,如果可以把ATP比喻为细胞的去除镁离子处于低盐浓度时,F1解离入水中,而Fo 能量货币”,我们则可以把ATP合酶比喻为制造货仍留在膜中;在重新加入镁离子后,F1和F0会再配 币的“印钞机”,因为ATP的合成最终是在ATP合酶成完整的ATP合酶。 的催化下完成的。 ADP+Pi 合酶结构模型 of ATP synthase.8 Paul boyer曾经说过生物体内所有的酶都是美催化机制。该机理的主要内容包括:(1)F1 丽的,但ATP合酶是其中最美丽、最不寻常、最重要 ATPase以完整的三聚体形式发挥作用;(2)B催化 的酶之一。它的美丽在于它是迄今为止已经解析出亚基不对称,每一个亚基上都含有不同的底物结合 详细三维结构的最大非对称结构。ATP合酶的和催化特征;(3)每一亚基经过结合互换而使催化 重要在于ATP支持几乎所有需要能量的细胞活动,作用继续下去。 ATP合成作用是生物世界中最普遍的化学反应,而2低分辨率(0.65m)下的F1- ATPase分 ATP合酶是地球上最普遍存在、最丰富的蛋白质。 关于细胞的能量转换机制一直是大家最关注的 子结构2 中心问题,细胞如何通过ATP合酶合成ATP成为各 用X射线衍射对ATP合酶的研究结果表明,F1 国科学家探寻解决的重要问题之一。1961年 Peter ATPase是直径大约为11mm的球状体,由3个a亚 Mitchell(1978年诺贝尔化学奖得主)提出了化学渗基与3个B亚基按六边形交替排列而形成的一个 透学说,认为在ATP合成过程中,跨膜的电化学质对称的橘瓣状结构,并围成一凹洞,γ、ε、8亚基位于 子梯度( Electrochemical proton gradient,△pH+)或称其中。在一个卷曲螺旋内包含有两个a螺旋的4mm 质子动力势( Proton motive force,△P)推动ATP合酶的茎秆(stem),它是颈部结构(salk)的一部分,并 催化合成ATPo。接下来的挑战是了解ATP合酶使得F1与膜部分相连。与茎秆连接的凹陷穿入F1 如何耦合F的质子流能量和F1的ATP水解/合成。3.5mmo茎秆与凹陷都是此晶体结构为不对称结构 随后,1977年 Paul Boyer大胆提出“结合改变机理的两个例证之一。 ( binding change mechanism)",揭示了ATP合酶的 在低分辨率下得到的F1结构并不能获得质子
4 ~ 11 * ~26~ :*JtI¥J ATP 0 1960 Efraim Racker ir1t~1\Lt ~~*.~ATPirM~*L:frm~I¥J~~m JL'~~1*9=t7t~ ill T" FIFo ATPase" ,~1nf$z:1g nX;#I~#J ,$~ EB $~~~~~nX;l¥Jo FI :1g7j(~tE ATP 1tM( ATP Synthase Xfn\ F1 Fo - ATPase ) 0 't~1J PJ(m B ,:fr 3ex,,3~,,1 ,),,18,,1 8 9 --t~~~1inX; (i9J!Im ffl$fml¥Jlt1t~mt-r~)jt*:r\( 1) ~fKi9J ADP ~~1-t ~~{*~:fr~.~~~m B (OSCP) ~~#I111J*J m ~nX; ATP(;tt9=t n 1£ 3-4 ZIEi]) : B) ,mx17t-rmt:lt:1g 371000 0 ;tt9=t 4ij:~--t <x, ~,')', ADP + Pi + H+ + nH+ (HElmt ) ~ 8,,8 ~~~~~~~~~7tJjIj:1g 510"482,,272,126,, . ( 1) ATP + H20 + n.H + (~mt ) 50 0 FI :fr 6 --t~tr ~~ir 1:fL~ ,;It 9=t I¥J 3 --t:Jg1l1t FI Fci - ATPase 7t-r~#J7t:1g§ *:fr1l1t 9=t JL' I¥J F1 1}L~,1l1t ATP ~irnX;~7j(fijlf o Fo ~-ttt1t1£l*JmL ~$(F1 Complex F1 - ATPase) #I-tttAml*J ,*M1t I¥J Mi7j(:J[ Bj[ir{* , nX; ~1'$fJm~ -rilit!0 F 0 I¥J FI ~$I¥J Fo ~$(Fo Complex ) 0 't)yz7t:;fJlT~ ~~~ru #I~1inX; ,1£~ ~!Im ** Z lEi] &:ff1&:* ,,R:fr ~ 1*"jt1t~m If"Ilt {* 9=t , !1m 1* fi~ Jt~~ I¥J ~ lfl¥J1Lt1iffJ5E:1g ab2c9_120 ~OOO 4 §f~ ,:(£7j(m~9=t, JL'Mo ~OLEJf~, ~O * PI lV.1E ATP l:t Ptu:Jg Jffl! I¥J *~fJ~-r~T1~iit*)jtB1 ,FI fijlf~A7j(9=t, rm Fo "fi~Jt1k ffi" ,~1n)JlU PI lV.1E ATP irMl:tPtu:1g 1titl 1k 1JJM1£Jm9=t ;1£:l:jf1JnAfJ~-rJB ,F1#I Fo ~fI}~ ffi I¥J" Gp$3;m" ,1N:1g ATP l¥JirnX;il~~1£ ATP irM nX;:JG~ I¥J ATP -% M0 I¥J 111t r :JG nX; I¥J 0 ADP + Pi FI Fa ADP +Pi ~·--ATP _Ma2+ ~ fill,... +Mg2' 004 ATP ifWf#~f~fl~ Fig. 4 Model of ATP synthase (8) Paul Boyer ~~i~:i:i~!Im{*I*JEJf:fr~M$~~ 1I1tm1ttl[ll] 0 i*m~ I¥J 3::~ I*J ~§m: (1 ) Fl mm I¥J, {13. ATP irM~;lt9=t:Ai~mm ,,:Ai~ 1it ,,:Aim~ ATPase lV.:JG~ 1¥J -=- ~1*~:r\£1¥1tffl; (2) ~ 1i1t l¥J_z~o 'tl¥J~mm:(£T't~~~:1g~B~fijlf~ill ~~~~fn\,4ij: 1'~~L.*:fr~~I¥J~!Im~ir iF~-=- £i~#J 1¥J:Ai:*~~X fn\~#J ] 0 ATP ir_1¥J #I1l1tt~1iE; (3) 4ij: ~~~:i:i~ir!f.~ rm~1l1t :I:~1£T ATP j(j~ JL3fEJf:fr$~fi~Jt~~Jffl!mi9J, 1tm~~r* o ATP irnX;1t m !1m tit!} 9=t :Ai1f;l@l1¥J1t & ill , rm 2 fff~m$ {O. 65nm} l'i¥-J Fl - ATPase ~ ATP irM~:f:{gPJ(L:Ai1f~1¥1£ ,,:Ai $ 'MI¥J:J[ Bmt 0 T~,~ 12 ] *T~Jffl!I¥J~Jt~~mM ~~:**il*~1¥J 9=tJL'IOJmL~Jffl!~o1itJJi:i:i ATP irMirnX; ATP nX;:1g* ffl X M~JMrrMx1 ATP irMI¥JWfJl~*~1!I3 ,F1- OOf4~*f5R~fijlftk:l¥Jm~r6J:mZ o 1961 Peter ATPase ~~12:*~:Jg Ilnm l¥JPJ(iI\{*, EB 31' ex ~ Mitchell (1978 ~}t ff! jJ\1t~~~~ 3::) t&lli T 1t~~ ~~31'~~~*~~~~.*~rm~nX;I¥J~--t ~~i~,iA:1g1£ ATP irnX;:i:i;fj9=t ,$fml¥Jlt1t~mt x1fn\~~.~~#J ,JfOOnX; ~[!!J ,,),,,8,,8 ~~11LT -r~1t (Electrochemical proton gradient, df..LH + ) ~fn\ ~9=t o 1£~1'~~ ••I*J§*:frM--tex ••1¥J4~ mt-ri9Jj]!Jj( Proton motive force, dP) 1lEi9J ATP irM l¥J~ff( stem) ,'t~~m~#J ( stalk) I¥J ~m7t, # 1l1tirnX; ATP[IO] 0 3'rr*~1jE~~ Tfijlf ATP irM ~~~ F1 ~Jmm7t*fB~o ~~ffJt~~[!!J~~A F1 ~n1ilJ*Mir Fo ~mt-rt1Efi~:I:#1 Fl ATP 7j(fijlflir nX; o 3. Snmo ~ff~[!!J~$~lft~1*~#J:1g~x1f$~#J ~JB ,1977 Paul Boyer :*H!!t&lli "~ira~m~ I¥JM1'f71HlEz 0 (binding change mechanism)" ,m T ATP ir M~ 1£~7tm$rm~I¥J~~#JJf~~~mmt-r
第1期 田亮等:揭示生命能量之源—ATP合酶三维结构的同步辐射研究 动力势能量与ATP合成是如何耦合在一起的过程约1.5m的凹槽,此螺旋的底部与y1-45形成的 所需的结构信息。为了得到这方面的结构信息就必第二个螺旋为左手反平行的螺旋结构,此螺旋结构 须采用更高分辨率的实验手段。 相对颈的底部突出大约3mm,是ATP合酶的4.5nm 3高分辨率(0.28mm)下的F1-ATPe分主颈(shlk)的一部分。a和B亚基上均具有核苷 子结构 酸结合位点( nucleotide- binding site),这些位点位 于a亚基与β亚基的界面。其中α亚基上的位点 John Walker等人在ADP与ATP类似物AMP-为非催化位点,而β亚基的结合位点具有催化ATP PNP(5- adenylyl- imidodiphosphate)存在的条件合成或水解的活性。相邻的催化位点与非催化位点 下结晶得到了F1- ATPase晶体,并采用重原子衍生之间的平均距离为2.7mm。所有的a亚基结合有 物同晶置换法,利用同步辐射X光源,得到了分辨TP的类似物AMP一PNP,且构象非常近似。但三 率为0.28mm的晶体三维结构。从此结构中可以很个β亚基呈现不同的核苷酸结合状态:催化位点结 清楚地看到F1中的三个β亚基分别含有不同的核合上AMP-PNP的称为Bm;而结合上ADP的称之 苷酸和同时具有不同的构象,此结构与 Paul Boyer为Bm;在催化位点上什么也没结合的,把它叫做 提出的旋转催化的“结合改变机理”所预期的结构BE。可以把F1- ATPase的晶体结构看作是在旋转 状态惊人地一致,为 Boyer的设想提供了最有力的催化过程时的一个快照:3个催化结合位点分别处 结构基础。无论是 Paul Boyer关于旋转催化的大在ATP水解催化过程中的3个不同的状态:与ATP 胆假设,还是 John Walker对F1- ATPase晶体结构结合、空置或被ADP和P占据。位于a3B3中央 的精确测定,都是对揭示生命能量之源作出的巨大的γ与E亚基结合在一起作为转子( rotor)组成了颈 贡献。他们两人因此分享1997年化学诺贝尔奖当部的轴(shaf),共同旋转以调节三个β亚基催化位 之无愧。这里,我们必须指出,正是利用了高性能点的开放和关闭。F0的a亚基和b亚基二聚体排 的同步辐射光源,使人们对F1- ATPase分子结构列在c亚基9-12聚体形成的环外侧,a亚基、b亚 的了解从低分辨率发展到原子尺度的高分辨率,从基二聚体和8亚基共同组成“定子”( stator)。F1和 而获得能直接证明“结合改变机理”正确性的 ATP Fo通过“转子”和“定子”连接起来,在合成或水解 合酶的三维结构。0.28mm的分辨率下得到的结构ATP的过程中,“转子”在通过F0的H离子流推动 清楚地显示F1- ATPase呈扁球体(参见图5),高约下旋转,依次与3个B亚基作用,调节B亚基催化 位点的构象变化;而“定子”在一侧将a3B3与F0连 Cytoplasmic 接起来。 c 4F1- ATPase分子结构与旋转催化的“结 ⊥ 合改变机理” 结合改变机理的示意图见图6。如前所述,可 Matrix side 以把F1- ATPase的晶体结构看作是在旋转催化过 程时的一个快照。F1上3个β催化亚基的催化位 点与底物核苷酸有着不同的亲和力,与核苷酸的结 合按顺序依次经过三种构象状态:紧密结合态(T 态)、松散结合态(L态)和空置状态(不与任何核苷 酸结合的0态)。在ATP合成过程中,ADP首先和 Pi结合在B亚基的L态,一旦结合后,位点转变为T 态,并催化ADP和P形成紧密结合的ATP。在这 步反应中不需要质子电动势的能量。接下来的反 图5ATP合酶的基本结构 应循环中,反应位点转变为0态,并将ATP释放。 Fig 5 Structure of ATP synth 这一转变过程需要耦合质子电动势,以获得能量克 8mm,宽约10mm,a亚基与β亚基像橘子瓣样围绕γ服ATP与蛋白质强烈的相互作用。在后面的反应 亚基的C端(209-272)形成的9mm长的中心α螺过程中,催化亚基的0态又转变为L态而完成一个 旋,交替排布。α螺旋C端残基在顶部的表面插入完整的循环。在整个反应过程中,跨膜质子电动势
~lAA m ~~ j@~~1fP-~~:i:Zm ATP -g..'=:!1E~f~~IPJ2V$BftWfJ1: 5 "a ff{] 1f~lH ~!f1, mFa W~ F - j 1l1-t ~,g. ~1l1-t se ~ ,Fj • (X .w. J~-t ~1iL T ~4nm )t,# ~A Fl ~~~ 19J:+ ~jJ~§~fi~ ATP 1S JJl~~n{iITm1S{£~~~i1:~ ~~~~~mg o ~7m~~~m~~~mg.~ ®f*m£[@j7tm$~~~-¥~o 3 ~~m* (0. 280m) 1'1Y-J Fl - ATPase ~ T~*~ [ l] John Walker !f/jAff ADP ATP ~{~!Im AMPPNP (5' - adenylyl - imidodiphosphate ) f.f{£ ~~1lJ: r~ff§~~~U7 FI - ATPase ~1*,#*m~ffi!:-Tqrr~ !Jm~ff§ft.~r!, fUm lPjtv-iIM x J't~, ~~~u 77tm $j] O. 28nm ~~f*-=. !t~~ o ,&AlIt~~~m1V.q~ m~~.~~~~-=. ~~~£7tm*~~IPj~. tr~~IPJBt Aff~1PJ ~f~~, 1It~~~ Paul Boyer mili~tiJE~1I1t~"~1Sa1£mJ£" E1fJ:VlM ~~~ iJ\15',*A~~3&, ~ Boyer ~ia:~t&1;!t 7 flff jJ ~ ~fig~jHilfl [ 3 ] 0 Xi~~ Paul Boyer *TtiJE~1I1t~* IDHFlii, ~~ John Walker xf F1 - ATPase 1*~~ ~M.M~,m~~.~~.~.~~~ili~§* :9ti¥1Xo {mfrTw.JA~lIt7t* 1997 1f1t~* m~~~ ZX~o~£,ftill~~mili , ~~~mT[@jtt~ a9~zP-mMJ't~, 1tA1fJxf Fl - ATPase 7t-T~~ a97.~M*m$~M~ffi!:-TR~~~*m$,,&A rm~q~ §~il~iiE f!fj" ~1S ?Jl:1£ m;ij[" fiffJ tt: ~ ATP ,g.~B~L=!t~~ o O. 28nm ~*m$rq~~U~~~ m~~~~ FI - ATPase ~JFiaf.:j(1*( ~~OO 5) ,jWj~ III 5 ATP -g..~~*~f~ Fig. 5 Structure of A TP synthase [ 14 ) 8nm,~~~ lOnm,u ~£~ ~ £~m-T.¥-Poo~-y .w.£~ c ttffff( -y209 -272)~JJl~9nm *~~JL\ u. tiJE,3(:~14F{jJ 0 u .tiJE C5tfflj~£{£J]!$~*W1iA 1. 5nm [!!];ft ,1Itt"tiJE $~ -yl - 45 JJJt ~ m=~••~~-¥&~fi~••~~,lIt••~~ if§xf~.v!~~$~tfj*~ 3nm,~ ATP 1S~~ 4. 5nm 3::~.v!(stalk) ~~$7to u ~ ~ ~tiLt :l!gAff.1t ~~1S1ir A (nucleotide - binding site) , @ fir,~ fir Tu~£~~~£~~mo~~u~£k~&A ~~~1I1t1ir,~, rm ~ ~£~~1S1ir,~Aff1l1t ATP 1SJJJt~7j(M ffl'/1: 0 if§ ~~ 1l1-t1ir,~ ~~ 1I1-t1ir,~ ~r8]~V:l!gRE~~ 2. 7nmo E1fff~ u ~~~1Sff ATP ~~f~!Im AMP - PNP, J3.~~~~litiIT{~o {§.= ~~~£~R~~~.*.~1S~~:ll1t&A~ 1Sk AMP - PNP ~f$~ ~TP; rm~1S k ADP ~f$~ ~ ~DP ;{£1I1t{ir,~k ft~ -m&~1S ~,16 '"t p4 fiji( ~EO m1V.16 FI - ATPase ~~f*~~.~~iEtiJf~ 1I1ti1:~Bf~~~'I9c~~:3 ~1I1t~1S{ir,~7tJjIJ~ ff ATP 7j(M1I1ti1:~~~ 3 ~~IPj~~~:~ ATP ~1S,2:~~1Jf ADP fO Pi 6*[15] 0 {irT U3~ 3 ~:!k: -y e ~£~1Sff ~~~~T(rotor)!iiJJJtT~ $ ~!fiB (shaft) ,;)tIPJ tiJE 1V.lJJ -=P -=.l' ~ ~~111tfir A~*~fO*Mo~~a~£~b~~ .~* ~tl (£ c ~£ 9 - 12 .f*~JJJt~PF~H9!tl, a ~~,b ~ ~=.1*~ 8 ~£;)tIPJ~iiJJX;" ~-T" (stator) 0 Fj ~ Fo Jii1:"~-T" fO" ~T" Jt~~*, ff1S JJJt~7j(M ATP ~i1:~~, "~-T"{£Jii1: Fo ~ H+ ~TtiEffEiYJ rtiJE~ ,*iJ\.~ 3 ~ ~£~m, lJJ-=p ~ ~~111t 1ir,~~~~1£1t; rm"~T"iE~1P!tl~ U3~3 ~ Fo Jt ~~*[16 ]0 4 Fl - ATPase ~T!iS*~l:5 ~~f~1t 1Y-J"!iS a<c 3ffJLII " ~1S?Jl:~mJlI!~~~oo~OO 60 ~nfrJ E1f~, PI 1V.16 Fj - ATPase ~1*~f~;g~~iEtiJE~1I1ti1: ~Bt~~~'I9c~~o Fj k 3 ~ ~ 1I1t~~~1I1tfir A~~!Im.*~~.~IPj~*~jJ,~.*~~~ it*)IW!ff*iJ\.~i1: -=. #f1J~~~: ~*~1S~ (T ~) ,*,k~~1S~( L~ ) f02:ft.~~( ~~1f1itJ.* ~~1S~ O~) 0 {£ ATP 1SJJJti1:~~ ,ADP ttJ'GfO Pi ~1S{£ ~ ~£~ L ~, E!.~1SJ§ ,1ir/~~~~ T ~,#111t ADP fO Pi ~JJJt~*~1S~ ATP o {£~ ~~&~~~m~m-T~iYJ~~~fio~r*~& ~1IPF~,&~{1LA~1£~ 0 ~,#~ ATP *f:o~o ~~~1£i1:~.~m1Sm-T~iYJ~,1V.~mnfi~ .ATP~m~m~~~if§~~mo{£J§m~&~ i1:~~ ,111t5Jr£~ 0 ~X~1£j] L 15ITff%JJJt--t %m~1IPFo{£m~&~i1:~~,~~~-T~iYJ~
6 核技术 第26卷 是反应的推动力。每一个催化亚基要经过3次构象催化位点。同步辐射晶体结构数据也表明,a 变化才催化合成一个ATP分子。在任一时刻,F1上Arg373在催化位点的出现可能参与了催化作用。 3个B催化亚基的构象总是不同,分别为结合ATP β亚基的核苷酸结合位点由结合有部分腺嘌呤 的T态,不结合的O态和结合有ADP和Pi的L态,的疏水部分和核苷酸磷酸尾部结合部分组成,这 并依次发生变化。另外,只有当ATP从0态释放出疏水“口袋”( pocket)包括以下一些残基V64 来,同时,ADP和Pi结合在L态时,亚基之间的相互Y345、F418、A421和F424。图7所示的AMP 作用才会驱动ATP的释放。ATP的水解过程则按PNP结合状态(AMP-PNP- bound form)中,残基 相反方向进行,ATP和0态的结合位点结合,经过0-G159、K162、R189,相邻a亚基的R373,及一个 T-L态的转变,ATP水解为ADP和P,最后从L态Mg2离子与磷酸基形成静电相互作用或氢键。在 的结合位点释放出来。 ADP-结合状态(AMP- bound form)中,残基159- 晶体结构同时也为ATP合成的化学机理提供164,连同a亚基的R373一起再加上一个Mg2离 了新的证据,在βm状态下,离AMP-PNP的γ磷酸子,有助于结合上二磷酸盐,而水分子则占据了 盐0.44nm的地方有结合水分子与β-Cu88的羧MP-PNP结合状态时由末端磷酸基所占据的位 基以氢键相结合。这个残基大致处于激活水分子的置。整个ADP-结合和AMP-PNP-结合亚基的 位置,增强了对末端磷酸基团的内部亲核攻击(in-结构非常相似。空置状态(未结合任何核苷酸)的 line nucleophilic attack)。a-Arg373的胍基稳定了B亚基则与AMP-PNP结合状态的结构有较大改 处于过渡状态的末端磷酸基的负电荷。在α亚基变。核苷酸结合位点的B- sheet结构解离打开了 中,Cn替代了β-Cu188中Ghu的位置,使得a亚催化位点。从AMP-PNP结合状态转到空置状态, 基缺少催化活性。另外,a亚基中结合的腺嘌呤是F424与K162,R189和R373(a亚基)残基的距离 以氢键结合的,而β亚基则与腺嘌呤之间存在疏水分别增加到0.27m0.86mm和1.23m,更利于结 界面。这些结构特点都表明了为什么a亚基不是合的ATP从β亚基上释放。 ADP ADP+ P Energy H,O ATP 图6 Boyer的"结合改变机理"示意图 ig.6 Boyer's"binding change mechanism"[23 K162 R2373(a) R373(a) v164 AMP-PNP F424 图7F1- ATPase亚基ATP结合位点(包含有ATP类似物AMP-PNP)的立体视图 Fig 7 Stereo view of the ATP-binding site in the B-subunit of F-ATPase containing the ATP analog AMP-PNP[)
6 ~ it * ~26~ ~&~~m~h o .-~~~~~~~li3~~. ~1t/f111td:t JJX:-~ ATP 7t-=f o {£1f- t~tl, F) L 3 ~ ~1t~~~#J.Jt!1,~/FIP], 7tJ3rJjg~ir ATP T ~,/F~ir~ 0 ~lO~ir:ff ADP 5fU Pi ~ L~, **~£~~~o ~)t",,R:ff~ ATP JA 0 ~*¥J1Xttl =*, IP]Bt, ADP 5fU Pi ~ir;(£ L ~at ~zr8] ~if§1L fFm/f~~~~ ATP ~*¥1fj{ o ATP ~7j(imli~mUm if§ &1rrtD:itH:r ,ATP 5fU 0 ~~~ir1jzJ~~ir ,~li 0 T - L ~~~ ,ATP 7j(im jg ADP 5fU Pi,:l:J§" JA L ~ ~~ir1 L~*¥1fj{ ttl =* 0 fai*~#J IP] at tIL jg ATP irJJX: fJlJI 1;H; 7WT~iiE1m,{£ ~TP~~ , AMP - PNP ~"y ~~ 0. 44nm ~:It!?1r:ff~ir7j(7t-=fJ:ij ~ - Glu188 ~~ ~~~mif§~iro~~~~*~~r~m*7t-=f~ {iLJf. ,~51ii 7 X;J*~~~~m !*J $*ifj<:0l-m (inline nucleophilic attack) 0 ex. - Arg373 ~IDll~~JE7 ~rli~~~~*~~~~~~~mo {£ex. ~ q:t ,GIn ~1-t7 ~ - Glu188 q:t Glu ~1jzJf.,1t~~ ex. ~ ~flYcy~1tmJ/1o ~)t",ex. ~~q:t~ir~~PjIlt~ ~~m~ir~, rm ~ ~~mUJ:ij~Pjlltzr8]ff{£ fIJE7j( ~mo~®~~~~m*~7jg~~ex.~~/F~ ~1t1iL J~ 0 IP] tP-*i t fa i*~fZg ~1m tIL * ~, ex. Arg373 {£~~1iLJ~~t\j~-arfm~J:ij7 ~1tfFm 0 ~~~~ifj<~~~ir&~~~ir:ff$7t~~1lt ~~*$7tlO~~~~~~$~ir$7tmJJX:,~ ~7j(" []~" (pocket) §:ffi r @~~ V164" Y345 " F418 " A421 1O F424 0 00 7 EJf~~ AMP PNP ~ir~~( AMP - PNP - bound form) q:t, ~~ G159" K162" R189, if§~~ ex. ~~ffJ R373 , bZ ~ Mg2 + T J:ij ~~%JJX; fIt Et! t§ 1LfF m El m 0 (£ ADP - ~ir~~( AMP - bound form) q:t, ~~ 159 164, alP] ex. ~~~ R373 ¥J.1JrrL Mg2+ ~ T,:ff l3JJr~ir L=~~~, rm7j(7t-=fmU 61m 7 AMP - PNP ~ir~~at~*~~~£EJf61m~ iL Jf.o ~~ ADP - ~irlO AMP - PNP - ~ir ~~~ ~#J~~1ftffi{w,o ~Jf.~~ (*~ir1f1PJifj<~~ ) ffJ ~ £JJlUJ:ij AMP - PNP ~ir~~~~#J:ff~*~ o ~~~~ir1jzJ~~ ~ - sheet ~#Jim~1T7f7 ~~&~oJAA~-~P~ir~~~~~Jf.~~, F424 J:ij K162, R189 5fU R373 (ex. ~£ ) ~£~IEE~ 7tJ3rJ~1Jrr¥U 0. 27nm,O. 86nm 5fU 1. 23nm,£5frJr~ ir~ ATP JA ~ ~~L*¥1ij{[1 7l 0 A B c ~ AT? D 1116 Boyer~" ~ifi&~mJ1." 7R~OO Fig. _ Boyer's" binding change mechanism" [ 12 J AMP-PNI .. 1117 F1 - ATPase~.w.~ ATP ~,g. 1fL }~\C §~1f ATP ~{P.1.!jo/.J AMP - PNP) ~JL1*~OO Fig.7 Stereo view of the ATP - binding site in the ~ - subunit of FI - ATPase containing the ATP analog AMP - PNP[ 17 j
第1期 田亮等:揭示生命能量之源—ATP合酶三维结构的同步辐射研究 从F1- ATPase的晶体结构还可观察到由于α、三步循环步骤中的一步,F上H的转运积累足够 β亚基结构域的相关定位不同以及与γ亚基的相互的扭力矩推动y、相对于a3B3旋转120°,而y、E 作用不同,F1- ATPase的全部结构表现为不对称结通过与β亚基核苷酸结合位点的作用使β(ATP) 卷曲螺旋的不对称也非常明显,它的C端(y265-或重新转向对核苷酸的“捕捉”优A(ATP)停止 构。不但a、B亚基呈现不对称结构,而且y亚基的亚基释放一个ATP,同时调节β(E)和 277)通过由六个富脯氨酸环组成的疏水“袖管 (se)。F1的三个催化亚基由于结合的核苷酸底5展望 物不同,而呈现不对称的构象,有力地支持了 Boyer 对蛋白质、基因细胞等结构与功能关系的研究 提出的结合改变机理,证明在催化循环的任一时刻,是生命科学研究的核心。以结构(主要是三维结 三个β催化亚基处于不同的构像状态,不同构象的构)测定为手段、以结构与功能关系研究为内容、以 转化与位于a3B3中央的y亚基的转运运动也有关。阐明生物学功能机制为目的的结构生物学是当前生 结合改变机理主要解决的是F1上3个核苷酸命科学中最活跃的前沿领域之一。本文所介绍的研 催化位点在合成或水解ATP过程中构象变化,而目究成果,可以被认为是关于生物大分子晶体结构与 前认为ATP合酶催化合成ATP的过程是按照“旋转功能关系研究的典范。X射线晶体衍射作为测定生 催化”( rotational catalysis模式进行的11。以大物大分子空间结构最有效的方法已成为结构生物学 肠杆菌的ATP合酶为例,腔内质子在跨膜质子动力研究的基本手段。同步辐射X射线对结构生物学 势的推动下进入F0,位于膜脂双层的c亚基C端氨的发展起到了巨大的推动作用,重要的生物大分子 基酸残基与之特异结合,以致c亚基构象发生变化;的空间结构的测定无不得益于同步辐射光源。要搞 通过F0的质子转化成扭力矩推动位于F。和F1间清生命过程的本质,一个根本的前提是必须要了解 的转子γ和ε亚基旋转;在γ和ε亚基的旋转调节蛋白质、核酸等大分子具有原子分辨率的空间结构 下,B亚基催化结合位点附近的蛋白质构象发生变以及这种结构又如何与其生物学功能相联系的。目 化,消弱了氨基酸残基与底物ATP的多种作用力,前80%以上的生物大分子结构是用X射线衍射法 使ATP从酶上释放。尽管“结合改变”的循环过程得到的。过去的十多年里,同步辐射技术的发展大 表明不同催化状态的转变可以通过不同亚基相对于大推动了结构生物学的研究进展。根据国际蛋 ATP合酶的其他部分旋转而完成,此假定并不能通白质数据库(PDB)资料,70年代每年登录的生物大 过获得晶体结构的单个静态照片所完全证实。但我分子空间结构数约20个,但到1999年,一年中新登 们还是可以根据F1- ATPase晶体结构的电子表面录的数目已增加到2636个。至200年4月23日 势能分布信息获得旋转所需要的证据,(1)环绕γ总结构数为17902个,其中属蛋白质或与核酸复合 亚基C末端的疏水“袖管”像“分子轴承”一样,并被物形式的有16812个,占总数的94%。其中相当部 疏水界面所润滑,(2)中央凹槽允许y亚基的N末分具有重要生物学功能的生物大分子结构是用同步 端长螺旋在F1内部旋转时可以通过,(3)如结合改辐射X射线测得的。 变机理所说,y亚基与a3B3亚基之间存在相互作 尽管利用同步辐射X射线得到了F1- ATPase 用,此相互作用将使得阻碍旋转的势垒变小,较易被的精确三维结构,并阐明了ATP合酶的催化机制, 质子传递过程引起的构象改变所产生的能量所克但仍有许多问题亟待解决。深入了解ATP合酶耦 合F0质子传递和F1ATP合成的结构基础,ATP合 Noji等利用线粒体F1- ATPase的晶体结构研酶如何在分子水平上进行调控和ATP合酶为什么 究的结果,精心设计了一系列的标记、突变,并采用要旋转等等,就需要得到原子分辨率的F及颈部结 最新的荧光显微镜摄像技术,显示出了y亚基的转构(sak)的精确三维结构、F。与颈部结构的装配以 动,清楚地表明了γ亚基是在a3B3形成的圆筒中,及具有时间分辨率的动态过程。 Yasuda和Noi等 转动方向为反时针。转动能使中心的y亚基能人最近报道了γ亚基相对于a、B亚基转动120的 够与三个β亚基按顺序由空位ADP结合位到AMP-过程可以进一步分解为90°和30°两个分过程,旋 PNP结合位发生接触,这个顺序正好与预言的ATP转90°和30°过程的时间都非常短(<0.1ms)。ATP 水解反应从ATP-ADP-空位点的顺序一致。这个的结合触发了旋转90°的过程,而ADP和Pi的释放 实验从另一角度也验证了结合改变机理及同步辐射又引发了后一步的旋转2)。由此推断,利用新一代 X射线测定晶体结构的正确,F- ATPase像一部精同步辐射光源的高通量与高亮度特性、空间分辨大 密的内燃机,y亚基就像中央转子,B亚基的三个催大提高以及能对纳秒,甚至皮秒级的动态过程检测 化位点是三个反应室,并按照 Boyer的经典模型依的优点,将可以获得更多耦合过程和旋转过程的中 次工作—在转子旋转后,三个催化位点依次完成间过渡结构信息,在不久的将来,定会揭示出这个世
~1W3 EB ~~: :mlR~1fIjfj~:l:Z~-ATP itM-=:~i~t~l¥.JlI'lJt!7mM1iJfJt 7 1\ Fl - ATPase l'fl ~f*~~~"ilJ~~JU EE -=f ex" ~~~~~~l'flffi*~lli~~~&~~~~l'flffi~ fFm::f~ ,F1 - ATPase l'fl~$~~*:Jm1'1::fxtf$~ fiJ o ::f{§. ex,,~ ~££:Jm~xtf$~fiJ, WH ~ ~£l'fl ~an.1iJEl'fl::fxtf$-m~~*~l[, 'tl'fl c ~(~265 277 ) tt EE 7\ l'MHm ;c PF ~Jl Jjj{; l'fl 7j( "*ill if " (sleeve) 0 Fl l'fl.:::::.1'-1l1t~~EE-=f~i1l'fl#<tr~~ !/m::f~, W£:Jm::fxtf$l'fl~~;;ff fJ:ltI!.X1~ 7 Boyer .ilil'fl~il~~mm,~~ft1l1tmPFl'flff-~~, tE 1'~1l1t~£~T~~l'fl~~~~,::f~~~l'fl ) ~1t~{irT ex3~3 ~:!k:l'fl ~ ~~l'fl~~~~-m;ff*o ~ ~il~~mm~~~~l'fl~FIL31'#<tr~ iT 1l1t{iL¢,i:ftilJJX:~7j(~ ATP ii~~fiJ~~1t, W § ,iiI -ru-iA1g ATP ilJJ1l1tilJJX: ATP l'fl tt~J!n: R~ " tiJi~ ~E8 1l1t" (rotational catalysis) m:rt:itti-T l'fl [ 11, 18] 0 ~"* 1E8 JJm ffifl'fl ATP ilJJ1'119iJ , pg 193: r ft ll4f1m193: r fJ :~ ~l'flit~r:ittA Fo ,{ilT1mn~~Bl'fl c ~£ c ~~ :T ~~~~~zt~JF~il, ~3& c ~£fiJ~:&l:.~1t; ~tt Fo l'fl193:r~1tJJX:mfJ~it~{il-=f Fa fO FI fa] I~" "* l'fl~r~fOe~~1iJE~;ft~fOe~£l'fl1iJE~~~ ~~ :: t!: r ,~ ~~1l1t~il{il,¢,i: 1Yftjl[ l'fl~ B193:~~:&1:.~ -1=1 1t,r~~~7;c£~~£~mi!fm ATP l'fl$#fFmfJ, 1t ATP 1\JJL*f:n}{o ~if"~il~~" l'flmPFtt~ *~::f~1l1t~~l'fl~~"ilJ~~tt~~~£ffi~-=f ATP ilJJl'flJt{m$7t1iJE~WjGJJX:, llt{~~#::f~~~ tt~m~~~fiJl'fl.1'.~M~~jG~H~ o mft {fJ~J!"ilJ ~;ftHm FI - ATPase ~f*~fiJ l'fl ft!. r*ffi ~~~7t~{FI,~\~~~jjJf~ ~1lfj~ l'fliiEf!, (1) PF~ ~ ~~ C*~l'fl ~7j(" *ill if"~" 7t-=f~ jf(" -~ ,#*.ft ~7j(:W- ffi~~fJ m , (2) ~:!k:!!!I;ff ftif ~ ~£ l'fl N* ~*.jjJEft FI pg$jjJf~Bt"ilJ ~~tt, (3) ~n~il~ ~mJJI!~i~, ~ ~~~ ex3~3 ~~zfa]1f:(£ffi~ fF m ,lltif§~ fFm~{t~~~Jl~1iJE~l'fl~£~/J\ tgt~*.ft 193: rf~:i£ tt iJ Ijffi l'fl fiJ t!1 tr-1:.l'fl ~~:I: 5l. nit [ 1] 0 Noji ~;f!Jm~tL~ FI - ATPase l'fl ~f*~fiJ1jJf Jll'fl~* ,~JL'~it 7 - * jtll'flt~i2" ,# *m ~~l'fl~*1[~mm~~*,1[~ili7~~~l'fl~ ,m~:ltI!.*~T ~ ~~J!:(£ ex3~3 %JJX:l'flIM1~~, ~~:7JrtJ1'1DZBttt[ ] 0 ~i9J~~~~JL'l'fl ~ ~~~~ ~~ - 1' ~ ~~n:)IID! ffEE~{il"ADP ~il{ilJU AMP PNP il{ir:&l:. ~~!k , J! l')IID! ff 1£M IV! l'fl ATP *~DZ~1\ATP-A~-~lli~l'fl~ff 3& o J!1' ~~1\~ ~~-m~~T~il~~mm&~~mM XM~~~~~~~~l'fl1£fif8 ,FI - ATPase m~ *l'fl pg ~~m, ~ ~£8Jt~ :!k:~r , ~ ~£ l'fl .:::::.1'11 1t{il,¢,i:J!.:::::.l'DZ~~, #n: R~ Boyer l'flf~~mID!1& 1XIfF-:(£~rjjJf~B ,.:::::.1'1l1t{il,¢,i:1& 1XjGJJX: - ~qJ§PF~~~ l'fl ~, Fo L H + l'fl~~f~~JE~ l'flmfJ~it~ ~"e if§xt-=f ex3~3 tiJi~ 1200, W -y,e ~tt~ ~ ~~#<tr~~il{il,~ l'flfFm~ ~ (ATP) ~~*f:n}{ 1' ATP, ~BtifflJ~ ~(E) fO ~(ATP)~l1: ~:miff~rtJxt~tr~l'fl"1mt@" ~~[I6] 0 5 Jim xt~ BI9i ,,~~ ,,~mJffg~~fiJ ~J)J~~** l'flWfJl J!~irrfl/-~WfJll'fl#<JL'o ~fiJ (±~J! ~t~ fiJ) ~~~1g -=f~" ~f~ J)J ~~* * WfJl1g pg?iJ." ~ ~~~!/m~J)J~m~1'1§l'fll'fl~fiJ~!/m~J!~-ru-~ irr~~~~m~l'fl~m~~z-o*x~~ffl~Wf JlJJX:*,"ilJ~*.ftiA1gJ!*-=fl:.!fm*7tr~~~fiJ~ J)J~**WfJll'fl~moXM~~~mMfF1g~~~ ~*7tr~~~fiJ~;ff~l'fl:7J~BJJX:1g~fiJl:.~~ ~Jll'fl~*¥~o~~mMXM~~~fiJl:.!/m~ l'fl~~jffi~Tg*l'flm~fFm,~~l'fll:.!/m*7tr l'fl~~~fiJl'fl.~~~m~T~~mM*. o ~~ ml:.irru~l'fl*I9i,-1'm*l'fl~.J!~~~7~ ~B193:,,#<~~*7trA;ff~~~M$l'fl~~~fiJ ~&J!#~f~JZj {nr ~Jtl:.!/m~J)J~~if§II** l'fl 0 § 80% V1Ll'fl~!fm*7tr~fiJJ!m XM~qrrM~ m~l'fl o tt~l'fl+$~m,~~mMtt*l'fl~~* *it~T~~1:.!fm~l'flWfJl:itt~[ 2a] 0 mf!OO~7Fm B193:~f!$( PDB) ~fl,70 ~1-t4ij~~~l'fl~!/m* 7tr~f8J~f~~~"J 20 l' ,{£!JU 1999 ~,-~~WT~ ~l'fl~ § B~1JOJU 26361' 0 3I 2002 4 J1 23 13 , ,~,~fiJ~1g 179021',Jt~JmmBI9i~~#<~~il ~%:rtl'fl~ 168121', d ,~,~~ 94% 0 Jt~if§ ~$ 7tA;ff:m~l:.!fm~J)J~l'fll:.!fm*7tr~fiJJ!m~~ mM XM~~H~l'fl o ~if5fJjm~~m~t XM~~~JU7 FI - ATPase l'fl~~.:::::.~l~fiJ, #f!fiJ 7 ATP ilJJl'fl1l1tm1ff~ , {£!1JJ;ffif$rilJ»!~1~.~ 0 ~A 7~ ATP ilJJ*M il Fo 193:r1~:i£*" FI ATP il JJX:l'fl~f~£Wtfi, ATP il .~Mft7tr*~L:ittB~~fOA~ilJJ1g~~ ~1iJE~~~, 8Jt~~~~JU~ r7tm$l'fl Fa &£.m$~ fiJ (stalk) l'fl~~ .:::::. ~t~~ "Fa ~£3i$~fiJ l'fl~~~ &A;ffBtf8J7tm$l'fl~~tt~o Yasuda fO Noji ~ A~jl[*J!!T ~ ~~if§x1-=f ex,~ ~~~i9J 120°l'fl tt~"ilJ~:itt ~7t~1g 900fO 30 ~1'7ttl~, jjJE 900fO 300tt~l'flBtfa]m~~*%I ( <O. 1ms) 0 ATP l'fl~il~!k:& 7jjJf~ 90° l'fltt~, WADP fO Pi l'fl*f:n}{ XiJl~T B-~l'fljjJf~ 2I] 0 EElltitWT, ;fJjm~ 1-t ~~mM*.l'fl.~:I:~.~~~tt,~~7tm* * ••~&~~~~,~3I~~~l'fl~~tt~~~ l'fl~~,~"ilJ~~m~$*Milii~f01iJE~tl~~~ l'a]tt$:~f~1FI,~\ ,ft~Rl'fl~*, ~~m~ill ~-t-ttt
核技术 第26卷 界上最小、最精密的“马达”更美丽的一面。 999,6:809-811 “基于同步辐射的结构生物学”之所以有这样4 Thompson A C. Vaughan D, Lindau I,eta,x- ray data booklet 大的发展和美好前景,一个关键点是涉及遗传工程、5 Information about the Nobel Prize in Chem19,heod 低温结晶、高灵敏的探测技术、数据处理的计算机硬 SwedishAcademyofSciences(http://www.nobelse) 件和软件等技术上的飞速进步和第三代同步辐射装6 Information about the Nobel Prize in Physiology or Medicine1953 置的出现。基于同步辐射X射线优异的特性,还能 The Royal Swedish Academy of Sciences 在非结晶的状态利用X射线吸收精细结构谱获悉7 ehninger A L, Nelson D L, Cox MM. Principles of biochem 生物大分子中金属活性中心附近的详细特征;用小 8 Yoshida M, Muneyuki E, Hisabori T. Nature Molecular Cell Biology 角散射法探测溶液中大分子的动态和静态大小及形 Reviews,2001,2:669-676 状、追踪蛋白质折叠过程;X射线显微术则提供了一9 Paul d. Boyer Annu Rev Biochem,1997,66:717-749 种新的细胞及细胞器活体的显微成像技术。可以预10 Mitchell F. Physiol Rev,1966,41:45-502 料,同步辐射光源在推动结构生物学和其它生命科 aul D. oyer Biochimica et Biophysica Acta,19.1015 学的发展中将继续发挥不可估量的作用。 12 Abrahams J P, Lutter R, Walker J E, et al. EMBO J, 1993, 12 在本文成文之际,欣闻2002年诺贝尔奖揭晓。 本年度的化学奖授予了在生物大分子结构测定领域13 Information about the Nobel Prize in Chemistry1997(prsm 作出突出贡献的三位科学家 John B Fenn、 Koichi lease), The Royal Swedish Academy of Sciences Tanaka和 Kurt Wuthrich(2),其中 Kurt wuthrich因为15石晓冰,沈允钢生命的化学,19,25-9 对“利用核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维 SHI Xiaobing, SHEN Yungang. Chemistry of Life, 1999, 19 结构的方法”作出的突出贡献而获奖,而另两位科 225-229 学家 John B Fenn和 Koichi Tanaka则因为分别发明16翟中和,王喜忠,丁明孝细胞生物学.北京:高等教育出版 了“对生物大分子进行确认和结构分析的方法”和 社,2000.215-221 “对生物大分子的质谱分析的解析技术”而获奖。 ZHAI Zhonghe, WANG Xizhong, DING Mingxiao. Cell Biology Beijing: Higher Educations Press, 2000. 215-2 作为研究生物大分子三维结构的最有力的方法之17 Schultz B E,hmsL. Annu rey biophys Biomol stru,201 一,同步辐射必将与这几种研究方法一起在已经来 30:23-65 临的后基因组时代蛋白质功能与结构的研究中发挥18 Nakamoto R K, Ketchum C J,A- shawi M K, Annu Rev Biophys 更大的作用。 Biomol Struct. 1999. 28: 205--234 19 Noji H, Yasuda R, Yoshida M, et al. Nature, 1997, 386: 299- 参考文献 20 Ealick S E. Nature Struct Biol, 1998, 5: 620-622 Abrahams JP, Leslie A G, Lutter R, et al. Nature, 1994, 370: 21 Yasuda R, Noji H, Yoshida M, et al.Nature,2001, 410:898- 2 Hasnain SS, Helliwell JR, Kamitsubo H. J Synchrotron Rad 2 Information about the Nobel Prize in Chemistry 2002( press re 1998,5:1323 lease), The Royal Swedish Academy of Sciences 3 Hasnain SS, Helliwell J R, Kamitsubo H. J Synchrotron Rad Exploring the source of life energy a research of synchrotron radiation on ATP synthase TIAN Liang ZHANG Xinyi (Synchrotron Radiation Research Center, Fudan University, Shanghai 200433 Abstract The award of a share of the 1997 Nobel Chemistry Prize was the crystal structure of mitochondrial F-ATPase determined at 0. 28nm atomic resolution using data collected at the SRS, Daresbury, UK, and this was the first No- bel Prize for synchrotron radiation-based work. The coming of age of post-genomics was further enforced by syn chrotron radiation with characteristics of high intensity, high collimation and continuous tunable wavelength Key words Synchrotron radiation, Bio-macromolecules, ATP synthase, Three-dimensional structure CLC Q71
8 ~ it ~26~ * !Jt- -.t:m:/j\ 3l~Wa9" #;~" J!~BB a9 00 0 "£f~~.Ma9~~~~~"~~~~~~ *a9~Ji~~:!1f-ru-~ ~3Cm,~~~lkJft1~IW, 1f£rl!~ ~,~~f!tta9~r9!tlit*,~W~~a9it.m~£ #~~#~it*-.ta9~~*~~~=~~~.M~ .a9 ili £f~~.MxM~~~a9~tl,~ft tE~~~~a9~~5flj ffl x M~I!.&t&~£IB~~i~t1t~ !\m*7t-=f9:t3t:M m'/i 9:t JL' ~JlI a9i$£lBt~{iE; ffllj\ :ft1ttM~~i9!tlm¥l9:t*5t-=fa9Z9J~~D~*/j\])t~ ~,i1§.~mB aJjJT1i:tt~;x M~~~*!nU~ ~T ~ ~~~£IB~lk£IB~Bm~a9~.~.it*o~~~ *4, ~~.~t7'6~tEmZ9J~~ ~~~~t; ~1fPf4 ~~~Ji9:t~~~~~~~~.~~ffl o tE*x~x~~, frklJfJ 2002 !ipit14 $~m ~o *!ip~~~~~~~TtE~~*5t-=f~~.~~~ ~ili*ili:Vi~a9 1irf4~~ John B Fenn,Koichi Tanaka Kurt Wtithrich(22 ) ,~9:t Kurt WUthrich 1ZSJ1-J ~"~ffl~.~~it*ru~m¥l9:t~~*5t-=f . ~fig a9jJ~" ili a9 * ill :Vi iW\ 1i'ff gjt , 1i'ff:1J WHir f-I ~* John B Fenn ~ Koichi Tanaka !nU IZSJ 1-J5tJjrj2tw.I T"xt~!\m*5t-=f*fr1ijij~~~~5t;fJTa9jJrt:" ~ "xt~~*5t-=f a9 mtittf5t;fJTIWffJlf;fJTit* " 1i'ffgjt~ o ~1-J~~~!\m*5tT *~~a9:m:~na9jJ~~ ,~?P.M16\~l=:j~J1~~~jJrt:~®tE B ~* ~J§£IZSJ £llst1-tm BmtJ)jfi~l=:j~fig a91iJf~ 9:t ~~ J!*~~ffl o ~ ~ 3t ~ Abrahams J P, Leslie A G, Lutter R, et al. Nature, 1994 , 370: 621-628 2 Hasnain S S , Helliwell J R, Kamitsuho H. Synchrotron Rad, 1998, 5: 1323 3 Hasnain S S, Helliwell J R, Kamitsubo H. Synchrotron Rad, 1999, 6 :809-811 4 Thompson A C, Vaughan D, Lindau I, et al. X - ray data booklet ( 2nd edition) I Lawrence Berkeley National Laboratory, 2001 5 Information about the Nobel Prize in Chemistry 1957 , The Royal Swedish Academy of Sciences. ( http: //www.nobel.se ) 6 Information about the Nobel Prize in Physiology or Medicine 1953, The Royal Swedish Academy of Sciences 7 Lehninger A L, Nelson D L, Cox M M. Principles of biochemistry ( 2nd edition) , New York Worth publishers, 1993 8 Yoshida M, Muneyuki E, Hisabori T. Nature Molecular Cell Biology Reviews, 2001 , 2 :669-676 9 Paul D. Boyer Annu Rev Biochem, 1997, 66:7 17 - 749 10 Mitchell P. Physiol Rev, 1966, 41 :445- 502 11 Paul D. Boyer Biochimica et Biophysica Acta, 1993,1140:215 250 12 Abrahams J P, Lutter R , Walker J E, et al. EMBO J, 1993, 12: 1775- 1780 13 Information about the Nobel Prize in Chemistry 1997 ( press release) , The Royal Swedish Academy of Sciences 14 Wang H Y, Oster G. Nature, 1998, 396 :279 15 :fiiJ1Et;j(, ttftm. ~-$8{J1t~, 1999·, 19 :225-229 SHI Xiaobing, SHEN Yungang. Chemistry of Life, 1999, 19: 225-229 16 ilrJ:tln, £~ ~" T~~. ~JfflEE4&J~. :ftJi(:~~¥i1flliJtli fi, 2000. 215-221 ZHAI Zhonghe, WANG Xizhong, DING Mingxiao. Cell Biology. Beijing: Higher Educations Press, 2000. 215-221 17 Schultz BE, Chan S I. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 200 1 , 30:23-65 18 Nakamoto R K, Ketchum C J, AI - shawi M K. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 1999, 28: 205- 234 19 Noji H , Yasuda R, Yoshida M, et al. Nature, 1997, 386: 299 302 20 Ealick S E. Nature Struct BioI, 1998, 5 :620-622 21 Yasuda R, Noji H, Yoshida M, et al. Nature, 2001,410:898 904 22 Information about the Nobel Prize in Chemistry 2002 ( press release ) , The Royal Swedish Academy of Sciences Exploring the source of life energy --A research of synchrotron radiation on ATP synthase TIAN Liang ZHANG Xinyi ( Synchrotron Radiation Research Center, Fudan University, Shanghai 200433 ) Abstract The award of a share of the 1997 Nobel Chemistry Prize was the crystal structure of mitochondrial Fl - ATPase determined at O. 28nm atomic resolution using data collected at the SRS, Daresbury, UK, and this was the first Nobel Prize for synchrotron radiation - based work. The coming of age of post - genomics was further enforced by synchrotron radiation with characteristics of high intensity, high collimation and continuous tunable wavelength. Key words Synchrotron radiation, Bio - macromolecules , ATP synthase, Three - dimensional structure CLC Q71
