第五章分子生物学研究方法5.1重组DNA技术发展史5.2DNA操作技术5.3基因克隆技术5.4基因表达研究技术5.5蛋白质组学及研究技术
第五章 分子生物学研究方法 5.1 重组DNA技术发展史 5.2 DNA操作技术 5.3 基因克隆技术 5.4基因表达研究技术 5.5蛋白质组学及研究技术
5.1重组DNA技术发展史511.1重组DNA技术诞生的理论基础40年代明确了遗传的物质基础是DNA50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制，解决了基因的自我复制和遗传信息传递问题。50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题
5.1 重组DNA技术发展史 ▪ 40年代明确了遗传的物质基础是DNA ▪ 50年代揭示了DNA 分子的双螺旋结构模型和半 保留复制，解决了基因的自我复制和遗传信息 传递问题 。 ▪ 50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵 子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明 了遗传信息的流向和表达问题。 5.1.1重组DNA技术诞生的理论基础
5.1重组DNA技术发展史5.1.2关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基1、DNA分子的切割与连接技术限制性核酸内切酶和连接酶的陆续发现，才使分子生物学家有了进行DNA操作的基本工具。2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立1970年M.Mande1和A.Hige发现，大肠杆菌的细胞经过氯化钙适当处理之后，便能吸收1噬菌体的DNA。1972年美压斯坦福大学S.Cohen报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立，对重组DNA技术的创立具有特别重要的意义。3、Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链反应
5.1.2关键性实验技术问世为重组DNA技术奠基 ▪ 1、DNA分子的切割与连接技术 ▪ 限制性核酸内切酶和连接酶的陆续发现，才使分子生物学 家有了进行DNA操作的基本工具。 ▪ 2、载体构建和大肠杆菌转化体系的建立 ▪ 1970年M.Mandel和A.Hige发现，大肠杆菌的细胞经过氯化 钙适当处理之后，便能吸收λ噬菌体的DNA。1972年美国 斯坦福大学S.Cohen报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞 也能摄取质粒DNA。大肠杆菌转化体系的建立，对重组DNA 技术的创立具有特别重要的意义。 ▪ 3、Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链反应 5.1 重组DNA技术发展史
5.1重组DNA技术发展史5.1.3重组DNA技术的概念重组DNA技术（recombinant DNA technique）：是按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA的大量拷贝。基因克隆（gene cloning)分子克降（molecular cloning
▪ 重组DNA技术(recombinant DNA technique): 是 按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组,再将 重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁 殖，以获得该DNA的大量拷贝。 ▪ 基因克隆(gene cloning) ▪ 分子克隆(molecular cloning) 5.1.3重组DNA技术的概念 5.1 重组DNA技术发展史
5. 1重组DNA技术发展史5.1.4 重组DNA技术的基本步骤1、四大要素①外源基因②载体③工具酶④受体细胞
5.1.4 重组DNA技术的基本步骤 1、四大要素 ①外源基因 ②载体 ③工具酶 ④受体细胞 5.1 重组DNA技术发展史
5.1重组DNA技术发展史重组DNA技术的基本步骤①且的基因的获得与载体的制备②目的基因与载体DNA的连接③重组DNA分子导入受体细胞④重组体的筛选与重组DNA的鉴定③克降基因的表达及表达产物的检测与分离纯化
2、重组DNA技术的基本步骤 ▪ ①目的基因的获得与载体的制备 ▪ ②目的基因与载体DNA的连接 ▪ ③重组DNA分子导入受体细胞 ▪ ④重组体的筛选与重组DNA的鉴定 ▪ ⑤克隆基因的表达及表达产物的检测与分离纯化 5.1 重组DNA技术发展史
5. 1重组DNA技术发展史重组DNA技术操作的主要步骤载体目的基因(外源基因）噬菌体病毒基因组DNA人工合成PCR产物CDNAU限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交
重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 5.1 重组DNA技术发展史
5.1重组DNA技术发展史5.1.5重组DNA技术的意义「重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟重组DNA技术缩短了进化时间重组DNA技术使人能对生物进行定向改造体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上各种疾病等病因的香明、诊断及治疗具有重大意义
5.1.5重组DNA技术的意义 ▪ 重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟 ▪ 重组DNA技术缩短了进化时间 ▪ 重组DNA技术使人能对生物进行定向改造 ▪ 体外大量扩增、研究其结构、功能及调控机制， 从而拓宽了分子生物学的研究领域，这对医学上 各种疾病等病因的查明、诊断及治疗具有重大意 义。 5.1 重组DNA技术发展史
5. 1重组DNA技术发展史5.1.6重组DNA实验中常见的主要工具酶酶类功能识别并在特定位点切开DNA限制性核酸内切酶DNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子按5到3方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的DNA聚合酶 I缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-0H未端多核苷酸激酶在双链核酸的3未端加上多聚单核苷酸未端转移酶从DNA链的3'未端逐个切除单核苷酸DNA外切酶 II从DNA链的5'未端逐个切除单核苷酸入噬菌体DNA外切酶切除位于DNA链5'或3'未端的磷酸基团碱性磷酸酯酶
酶类 功能 限制性核酸内切酶 识别并在特定位点切开DNA DNA连接酶 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个 DNA分子 DNA聚合酶Ⅰ 按5‘到3’方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的 缺口 反转录酶 按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合 成DNA链 多核苷酸激酶 把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5’-OH末端 末端转移酶 在双链核酸的3‘末端加上多聚单核苷酸 DNA外切酶Ⅲ 从DNA链的3’末端逐个切除单核苷酸 λ噬菌体DNA外切酶 从DNA链的5’末端逐个切除单核苷酸 碱性磷酸酯酶 切除位于DNA链5’或3’末端的磷酸基团 5.1.6重组DNA实验中常见的主要工具酶 5.1 重组DNA技术发展史
5. 1、重组DNA技术发展史限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease,RE)一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶BamHIGGGATCCGATCCXGCCTAGGCCTAG分类：I、、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）
限制性核酸内切酶 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE) 一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸 水解酶 分类: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型） 5.1、 重组DNA技术发展史