第27卷第1期 核技术 Vol 27. No I 2004年1月 NUCLEAR TECHNIQUES January 2004 细胞膜通道与同步辐射 文章3 闫晓辉12田亮1张新夷 1(复旦大学物理系上海200433) 2(复旦大学同步辐射研究中心上海200433) 3(复旦大学表面物理国家重点实验室上海200433 摘要长期以来很多科学家致力于研究物质,如水和离子是如何穿过细胞膜从而完成细胞内外物质交换的 1988年 Peter Agre第一次发现并描述了细胞膜水通道蛋白质的特性, Roder ic mack innon则在1998年阐明了 离子通道的结构和机理,使我们可以从原子水平了解这些精美的蛋白质结构和运行机理。由于这两位科学家 在细胞膜通道研究方面的卓越贡献,他们分享了2003年诺贝尔化学奖。在他们的研究中,基于同步辐射的蛋 白质结构测定发挥了很关键的作用 关键词同步辐射,K+通道,水通道,三维结构,细胞膜 中图分类号Q71,O43419 世界上每一个生物体都是由细胞组成,人体就 Source(简称ALS),用同步辐射Ⅹ衍射的方法得 有成千上万多如星汉的细胞。但这些细胞不是简单到了一种和水通道具有相似结构的甘油通道GlpF 的堆积,它们彼此之间存在着信息的交流,而成为分辨率为22A的电子密度图。关于膜蛋白离子通 复杂的有机整体,相互配合,完成一系列生理功能。道的结构,是 Roderic mackinnon第一次得到的, 例如肌肉的伸缩、大脑信号的传递都是由细胞间的他在美国 Cornell大学高能同步光源( Cornell High 信号交换和细胞内外物质和能量交换来协调完成 Energy Synchrotron Source,简称 CHESS)通过Ⅹ 的,它们的实现是一个复杂的过程,所以一直是科射线衍射解出了一种称为KcsA的K+通道 学家们探索的热点。 ( Potassium ion channel)的原子结构,分辨率为 人们早就已经认识到水和其他物质,如K+、3,2AA。他的这一研究成果震惊了整个科技界。水 Na、Ca2+、Cl-等离子能够经过一些孔道通过细通道和K+通道的结构是理解这些通道功能如何实 胞壁,但是它们的结构和功能如何实现却一直不为现的基础,证实并在原子水平解释了这些通道的特 人所知。1988年 Peter Agre第一次成功地分离出一性,如选择性、开关性等 种膜蛋白CHP281,分子量为28kDa(千道尔顿) Peter Agre和 Roderic mackinnon关于膜蛋白分 大约一年多以后,他意识到这就是人们长期以来人子和离子通道的研究成果开创了化学、生物化学和 们一直在寻找的水分子通道( Water channel,以下生理学的一个崭新的研究领域。2003年的诺贝尔化 简称水通道),他把这种水通道蛋白质命名为学奖授予 Peter Agre和 Roderic macKinnon,以表彰 aquaporin,后来人们就用AQPs来命名水通道家族他们在探索细胞膜通道上做出的创造性贡献。图 中的每一个成员,CHIP28即被叫做AQP1,从此打是瑞典皇家科学院公布该奖时用的一张示意图。 开了对水通道生物化学、生理和基因方面的全面研这是1997年获得诺贝尔化学奖的ATP合酶三维 究。2000年Agre公布了他和他的同事应用场发射结构后又一次和同步辐射有关而获得诺贝尔奖的重 电子源的电子衍射方法得到AQP1水通道电子衍射大成果,再一次显现了同步辐射在研究膜蛋白、病 图,为了减少辐射损伤和收集大量的数据,他们同毒、核糖体等大分子结构上的优势。同步辐射光源 时应用了He冷却的电镜来协助提高分辨率,最后的高通量,高准直以及波长连续可调的优点可以解 他们得到了分辨率38A的电子密度图,就在同时决其它X射线源在生物大分子结构研究上无法解决 另一位科学家 Robert m.Stud和他的同事在的问题 Lawrence Berkeley国家实验室的 Advanced Light 第一作者:闫晓辉,女,1978年1月出生,复旦大学在读硕士研究生,凝聚态物理专业 通讯作者:张新夷 收稿日期:2003-12-22
第 27 卷 第 1 期 核 技 术 Vol. 27, No.1 2004 年 1 月 NUCLEAR TECHNIQUES January 2004 —————————————— 第一作者：闫晓辉，女，1978 年 1 月出生，复旦大学在读硕士研究生，凝聚态物理专业 通讯作者：张新夷 收稿日期：2003-12-22 细胞膜通道与同步辐射 闫晓辉 1,2 田 亮 1,2 张新夷 1,2,3 1（复旦大学物理系 上海 200433） 2（复旦大学同步辐射研究中心 上海 200433） 3（复旦大学表面物理国家重点实验室 上海 200433） 摘要 长期以来很多科学家致力于研究物质，如水和离子是如何穿过细胞膜从而完成细胞内外物质交换的。 1988 年 Peter Agre 第一次发现并描述了细胞膜水通道蛋白质的特性，Roderic MacKinnon 则在 1998 年阐明了 离子通道的结构和机理，使我们可以从原子水平了解这些精美的蛋白质结构和运行机理。由于这两位科学家 在细胞膜通道研究方面的卓越贡献，他们分享了 2003 年诺贝尔化学奖。在他们的研究中，基于同步辐射的蛋 白质结构测定发挥了很关键的作用。 关键词 同步辐射，K+通道，水通道，三维结构，细胞膜 中图分类号 Q71, O434.19 世界上每一个生物体都是由细胞组成，人体就 有成千上万多如星汉的细胞。但这些细胞不是简单 的堆积，它们彼此之间存在着信息的交流，而成为 复杂的有机整体，相互配合，完成一系列生理功能。 例如肌肉的伸缩、大脑信号的传递都是由细胞间的 信号交换和细胞内外物质和能量交换来协调完成 的，它们的实现是一个复杂的过程，所以一直是科 学家们探索的热点。 人们早就已经认识到水和其他物质，如 K+、 Na +、Ca2 +、Cl − 等离子能够经过一些孔道通过细 胞壁，但是它们的结构和功能如何实现却一直不为 人所知。1988 年 Peter Agre 第一次成功地分离出一 种膜蛋白 CHIP28[1]，分子量为 28 kDa（千道尔顿）， 大约一年多以后，他意识到这就是人们长期以来人 们一直在寻找的水分子通道（Water channel，以下 简称水通道），他把这种水通道蛋白质命名为 aquaporin，后来人们就用 AQPs 来命名水通道家族 中的每一个成员，CHIP28 即被叫做 AQP1，从此打 开了对水通道生物化学、生理和基因方面的全面研 究。2000 年 Agre 公布了他和他的同事应用场发射 电子源的电子衍射方法得到 AQP1 水通道电子衍射 图，为了减少辐射损伤和收集大量的数据，他们同 时应用了 He 冷却的电镜来协助提高分辨率，最后 他们得到了分辨率 3.8Å 的电子密度图[2]，就在同时 另一位科学家 Robert M. Stroud 和他的同事在 Lawrence Berkeley 国家实验室的 Advanced Light Source（简称 ALS），用同步辐射 X 衍射的方法得 到了一种和水通道具有相似结构的甘油通道 GlpF 分辨率为 2.2Å 的电子密度图[3]。关于膜蛋白离子通 道的结构，是 Roderic MacKinnon 第一次得到的， 他在美国 Cornell 大学高能同步光源（Cornell High Energy Synchrotron Source，简称 CHESS）通过 X 射 线 衍 射 解出 了 一 种称 为 KcsA 的 K+ 通 道 （Potassium ion channel）的原子结构，分辨率为 3.2 Å[4]。他的这一研究成果震惊了整个科技界。水 通道和 K+通道的结构是理解这些通道功能如何实 现的基础，证实并在原子水平解释了这些通道的特 性，如选择性、开关性等。 Peter Agre和Roderic MacKinnon关于膜蛋白分 子和离子通道的研究成果开创了化学、生物化学和 生理学的一个崭新的研究领域。2003 年的诺贝尔化 学奖授予 Peter Agre 和 Roderic MacKinnon，以表彰 他们在探索细胞膜通道上做出的创造性贡献。图 1 是瑞典皇家科学院公布该奖时用的一张示意图[5]。 这是 1997 年获得诺贝尔化学奖的 ATP 合酶[6]三维 结构后又一次和同步辐射有关而获得诺贝尔奖的重 大成果，再一次显现了同步辐射在研究膜蛋白、病 毒、核糖体等大分子结构上的优势。同步辐射光源 的高通量，高准直以及波长连续可调的优点可以解 决其它X射线源在生物大分子结构研究上无法解决 的问题[6]。 文章 3
核技术 第27卷 Water channel Cell membrance lon channel Cell 图1这是一幅细胞壁的示意图,它并不是一个封闭的球壳,而是有很多不同的孔道贯穿着它,这些孔道具有选择性,只能 使某种粒子或者分子通过,如同图中左图的水通道和右图的离子通道 Fig 1 Schematic architecture of membrane. It is not an impervious shell, on the contrary, it is perforated by various channels. Many of these are specially adapted to one specific ion or molecule and do not permit any other type to pass. here to the left we see a water channel and to the right an ion channe 1离子通道( lon channel) 道研究的一个重大突破,我们可以通过这种K+通 道来了解离子通道的一些特性 早在19世纪末德国物理化学家 Wilhlm ostwald 通道实际上是使K*快速扩散通过细胞膜 曾提出离子可以携带电信号通过细胞膜的观点。的一种蛋白质,在自然界中有很多种K+通道,如 20世纪20年代科学家提出了细胞膜中存在着某种脊椎动物和无脊椎动物的电压控制K+通道,脊椎 离子通道的设想。在20世纪50年代初,英国科学动物的Ca2+激发K+通道。所有K+通道的功能蛋 家 Hodgkin1和Hey在对神经元的信号传递进白质都是一个四聚体,包含有四个相同的亚基,通 行研究时,发现了Na、K+就像接力棒一样在神经过疏水分析,可以把K+通道分成两类,一类是每 细胞中传递着信息。在这一时期的研究中,发现了个亚基包含有两个跨膜片段,另一类是每一个亚基 离子通道的一些重要功能,如快速输运、选择性(特包含有六个跨膜片段。 KCSA K+通道属于前一类 别有趣的是K+通道对于Na+和K+离子有非常精确这两类K+通道结构有所不同,采用不同的开关机 的选择性,Nat的半径明显小于K+,但是Na却制,但是它们有着极其相似的离子渗透特性:(1) 不能通过K+通道)、单向传导性和开关性,但真正所有K+通道具有相同的选择顺序K+≈Rb+>Cs+ 的机制依然保持神秘。在随后的研究中,科学家应而对于Na+和Li+的渗透率都非常低,对于K+的渗 用生物物理技术,继续探索离子通道的各个组成部透率至少是Na+的10倍,高达每秒10个离子 分,认识到选择过滤器( Selectivity filter,,或称过滤(2)在K+通道中,离子队列单向地在它狭长的孔 器)和门控( Gating)是两个不同的组成部分10;道传递12),因此也被称为“长孔通道”。另外,所有 同时对于离子输运的研究,也取得了快速进展。到K+通道都可以被四乙胺TEA离子阻断。分子克隆 20世纪90年代中期,命名为Pop的离子通道家与变异实验证实了所有K+通道本质上有着相同的 族成员的选择过滤器和门控在细胞膜上的位置己经孔道结构,都有关键性保守氨基酸序列一K+通道 很清楚了,即过滤器靠近细胞膜外表面,而门控靠的信号序列,这些氨基酸突变则会破坏K+通道分 近细胞膜的内表面,也已经知道是过滤器中氧原子辨K+和Na+的能 恰当的排列决定了离子通道的选择性l但是进 K+通道能够精确区分 Pauling半径为1.3A 步证实很困难,这需要知道通道蛋白质高分辨率的的K+和095A的Na+,选择K+的精确度是Na 结构,但是由于膜蛋白的结构复杂,晶体生长的难的104倍,显示了它的选择特性;同时K+通道对 度大,不易生长出较大晶体,由常规ⅹ射线晶体学于K+有着接近扩散极限的通过率。高选择性意味 方法很难得到高分辨率的结构。直到 R. MacKinnon着K+与通道之间有很强的相互作用,但强的相互 用同步辐射ⅹ射线衍射方法,才第一次得到了一种作用和高通过率似乎又是矛盾的,这两方面如何在 来自细菌( Streptomyces lividans,结构相对简单的K+通道得到统一,是了解K+通道离子传输特点的 KCSA K+通道高分辨率的结构叫。这是对于离子通
2 核 技 术 第 27 卷 图 1 这是一幅细胞壁的示意图，它并不是一个封闭的球壳，而是有很多不同的孔道贯穿着它，这些孔道具有选择性，只能 使某种粒子或者分子通过，如同图中左图的水通道和右图的离子通道 Fig.1 Schematic architecture of membrane. It is not an impervious shell, on the contrary, it is perforated by various channels. Many of these are specially adapted to one specific ion or molecule and do not permit any other type to pass. Here to the left we see a water channel and to the right an ion channel 1 离子通道（Ion channel） 早在19世纪末德国物理化学家Wilhlm Ostwald 曾提出离子可以携带电信号通过细胞膜的观点[7]。 20 世纪 20 年代科学家提出了细胞膜中存在着某种 离子通道的设想。在 20 世纪 50 年代初，英国科学 家 Hodgkin[8]和 Huxley[9]在对神经元的信号传递进 行研究时，发现了 Na +、K+就像接力棒一样在神经 细胞中传递着信息。在这一时期的研究中，发现了 离子通道的一些重要功能，如快速输运、选择性（特 别有趣的是K+通道对于Na +和K+离子有非常精确 的选择性，Na +的半径明显小于 K+，但是 Na +却 不能通过 K+通道）、单向传导性和开关性，但真正 的机制依然保持神秘。在随后的研究中，科学家应 用生物物理技术，继续探索离子通道的各个组成部 分，认识到选择过滤器（Selectivity filter，或称过滤 器）和门控（Gating）是两个不同的组成部分[10]； 同时对于离子输运的研究，也取得了快速进展。到 20 世纪 90 年代中期，命名为 P-loop 的离子通道家 族成员的选择过滤器和门控在细胞膜上的位置已经 很清楚了，即过滤器靠近细胞膜外表面，而门控靠 近细胞膜的内表面，也已经知道是过滤器中氧原子 恰当的排列决定了离子通道的选择性 [11]。但是进一 步证实很困难，这需要知道通道蛋白质高分辨率的 结构，但是由于膜蛋白的结构复杂，晶体生长的难 度大，不易生长出较大晶体，由常规 X 射线晶体学 方法很难得到高分辨率的结构。直到 R. MacKinnon 用同步辐射 X 射线衍射方法，才第一次得到了一种 来自细菌（Streptomyces lividans），结构相对简单的 KcsA K+通道高分辨率的结构[4]。这是对于离子通 道研究的一个重大突破，我们可以通过这种 K+通 道来了解离子通道的一些特性。 K+ 通道实际上是使 K+快速扩散通过细胞膜 的一种蛋白质，在自然界中有很多种 K+通道，如： 脊椎动物和无脊椎动物的电压控制 K+通道，脊椎 动物的 Ca2 +激发 K+通道。所有 K+通道的功能蛋 白质都是一个四聚体，包含有四个相同的亚基，通 过疏水分析，可以把 K+通道分成两类，一类是每 个亚基包含有两个跨膜片段，另一类是每一个亚基 包含有六个跨膜片段。KcsA K+通道属于前一类。 这两类 K+通道结构有所不同，采用不同的开关机 制，但是它们有着极其相似的离子渗透特性：（1） 所有 K+通道具有相同的选择顺序 K+ ≈Rb + Cs +， 而对于 Na +和 Li +的渗透率都非常低，对于 K+的渗 透率至少是 Na +的 104 倍，高达每秒 108 个离子。 （2）在 K+通道中，离子队列单向地在它狭长的孔 道传递[12]，因此也被称为“长孔通道”。另外，所有 K+ 通道都可以被四乙胺 TEA 离子阻断。分子克隆 与变异实验证实了所有 K+通道本质上有着相同的 孔道结构，都有关键性保守氨基酸序列─K + 通道 的信号序列，这些氨基酸突变则会破坏 K+通道分 辨 K+和 Na +的能力。 K+通道能够精确区分 Pauling 半径为 1.33 Å 的 K+和 0.95 Å 的 Na +，选择 K+的精确度是 Na + 的 104 倍，显示了它的选择特性；同时 K+ 通道对 于 K+有着接近扩散极限的通过率。高选择性意味 着 K+与通道之间有很强的相互作用，但强的相互 作用和高通过率似乎又是矛盾的，这两方面如何在 K+通道得到统一，是了解 K+通道离子传输特点的
第1期 闫晓辉等:细胞膜通道与同步辐射 难题。 一个宽约为10A的洞穴,K+以和水结合的状态在 R. MacKinnon使用 KCSA K+通道结构揭示了内孔道和洞穴中移动。组成内孔道和洞穴壁的化学 K+通道的特性。把 KCSA K+通道的23-119残基段成分都是疏水的。在洞穴上面部分是选择过滤器 用多对同晶置换处理后,生长成晶体,经过对X射它要把K+从外部溶液中分离出来,所以非常狭窄, 线衍射实验数据的收集、处理、本底和噪音的排除,K+必须脱水才能进入。选择过滤器按照主链的信 得到了高分辨率的K+通道结构4 11 KesA K+通道的结构 KCSA K+通道是关于中心孔道四重对称的四聚 体,如图2所示。每个亚基都有两条跨膜α螺旋 约有30个氨基酸在孔道区域,这些氨基酸组成了孔 道螺旋和选择过滤器。两条跨膜螺旋中的一条面对 着中心孔道为内螺旋,另一条面对细胞膜脂质的是 外螺旋。内螺旋相对于细胞膜有约25°的倾斜,并 且略微扭绞,使每个亚基就像盛开的花瓣面对着细 图3 KCSA K+通道分子表面和孔道轮廓图 胞外,靠近膜外表面的孔道区域有K+通道的信号 Fig 3 Molecular surface of Kcs A and contour of the pore 序列,它们形成了选择过滤器。这个区域还有4条 孔道螺旋。内螺旋彼此绞在一起成一東,形成倒置 当K+在狭窄的孔道中运动时,由它所激发的 的圆锥形帐篷的四个柱子,孔道螺旋插在柱子与柱 静电场使它的周围环境极化,使偶极子的负端接近 子之间,指向靠近通道中心的一点。这种孔道螺旋K+从而使离子稳定,但是在膜中央极化率最低 的排列方式使众多的内部单元连接起来,从而使四K+的能量最高,洞穴为了克服由于绝缘性的膜而引 聚体结合在一起,这对离子在孔道中的传输非常重起的静电场的不稳定性,在洞穴中用可极化的水包 要。所有K+通道的孔道区域和内螺旋的氨基酸序 围着离子。K+通道的另一个结构特点也是为了稳定 列是保守的,Na+通道和Ca2+通道也有相应的片K,就是直接指向洞穴中心的四个孔道螺旋,这些 段,所以圆锥形帐篷结构可能是所有离子通道普遍 螺旋中从氨基到羧基的方向也在空穴中心处加了 的特性 个负的静电场,虽然每个螺旋离洞穴比较远(8A), 但四个螺旋同时起作用,从而加大了影响。因此 6 充水的洞穴和定向的螺旋解决了一个基本的物理问 题一如何降低离子通过时遇到的静电场的障碍。如 果为了克服膜中央不稳定的静电场的影响,可以使 整个孔道都具有一个可极化的表面,但是这将会影 响离子通道的透过率,因为K+会和通道表面发生 强相互作用而被陷入通道。所以这种除了选择过滤 器表面都是疏水的结构提供了相对惰性的表面,减 少了对透过率的影响 1.2选择过滤器 图2 KOSAK+通道的结构模型,左边是从膜外看的俯视图, 离子通道选择离子的准确性是通过选择过滤器 右边是侧视图 实现的。选择过滤器的结构有两个基本的特征:第 Fig 2 Structure of the KcsA K+, platform view form outside 在过滤器中,有四个分别来自四个亚基的 f the membrane (left), side elevation(right) TVGYG序列,它们的羰基氧原子指向离子通道的 对于正离子通道,在通道的内外入口的氨基酸中心,这种排列提供了四个可能的离子束缚位置(见 提供了一些负电荷,这样的结构提高了正离子浓度,图4)。这四个位置分别用1、2、3、4来表示,脱 降低了负离子的浓度。孔道全长为45A,它的直径水状态的K+可被束缚在这些位置上,周围围绕着 则各处不同(见图3),从膜的内表面开始是一个长个氧原子,13位置的8个氧原子均来自主链羰基 18A的隧道内孔道,然后在接近细胞膜中心处张成4位置上有4个氧原子来自于主链羰基,4个来自
第 1 期 闫晓辉等：细胞膜通道与同步辐射 3 难题。 R. MacKinnon 使用 KcsA K+通道结构揭示了 K+通道的特性。把 KcsA K+通道的 23—119 残基段 用多对同晶置换处理后，生长成晶体，经过对 X 射 线衍射实验数据的收集、处理、本底和噪音的排除， 得到了高分辨率的 K+通道结构[4]。 1.1 KcsA K+ 通道的结构 KcsA K+通道是关于中心孔道四重对称的四聚 体，如图 2 所示。每个亚基都有两条跨膜 螺旋， 约有 30 个氨基酸在孔道区域，这些氨基酸组成了孔 道螺旋和选择过滤器。两条跨膜螺旋中的一条面对 着中心孔道为内螺旋，另一条面对细胞膜脂质的是 外螺旋。内螺旋相对于细胞膜有约 25°的倾斜，并 且略微扭绞，使每个亚基就像盛开的花瓣面对着细 胞外，靠近膜外表面的孔道区域有 K+通道的信号 序列，它们形成了选择过滤器。这个区域还有 4 条 孔道螺旋。内螺旋彼此绞在一起成一束，形成倒置 的圆锥形帐篷的四个柱子，孔道螺旋插在柱子与柱 子之间，指向靠近通道中心的一点。这种孔道螺旋 的排列方式使众多的内部单元连接起来，从而使四 聚体结合在一起，这对离子在孔道中的传输非常重 要。所有 K+通道的孔道区域和内螺旋的氨基酸序 列是保守的，Na +通道和 Ca2 +通道也有相应的片 段，所以圆锥形帐篷结构可能是所有离子通道普遍 的特性。 图 2 KcsA K +通道的结构模型，左边是从膜外看的俯视图， 右边是侧视图 Fig.2 Structure of the KcsA K+ , platform view form outside of the membrane (left), side elevation (right) 对于正离子通道，在通道的内外入口的氨基酸 提供了一些负电荷，这样的结构提高了正离子浓度， 降低了负离子的浓度。孔道全长为 45 Å，它的直径 则各处不同（见图 3），从膜的内表面开始是一个长 18 Å 的隧道内孔道，然后在接近细胞膜中心处张成 一个宽约为 10 Å 的洞穴，K+以和水结合的状态在 内孔道和洞穴中移动。组成内孔道和洞穴壁的化学 成分都是疏水的。在洞穴上面部分是选择过滤器， 它要把 K+从外部溶液中分离出来，所以非常狭窄， K+ 必须脱水才能进入。选择过滤器按照主链的信 号序列排列。 图 3 KcsA K+通道分子表面和孔道轮廓图 Fig.3 Molecular surface of KcsA and contour of the pore 当 K+在狭窄的孔道中运动时，由它所激发的 静电场使它的周围环境极化，使偶极子的负端接近 K+从而使离子稳定，但是在膜中央极化率最低， K+的能量最高，洞穴为了克服由于绝缘性的膜而引 起的静电场的不稳定性，在洞穴中用可极化的水包 围着离子。K+通道的另一个结构特点也是为了稳定 K+，就是直接指向洞穴中心的四个孔道螺旋，这些 螺旋中从氨基到羧基的方向也在空穴中心处加了一 个负的静电场，虽然每个螺旋离洞穴比较远（8 Å）， 但四个螺旋同时起作用，从而加大了影响。因此， 充水的洞穴和定向的螺旋解决了一个基本的物理问 题─如何降低离子通过时遇到的静电场的障碍。如 果为了克服膜中央不稳定的静电场的影响，可以使 整个孔道都具有一个可极化的表面，但是这将会影 响离子通道的透过率，因为 K +会和通道表面发生 强相互作用而被陷入通道。所以这种除了选择过滤 器表面都是疏水的结构提供了相对惰性的表面，减 少了对透过率的影响。 1.2 选择过滤器 离子通道选择离子的准确性是通过选择过滤器 实现的。选择过滤器的结构有两个基本的特征：第 一，在过滤器中，有四个分别来自四个亚基的 TVGYG 序列，它们的羰基氧原子指向离子通道的 中心，这种排列提供了四个可能的离子束缚位置（见 图 4）。这四个位置分别用 1、2、3、4 来表示，脱 水状态的 K+可被束缚在这些位置上，周围围绕着 8 个氧原子，1—3位置的8个氧原子均来自主链羰基， 4 位置上有 4 个氧原子来自于主链羰基，4 个来自
核技术 第27卷 Thr侧链,K+只能从一个位置跃到另一个位置进行这种离子通道的原因。 扩散。这样的结构是为了补偿K+从外部溶液进入 过滤器时由脱水而引起的能量损失,这些氧原子则 替代了水中的氧原子,使K+保持了相同的配位结 构。第二,过滤器周围有蛋白质包围(见图5),Val 和Tyr侧链从vGYG序列指离孔道并且和孔道螺旋 相互作用,4个Iyr侧链和8个孔道螺旋Tp芳香 族氨基酸残基,像一个“护腕”环绕着过滤器。氢键 (例如在Tyr的烃基和Trp的氮之间的氢键)和在 “护腕”内的范德瓦尔斯力使这种结构像一层径向伸 缩的弹簧,拉着孔道张成合适的尺寸,使孔道中的 图4K+在孔道中的束缚位置,图中小球表示K+ 羰基氧原子和脱水的K+之间的配位尺寸与K+在水 (a)为剖面图,(b)为近视图 溶液中相同,阻止羰基氧原子过分接近Na+在水溶 Fig 4 Binding s tassium ions in the Kcsa K 液中的配位尺寸,而使Na+也能进入孔道。这就是 hannel, the balls represent the potassium ions (a)cutaway view,(b)close-up view 较大的K+能通过,而较小的Na+却反而不能通过 w61 Cr-Y 图5选择过滤器的结构图,左图为电子密度图,中图为结构示意图,右图为包围着过滤器的“护腕”的结构示意图 6.5 Detailed views of the K channel selectivity filter, the left picture on the top is the stereo-view of the experimental electre density in the selectivity filter, the middle one is the stereo-view of the selectivity filter, the right one is view of the "cuff"that surrounding the selectivity filter 通过对比分析Rb+和K+在K+通道中的电子密构中央,4个来自过滤器的氧原子在一个平面,而 度图,研究了K+在通道中的分布和传导机制13。水分子的氧原子则在八面体的顶端,这种配位结构 在不同的Rb+和K+浓度下(3-300mmol/L)生长也在缬氨霉素中被观察到。在洞穴处只有一个K+ 晶体,应用同步辐射X射线衍射得到它们的电子密(见图5) 度图(图6)。图中给出的是一维的电子密度图,峰 值表示离子可能所在的位置,在正常的生理条件下 1.4 r Position K+溶液的浓度相对较高,有四个高度近似相同的 峰,峰之间的间隔为3.2A。如果每个峰对应之处都 被占据一个K+,是一种不稳定的状态,因为由于 相互作用两个K+的最近距离不能小于3.5A。由此 3 mM 可以判断只有两个K+在过滤器中,并在两个K+ 间插进了一个水分子。K+分别占据1,3或2,4的 位置。当一个外部的K进入过滤器时,在另一端将 会有一个K+离开。K+处在1,3或2,4状态时,每 个K+是处在一个有8个氧原子组成的长方体盒子 Filter position/A 的中央,在抗生无活性菌中观测到了这种结构。当 K+在1,3和2,4的转换过程中,则处在八面体结图6在不同的K+浓度下生长的K+通道一维的电子密度
4 核 技 术 第 27 卷 Thr 侧链，K+只能从一个位置跃到另一个位置进行 扩散。这样的结构是为了补偿 K +从外部溶液进入 过滤器时由脱水而引起的能量损失，这些氧原子则 替代了水中的氧原子，使 K+ 保持了相同的配位结 构。第二，过滤器周围有蛋白质包围（见图 5），Val 和 Tyr 侧链从 VGYG 序列指离孔道并且和孔道螺旋 相互作用，4 个 Tyr 侧链和 8 个孔道螺旋 Trp 芳香 族氨基酸残基，像一个“护腕”环绕着过滤器。氢键 （例如在 Tyr 的烃基和 Trp 的氮之间的氢键）和在 “护腕”内的范德瓦尔斯力使这种结构像一层径向伸 缩的弹簧，拉着孔道张成合适的尺寸，使孔道中的 羰基氧原子和脱水的K+之间的配位尺寸与K+在水 溶液中相同，阻止羰基氧原子过分接近 Na +在水溶 液中的配位尺寸，而使 Na +也能进入孔道。这就是 较大的 K+能通过，而较小的 Na +却反而不能通过 这种离子通道的原因。 图 4 K+在孔道中的束缚位置，图中小球表示 K+ (a)为剖面图，(b)为近视图 Fig.4 Binding sites for potassium ions in the KcsA K+ channel, the balls represent the potassium ions: (a) cutaway view，(b) close-up view 图 5 选择过滤器的结构图，左图为电子密度图，中图为结构示意图，右图为包围着过滤器的“护腕”的结构示意图 Fig.5 Detailed views of the K+ channel selectivity filter, the left picture on the top is the stereo-view of the experimental electron density in the selectivity filter, the middle one is the stereo-view of the selectivity filter, the right one is view of the “cuff” that surrounding the selectivity filter 通过对比分析Rb +和K+在K+通道中的电子密 度图，研究了 K+在通道中的分布和传导机制[13]。 在不同的 Rb +和 K+浓度下（3—300 mmol/L）生长 晶体，应用同步辐射 X 射线衍射得到它们的电子密 度图（图 6）。图中给出的是一维的电子密度图，峰 值表示离子可能所在的位置，在正常的生理条件下， K+溶液的浓度相对较高，有四个高度近似相同的 峰，峰之间的间隔为 3.2 Å。如果每个峰对应之处都 被占据一个 K+，是一种不稳定的状态，因为由于 相互作用两个 K+的最近距离不能小于 3.5 Å。由此 可以判断只有两个 K+在过滤器中，并在两个 K+之 间插进了一个水分子。K+分别占据 1，3 或 2，4 的 位置。当一个外部的 K+进入过滤器时，在另一端将 会有一个 K+离开。K+处在 1，3 或 2，4 状态时，每 一个 K+是处在一个有 8 个氧原子组成的长方体盒子 的中央，在抗生无活性菌中观测到了这种结构。当 K+在 1，3 和 2，4 的转换过程中，则处在八面体结 构中央，4 个来自过滤器的氧原子在一个平面，而 水分子的氧原子则在八面体的顶端，这种配位结构 也在缬氨霉素中被观察到。在洞穴处只有一个 K+ （见图 5）。 图 6 在不同的 K+浓度下生长的 K+通道一维的电子密度 Filter position / Å (a) (b)
第1期 闫晓辉等:细胞膜通道与同步辐射 决车图体停不的的能置的付图线在适合开放状态下生长Mh通道,两者结构有所 不相同 不同,KcAK+通道的内螺旋是直的并且在膜的内 Fg6 One-dimensional electron density p profiles of the表面扭绞在一起形成一束,在孔道处的直径窄小到 channels that crystals grown in the presence of different3.5A,并且排列有疏水的氨基酸,形成了 个K Cl concentrations, the peaks show the possible positions of 通过的障碍,表现出了关闭的形态15。而MthK的 内螺旋在孔道处有一个铰链点,内螺旋可以在这点 13门控 弯曲、张开,形成一种开放的形态16。在大多数的 门控是离子通道的另一个重要组成部分,是靠K+通道内螺旋都有一个保守的氨基乙酸的铰链点, 近孔道的一个区域,它控制着离子通道的开关。离如图8中箭头所指,内螺旋可以在这点开、关,使 子通道在一定的刺激下打开,让离子通过。使离子通道开放或关闭。 通道开关的方式有许多不同的类型,如电压控制 ( Voltage gated),配基控制( Ligand gated)等等 电压控制通道是通过“电压传感器”(一种蛋白质) 把电场能量转换成机械能,配基控制通道是把配位 基束缚的能量转换成机械能。所以离子通道的门控 就是使开关部分和孔道部分通过电能一机械能或化 学能一机械能的转化而连接起来 333 图8离子通道的开和关的构造图,左面的为 KCSA K+通道, 处在关闭状态,右图是MtK处于打开状态 Fig 8 Closed and opened conformations of the pore closed pore conformation of Kcsa (left) and the opened conformation of Mthk (right) 2水通道 对于水通道的研究可追溯到19世纪中叶,人们 已经肯定在细胞膜上有开关,水和盐可以通过。在20 世纪50年代,通过对于水通过细胞膜机制研究,发 现有两种方式:一种是扩散,这需要高的激活能 Ea>l0 kcal/mol:另一种就是水流快速通过细胞膜伴 随着低的激活能,Eax<5 kcal/mol,和水分子在液体中 运动的激活能接近,根据这种运输机制提出了一种假 说,即存在水分子通道。在随后的研究中,发现了这 种水分子通道的特性:选择性,除HO外,其它小分 子,离子和HO是不能通过的;水在通道中是双向 传输的。但是它的结构并不被人所知。人们曾通过氨 基酸序列解析和辐射靶分析等方法来探索水分子通 道的结构,逐步了解到了水通道结构的一些特性。 0.5 min mIn 3.5 min 图7K+在过滤器中的传输周期示意图(a),K+在传输过程 中八个和六个配位氧原子的示意图(b) Fig.7 The throughput cycle for K ions(a), the structures of K ion exhibit coordination by eight and six oxygen 通过研究另一种K+通道MthK的结构4,并 和 KCSA K+通道结构进行比较,可以清楚地看到 这两种离子通道的开关是通过结构的变化来实现的 (见图7)。在适合通道关闭的状态下结晶KcsA和图9上图显示注射了AOP1的 Xenopus卵母细胞在低渗透 性的媒质中快速的膨胀,下图为没有注射AQP1的卵母细胞
第 1 期 闫晓辉等：细胞膜通道与同步辐射 5 图( 为电子密度)，峰值表示的是离子可能所处的位置，在 不同浓度下生长的晶体中的 K+所占据的位置不同，曲线也 不相同 Fig.6 One-dimensional electron density profiles of the K+ channels that crystals grown in the presence of different KCl concentrations, the peaks show the possible positions of the ion 1.3 门控 门控是离子通道的另一个重要组成部分，是靠 近孔道的一个区域，它控制着离子通道的开关。离 子通道在一定的刺激下打开，让离子通过。使离子 通道开关的方式有许多不同的类型，如电压控制 （Voltage gated），配基控制（Ligand gated）等等。 电压控制通道是通过“电压传感器”（一种蛋白质） 把电场能量转换成机械能，配基控制通道是把配位 基束缚的能量转换成机械能。所以离子通道的门控 就是使开关部分和孔道部分通过电能—机械能或化 学能—机械能的转化而连接起来。 图 7 K+在过滤器中的传输周期示意图(a)，K+在传输过程 中八个和六个配位氧原子的示意图(b) Fig.7 The throughput cycle for K ions (a), the atomic structures of K ion exhibit coordination by eight and six oxygen atoms (b) 通过研究另一种 K+通道 MthK 的结构[14]，并 和 KcsA K+通道结构进行比较，可以清楚地看到， 这两种离子通道的开关是通过结构的变化来实现的 （见图 7）。在适合通道关闭的状态下结晶 KcsA 和 在适合开放状态下生长 MthK 通道，两者结构有所 不同，KcsA K+通道的内螺旋是直的并且在膜的内 表面扭绞在一起形成一束，在孔道处的直径窄小到 3.5 Å，并且排列有疏水的氨基酸，形成了一个 K+ 通过的障碍，表现出了关闭的形态[15]。而 MthK 的 内螺旋在孔道处有一个铰链点，内螺旋可以在这点 弯曲、张开，形成一种开放的形态[16]。在大多数的 K+通道内螺旋都有一个保守的氨基乙酸的铰链点， 如图 8 中箭头所指，内螺旋可以在这点开、关，使 通道开放或关闭。 图 8 离子通道的开和关的构造图，左面的为 KcsA K+通道， 处在关闭状态，右图是 MthK 处于打开状态 Fig.8 Closed and opened conformations of the pore. The closed pore conformation of KcsA (left) and the opened pore conformation of MthK (right) 2 水通道 对于水通道的研究可追溯到 19 世纪中叶，人们 已经肯定在细胞膜上有开关，水和盐可以通过。在20 世纪 50 年代，通过对于水通过细胞膜机制研究，发 现有两种方式：一种是扩散，这需要高的激活能 Ea 10 kcal/mol；另一种就是水流快速通过细胞膜伴 随着低的激活能，Ea5 kcal/mol，和水分子在液体中 运动的激活能接近，根据这种运输机制提出了一种假 说，即存在水分子通道。在随后的研究中，发现了这 种水分子通道的特性：选择性，除 H2O 外，其它小分 子，离子和 H3O+是不能通过的；水在通道中是双向 传输的。但是它的结构并不被人所知。人们曾通过氨 基酸序列解析和辐射靶分析等方法来探索水分子通 道的结构，逐步了解到了水通道结构的一些特性。 图 9 上图显示注射了 AQP1 的 Xenopus 卵母细胞在低渗透 性的媒质中快速的膨胀，下图为没有注射 AQP1 的卵母细胞 (a) (b) 0.5 min 1.5 min 2.5 min 3.5 min
核技术 第27卷 没有很大的变化 把经过提纯的高浓度的AQP1蛋白质重构在人 Fig 9 Xenopus oocytes microinjected with AQPl mRNA 工合成的脂质膜上,生长成具有对称性的蛋白质晶 swell rapidly when placed in a hypo-osmotic medium( top), contrast to noninjected oocytes(below) 体,应用AFM、电镜、低温电子显微镜等观察它的 在190年前后PAge和他的同事首先发现的微观结构,并且用X射线衔射和定位诱变实验分析 CHP28(即AQP1)这种蛋白质大量存在于哺乳动证实了AQP1的结构(见图10)P。它的结构和所 物的血红细胞和肾小管中,当把AQPl注射到透水有离子通道相似,也是一个四聚体,有四个相同的 性很低 Xenopus卵母细胞的细胞膜上1,经过测试 亚基,每个亚基有6条倾斜的α螺旋,分成两组 发现它的透水性明显增加,在媒质中会逐渐膨胀, 每组3条,有一个环连接着每组中第二和第三条α 甚至胀裂(见图9)。但是这种能力的加强会被Hg2 螺旋,这个环上包含着高度保守的残基和信号基序 削弱。其他实验也显示了这样的特性。含有AQP1 asparagine-proline-alanine(NPA)。这两个环从膜 的膜的透水性比没有AQP1的膜要高约100倍,同不同的表面进入细胞膜,并置在膜中央,它们所包 时这两种水渗透都是由渗透梯度决定,因此,可以含的两个α螺旋形成了侧链 认为AQP1就是一个水通道 Restriction R ug tation Intracellular 图10左图是一个AQP1亚基的结构图,右图为AQP1的隧道结构示意图 水通道是禁止小分子、离子、H3O通过的。在了质子和其他带正电荷的粒子进入。在孔道壁上4 液体中,水分子以氢键结合,在溶液中质子可以快个缩氨酸骨架上的羰基氧原子排成一串,如图11 速在邻近的水分子间交换。为了阻止H3O+的通过,所示的G188、C189、G190和1191,它们在能量上 AQP1形成一种特殊的沙漏型结构(见图10),它有替代了氢键,补偿了水被分离时的能量改变。当水 锥形的细胞外门廊和细胞内门廊,门廊内充满了水,分子继续下落,在要退出隧道进入充满细胞质的门 连接两个门廊的是一个20A的狭窄隧道,在这个隧廊时会和第二串缩氨酸骨架上的羰基氧原子作用。 道中,水分子只能单独行进而不能和其他水分子以这几个与为数不多和水分子发生相互作用的氧原子 氢键相连。隧道最窄的部分在隧道中心以上8A处为水分子快速通过通道做出了贡献。这些预测都被 (在图10中标有 Size restriction处),它的直径只分子动力学所证实。另外,位于隧道中和R195、 有28A,和一个水分子的范德瓦尔斯半径相近。这H180同一水平的特殊残基烃基谷氨酸Cl89(图11) 个隧道面上疏水的残基来自于跨膜α螺旋,隧道的中的氢硫基会和Hg2+结合,从而堵塞了通道,可说 一部分表面来自于α螺旋的苯基丙氨酸F56和侧链明AQP1对于Hg2+的敏感性 的精氨酸R195(它们的位置参看图11),精氨酸提 在隧道一半位置处,两个信号NPA基序通过范 供了一个固定不变的正电荷,这是所有水通道都具德瓦尔斯力形成一个准二重对称的平行排列。由两 有的。在对面的表面上有一个组氨酸分子H180,在个彼此面对的沿孔道排列的短α螺旋形成偶极子 中性PH下,它提供部分正电荷,这也是所有水通(见图10右图),产生部分正电荷包围着NPA基序 道都具有的特点。R95和H180对于大于水分子的上的天冬酰胺酸 asparagine(N76和N192)。可以认 分子起到了尺度限制的作用,固有的正电荷则抵制为水分子和每一个天冬酰胺酸形成短暂的部分氢
6 核 技 术 第 27 卷 没有很大的变化 Fig.9 Xenopus oocytes microinjected with AQP1 mRNA swell rapidly when placed in a hypo-osmotic medium (top), in contrast to noninjected oocytes (below) 在 1990 年前后 P. Agre 和他的同事首先发现的 CHIP28（即 AQP1）这种蛋白质大量存在于哺乳动 物的血红细胞和肾小管中，当把 AQP1 注射到透水 性很低Xenopus卵母细胞的细胞膜上[17]，经过测试， 发现它的透水性明显增加，在媒质中会逐渐膨胀， 甚至胀裂（见图 9）。但是这种能力的加强会被 Hg2 + 削弱。其他实验也显示了这样的特性。含有 AQP1 的膜的透水性比没有 AQP1 的膜要高约 100 倍，同 时这两种水渗透都是由渗透梯度决定，因此，可以 认为 AQP1 就是一个水通道。 把经过提纯的高浓度的 AQP1 蛋白质重构在人 工合成的脂质膜上，生长成具有对称性的蛋白质晶 体，应用 AFM、电镜、低温电子显微镜等观察它的 微观结构，并且用 X 射线衍射和定位诱变实验分析 证实了 AQP1 的结构（见图 10）[2]。它的结构和所 有离子通道相似，也是一个四聚体，有四个相同的 亚基，每个亚基有 6 条倾斜的 螺旋，分成两组， 每组 3 条，有一个环连接着每组中第二和第三条 螺旋，这个环上包含着高度保守的残基和信号基序 asparagine-proline-alanine（NPA）。这两个环从膜 不同的表面进入细胞膜，并置在膜中央，它们所包 含的两个螺旋形成了侧链。 图 10 左图是一个 AQP1 亚基的结构图，右图为 AQP1 的隧道结构示意图 Fig.10 Structure of AQP1 subunit (right) and schematic of water transport (left) 水通道是禁止小分子、离子、H3O+通过的。在 液体中，水分子以氢键结合，在溶液中质子可以快 速在邻近的水分子间交换。为了阻止 H3O+的通过， AQP1 形成一种特殊的沙漏型结构（见图 10），它有 锥形的细胞外门廊和细胞内门廊，门廊内充满了水， 连接两个门廊的是一个 20 Å 的狭窄隧道，在这个隧 道中，水分子只能单独行进而不能和其他水分子以 氢键相连。隧道最窄的部分在隧道中心以上 8 Å 处 （在图 10 中标有 Size restriction 处），它的直径只 有 2.8 Å，和一个水分子的范德瓦尔斯半径相近。这 个隧道面上疏水的残基来自于跨膜 螺旋，隧道的 一部分表面来自于螺旋的苯基丙氨酸 F56 和侧链 的精氨酸 R195（它们的位置参看图 11），精氨酸提 供了一个固定不变的正电荷，这是所有水通道都具 有的。在对面的表面上有一个组氨酸分子 H180，在 中性 PH 下，它提供部分正电荷，这也是所有水通 道都具有的特点。R195 和 H180 对于大于水分子的 分子起到了尺度限制的作用，固有的正电荷则抵制 了质子和其他带正电荷的粒子进入。在孔道壁上 4 个缩氨酸骨架上的羰基氧原子排成一串，如图 11 所示的 G188、C189、G190 和 I191，它们在能量上 替代了氢键，补偿了水被分离时的能量改变。当水 分子继续下落，在要退出隧道进入充满细胞质的门 廊时会和第二串缩氨酸骨架上的羰基氧原子作用。 这几个与为数不多和水分子发生相互作用的氧原子 为水分子快速通过通道做出了贡献。这些预测都被 分子动力学所证实。另外，位于隧道中和 R195、 H180 同一水平的特殊残基烃基谷氨酸 C189（图 11） 中的氢硫基会和 Hg2 +结合，从而堵塞了通道，可说 明 AQP1 对于 Hg2 +的敏感性。 在隧道一半位置处，两个信号 NPA 基序通过范 德瓦尔斯力形成一个准二重对称的平行排列。由两 个彼此面对的沿孔道排列的短 螺旋形成偶极子 (见图 10 右图)，产生部分正电荷包围着 NPA 基序 上的天冬酰胺酸 asparagine (N76 和 N192)。可以认 为水分子和每一个天冬酰胺酸形成短暂的部分氢
第1期 闫晓辉等:细胞膜通道与同步辐射 键,把水分子看成一个偶极子,水分子在经过水通展也是促进科学家对它们了解的重要因素,同步辐 道时由于氢键作用会发生转向,图10的右图还形象射优势在这里被充分的表现出来,它也将在后来的 地显示了水分子通过通道的整个过程,当水分子从研究中发挥更大的作用 外部进入通道,氧原子受到正电荷的吸引面转向下 对细胞膜分子通道的结构能有如此精细的了 当在和天冬酰胺酸作用时,会发生弹跳,继续行进解,得益于同步辐射的X射线结构分析。但也应该 时,氧原子的面又会转向上。 看到我们现在得到的蛋白质结构是很多分子的平均 结果,而且具有活性的蛋白质分子都处于运动之中 为了更进一步揭示生命过程所有微妙的细节,我们 需要能够对单个生物大分子进行X射线衍射结构分 析。对于这样的要求,目前世界上最好的同步辐射 光源,也因亮度不够和光源尺寸不够小而爱莫能助。 值得庆幸的是,以自由电子激光为代表的第四代同 步辐射光源,在本世纪的第一个十年即可投入运行, 与第三代同步辐射光源相比,预计亮度将提高10 个数量级,电子束团的尺寸缩小100倍18!可以确 信,生命科学的研究又将翻开新的一页! 参考文献 I Denker B M, Smith B L, Kuhajda F P, et al. J Biol Chem Inhibition 1988,263(30):15634-1 (6804):599-605 3 Fu D. Libson A. Mierke L J. et al. Science. 2000. 290 图11AQP1单元的横向原子示意图,水分子在隧道最窄处 (5491):481-486 被F56、R195、H180和C189包围;G188、c189、G1904 Doyle D, Cabral J, Pfuetzner r,eral. Science,1998,280 和I91替代了氢键的作用 Fig 11 Atomic model of AQPI subunit in horizontal 5http://www.nobel.se of the channel surrounded by functionally important residues6田亮,张新夷.核技术,200326(1):28 (F56, R195, H180, and C189). hydrogen bonding occurs between carbonyl oxygen atoms on the peptide backbone 7 Ostwald w. Z Phys Chem, 71-82 (G188, C189, G190, and 1191)at the other surface of the pore 8 Hodgkin A L. The ionic basis of nerve conduction. In 3结束语 Amsterdam: Elsevier Publishing Company, 1970 细胞膜的通道是任何生命体生存的前提条件,9 luxley A F. The quantitative analysis of excitation and 因此很好地理解它们的功能对于了解很多疾病非常 conduction in nerve. In Nobel Lectures in Physiology or 重要。如各种形式的脱水、对于热的敏感以及肾脏 Medicine 1963-1970. Amsterdam: Elsevier Publishing 功能的紊乱,都与水通道的效率有关。在保持体液 Company, 1970 平衡的过程中,水通道至关重要。离子通道的功能0 rmstrong C M. Quart Rev Biophys,1973.7:19210 紊乱也会导致神经系统、肌肉和心脏的种种疾病, 11 Armstrong C M, Hille B Neuron, 1998, 20(3): 371-380 因此水通道和离子通道成了制药业的重要的药物目12 odgkin A L, Keynes. ys,193138 P Agre发现的水通道和 R. MacKinnon对于K+ 13 Morais-Cabral J H, Zhou Y, MacKinnon R. Nature, 2001 通道结构和功能细节的研究,在生物学和生物化学 414(6859):37-42 上开创了一个全新的研究领域,使我们可以在分子14 Jiang Y,LeA,Chen, et al. Nature200417(688y 和原子水平“看”到这些分子机器美妙的设计,从而 515-522 使我们从分子和原子水平来理解生命的基础过程成 15 Heginbotham L, LeMasurier M, Kolmakova-Partensky L, 为可能。在对它们长时间的探索中,科学技术的发 et al. Gen Physiol. 1999. 114(4): 551-560
第 1 期 闫晓辉等：细胞膜通道与同步辐射 7 键，把水分子看成一个偶极子，水分子在经过水通 道时由于氢键作用会发生转向，图 10 的右图还形象 地显示了水分子通过通道的整个过程，当水分子从 外部进入通道，氧原子受到正电荷的吸引面转向下， 当在和天冬酰胺酸作用时，会发生弹跳，继续行进 时，氧原子的面又会转向上。 图 11 AQP1 单元的横向原子示意图，水分子在隧道最窄处 被 F56、R195、 H180 和 C189 包围； G188、 C189、G190 和 I191 替代了氢键的作用 Fig.11 Atomic model of AQP1 subunit in horizontal cross-section, a single water molecule at the narrowest segment of the channel surrounded by functionally important residues (F56, R195, H180, and C189). hydrogen bonding occurs between carbonyl oxygen atoms on the peptide backbone (G188, C189, G190, and I191) at the other surface of the pore 3 结束语 细胞膜的通道是任何生命体生存的前提条件， 因此很好地理解它们的功能对于了解很多疾病非常 重要。如各种形式的脱水、对于热的敏感以及肾脏 功能的紊乱，都与水通道的效率有关。在保持体液 平衡的过程中，水通道至关重要。离子通道的功能 紊乱也会导致神经系统、肌肉和心脏的种种疾病， 因此水通道和离子通道成了制药业的重要的药物目 标。 P. Agre 发现的水通道和 R. MacKinnon 对于 K+ 通道结构和功能细节的研究，在生物学和生物化学 上开创了一个全新的研究领域，使我们可以在分子 和原子水平“看”到这些分子机器美妙的设计，从而 使我们从分子和原子水平来理解生命的基础过程成 为可能。在对它们长时间的探索中，科学技术的发 展也是促进科学家对它们了解的重要因素，同步辐 射优势在这里被充分的表现出来，它也将在后来的 研究中发挥更大的作用。 对细胞膜分子通道的结构能有如此精细的了 解，得益于同步辐射的 X 射线结构分析。但也应该 看到我们现在得到的蛋白质结构是很多分子的平均 结果，而且具有活性的蛋白质分子都处于运动之中， 为了更进一步揭示生命过程所有微妙的细节，我们 需要能够对单个生物大分子进行X射线衍射结构分 析。对于这样的要求，目前世界上最好的同步辐射 光源，也因亮度不够和光源尺寸不够小而爱莫能助。 值得庆幸的是，以自由电子激光为代表的第四代同 步辐射光源，在本世纪的第一个十年即可投入运行， 与第三代同步辐射光源相比，预计亮度将提高 10 个数量级，电子束团的尺寸缩小 100 倍[18]！可以确 信，生命科学的研究又将翻开新的一页！ 参考文献 1 Denker B M, Smith B L, Kuhajda F P, et al. J Biol Chem 1988, 263（30）:15634-15642 2 Murata K, Mitsuoka K, Hirai T, et al. Nature, 2000, 407 （6804）:599-605 3 Fu D, Libson A, Mierke L J, et al. Science, 2000, 290 （5491）:481-486 4 Doyle D, Cabral J, Pfuetzner R, et al. Science, 1998, 280 （5360）: 69-77 5 http://www.nobel.se 6 田亮, 张新夷. 核技术, 2003, 26（1）: 2-8 7 Ostwald W. Z Phys Chem, 1890, 6: 71-82 8 Hodgkin A L. The ionic basis of nerve conduction. In Nobel Lectures in Physiology or Medicine 1963-1970. Amsterdam: Elsevier Publishing Company, 1970 9 Huxley A F. The quantitative analysis of excitation and conduction in nerve. In Nobel Lectures in Physiology or Medicine 1963-1970. Amsterdam: Elsevier Publishing Company, 1970 10 Armstrong C M. Quart Rev Biophys, 1975, 7: 179-210 11 Armstrong C M, Hille B. Neuron, 1998, 20（3）: 371-380 12 Hodgkin A L, Keynes R D. J Physiol, 1955, 128 （1）:61-88 13 Morais-Cabral J H, Zhou Y, MacKinnon R. Nature, 2001, 414（6859）: 37-42 14 Jiang Y, Lee A, Chen J, et al. Nature, 2002, 417（6888）: 515-522 15 Heginbotham L, LeMasurier M, Kolmakova-Partensky L, et al. Gen Physiol, 1999, 114（4）: 551-560
核技术 第27卷 16 Jiang Y, Lee A, Chen J, et al. Nature, 2002, 417(6888) 1992,256:385-387 17 Preston G M, Carroll T P, Guggino WB, et al. Science
8 核 技 术 第 27 卷 16 Jiang Y, Lee A, Chen J, et al. Nature, 2002, 417（6888）: 523-526 17 Preston G M, Carroll T P, Guggino W B, et al. Science, 1992, 256: 385-387 18 Winick H . Beam Line, 2002, 32（1）: 3-5
第1期 闫晓辉等:细胞膜通道与同步辐射 Cell membrane and synchrotron radiation YAN Xiaohui,2 TIAN Liang,2 ZHANG Xinyi,3 I(Physics Department, Fudan University Shanghai 200433) 2 (Synchrotron Radiation Research Center: Fudan University shanghai 200433) 3 (National Key Lab ofSurface Physics, Fudan Universiry shanghai 200433) Abstract For long time a lot of scientists have devoted to study how matter, such as water molecules and k', Nat, Ca2+, Cl-ions, move through cell membranes and complete the matter exchange between the inside and outside of cells. Peter Agre discovered and characterized the first water channel protein in 1988 and Roderick MacK innon elucid ated the structural and me chanistic basis for ion channel function in 1998. These achievements have made it possible for us to"see these exquisitely designed mo lecu lar machines in action at the atomic level. The Nobel Prize in Chemistry for 2003 is shared between these two scientists In deter mining the high resolution 3D structure of these channels, the synchrotron X-ray diffraction plays an important role Key words Synchrotron radiation, Water channel, Potassium ion channel, Three-dimensional structure, Membrane CLCQ71,O434.19
第 1 期 闫晓辉等：细胞膜通道与同步辐射 9 Cell membrane and synchrotron radiation YAN Xiaohui1,2 TIAN Liang1,2 ZHANG Xinyi1,2,3 1（Physics Department, Fudan University, Shanghai 200433） 2（Synchrotron Radiation Research Center, Fudan University, shanghai 200433） 3（National Key Lab of Surface Physics, Fudan University, shanghai 200433） Abstract For long time a lot of scientists have devoted to study how matter, such as water molecules and K+ , Na + , Ca2 + , Cl − ions, move through cell membranes and complete the matter exchange between the inside and outside of cells. Peter Agre discovered and characterized the first water channel protein in 1988 and Roderick MacKinnon elucidated the structural and mechanistic basis for ion channel function in 1998. These achievements have made it possible for us to “see” these exquisitely designed molecular machines in action at the atomic level. The Nobel Prize in Chemistry for 2003 is shared between these two scientists. In determining the high resolution 3D structure of these channels, the synchrotron X-ray diffraction plays an important role. Key words Synchrotron radiation, Water channel, Potassium ion channel, Three-dimensional structure, Membrane protein CLC Q71, O434.19
