目录实验一质粒DNA的小量提取实验二质粒DNA的酶切和电泳鉴定实验三重组DNA分子的构建实验四重组子的检测及限制性酶切鉴定实验五大肠杆菌感受态细胞的制备实验六质粒DNA分子导入原核细胞实验七聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片断实验八植物基因组DNA的提取实验十植物总RNA的提取及其电泳鉴定综合性设计性实验：与人类遗传病相关的核苷酸重复序列的克隆实验一质粒DNA的小量提取一、目的要求1、掌握用碱变性法提取质粒DNA的技术
目 录 实验一 质粒DNA的小量提取 实验二 质粒DNA的酶切和电泳鉴定 实验三 重组DNA分子的构建 实验四 重组子的检测及限制性酶切鉴定 实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备 实验六 质粒DNA分子导入原核细胞 实验七 聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片断 实验八 植物基因组DNA的提取 实验十 植物总RNA的提取及其电泳鉴定 综合性设计性实验：与人类遗传病相关的核苷酸重复序列的克隆 实验一 质粒DNA的小量提取 一、目的要求 1、 掌握用碱变性法提取质粒DNA的技术
2掌握用分光光度计测定DNA浓度的方法二、基本原理在染色体外能自主复制且稳定遗产的遗传因子称为质粒，大小在1kb-200kb之间，是双链闭合环状的DNA分子。在细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中都发现有质粒存在，其中细菌质粒存在最为普遍，在基因工程中常用作基因载体。碱变性法又称碱抽提法或碱裂解法，是一种用的最广泛的制备质粒DNA的方法，此法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会分离。当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节起pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。三、仪器、材料和试剂1）仪器微量移液器、微量离心管（又称Eppendorf管）、常用玻璃器皿、台式高速离心机、分光光度计2）材料含有质粒的大肠杆菌DH5a3）试剂及溶液LB培养基、葡萄糖（1）用于碱法提取质粒DNA的溶液溶液1（GET）缓冲液：50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/LTris-HClpH8.0，用前加溶菌酶4mg/Ml。溶液2（变性液）：0.2mol/LNaOH，1%SDS溶液3（醋酸钾溶液）：60mL的5mol/LKAc，11.5mL冰醋酸，28.5mLH2O.PH4.8(2)缓冲液TBE缓冲液（10X）：称取Tris108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA（Ph8.0）40ML，用H2O定容到1000mL高压灭菌作为10X贮藏，稀释10倍后作为工作液使用。TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTApH8.0其中含有RNase20μg/Ml(3)其他试剂异丙醇，70%乙醇等四、操作步骤1．质粒DNA的提取1）培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌单菌落，接种到LB液体培养基中，37°c震荡培养8h一16h2）取液体培养液1.5mL于Eppendorf管中，转速10000r/min离心1min，去掉上清夜，加入100μLGET溶液，充分混匀后在室温下放置5min。3）加入200μL新配置的变性液，颠倒2次-3次使之混匀，冰上放置5min。4）加入150μL冰冷的醋酸钾溶液（Ph4.8），颠倒数次混匀后，冰上放置5min。5）用台式高速离心机，转速为10000r/min，将上清液移入另一干净离心管，并加等体积异内醇混匀，室温放置5min后，12000r/min离心5min，弃去上清液。6）沉淀用70%乙醇清洗一次，离心管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥。7）加入20μL含有RNase20ug/mL的TE缓冲液或灭菌蒸馏水溶解提取物，室温放置30min以上，使DNA充分溶解。8）一20℃保存备用。2.用分光光度计测定质粒DNA的浓度1）用TE或蒸留水将待测DNA样品做1：20或更高倍数的稀释。2）用TE或蒸馏水作为空白，在波长为260nm，280nm，及310nm处调节分光光度计读数至零。3）加入DNA稀释液于上3波长处读取OD值。4）记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下：
2、 掌握用分光光度计测定DNA浓度的方法 二、基本原理 在染色体外能自主复制且稳定遗产的遗传因子称为质粒，大小在1kb-200kb之间，是双链闭 合环状的DNA分子。在细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中都发现有质粒存在，其中细 菌质粒存在最为普遍，在基因工程中常用作基因载体。碱变性法又称碱抽提法或碱裂解法，是 一种用的最广泛的制备质粒DNA的方法，此法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差 异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而 变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会分离。当以 pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节起pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液 中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子 RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 三、仪器、材料和试剂 1） 仪器 微量移液器、微量离心管（又称Eppendorf管）、常用玻璃器皿、台式高速离心机、 分光光度计 2） 材料 含有质粒的大肠杆菌DH5a 3） 试剂及溶液 LB培养基、葡萄糖 （1） 用于碱法提取质粒DNA的溶液 溶液1（GET）缓冲液：50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L TrisHClpH8.0，用前加溶菌酶4mg/Ml。 溶液2（变性液）：0.2mol/L NaOH，1%SDS 溶液3（醋酸钾溶液）：60mL的5mol/L KAc，11.5mL冰醋酸，28.5mL H2O. PH4.8 (2)缓冲液 TBE缓冲液(10Χ)：称取Tris 108g，硼酸55g，0.5mol/L EDTA（Ph8.0）40ML，用H2O定 容到1000mL高压灭菌作为10Χ贮藏，稀释10倍后作为工作液使用。 TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA pH8.0, 其中含有RNase20μg/Ml (3)其他试剂 异丙醇,70%乙醇等 四、操作步骤 1．质粒DNA的提取 1） 培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌单菌落，接种到LB液体培养基中，37oC震荡培养8h—16h 2） 取液体培养液1.5mL于Eppendorf管中,转速10000r/min离心1min,去掉上清夜,加入 100μLGET溶液,充分混匀后在室温下放置5min。 3） 加入200μL新配置的变性液，颠倒2次-3次使之混匀，冰上放置5min。 4） 加入150μL冰冷的醋酸钾溶液（Ph4.8），颠倒数次混匀后，冰上放置5 min。 5） 用台式高速离心机，转速为10000r/min，将上清液移入另一干净离心管，并加等体积异丙醇 混匀，室温放置5min后，12000r/min离心5min，弃去上清液。 6） 沉淀用70%乙醇清洗一次，离心管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥。 7） 加入20μL含有RNase20μg/mL的TE缓冲液或灭菌蒸馏水溶解提取物，室温放置30min以 上，使DNA充分溶解。 8） —20oC保存备用。 2．用分光光度计测定质粒DNA的浓度 1）用TE或蒸馏水将待测DNA样品做1：20或更高倍数的稀释。 2）用TE或蒸馏水作为空白，在波长为260nm，280nm，及310nm处调节分光光度计读数至零。 3）加入DNA稀释液于上3波长处读取OD值。 4）记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下：
对于ssDNA：[ssDNA]=33X（OD260—OD310）X稀释倍数对于dsDNA：[dsDNA]=50X（OD260一OD310）X稀释倍数对于ssRNA：[ssRNA]=40X（OD260—OD310）X稀释倍数五、问题讨论1．提取质粒DNA有多种方法，所有这些方法都包括3个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂解细菌：分离和纯化质粒DNA。可采用溶菌酶破坏菌体细胞壁，SDS（十二烷基硫酸钠）可使细胞壁裂解。经溶菌酶和SDS处理后，在碱性条件下细菌染色体DNA和质粒DNA都变性，而当加入乙酸钾在中性条件下，巨大的染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA很快得以复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清夜中，用异内丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到质粒DNA。2.利用核酸的紫外吸收测定核酸浓度的光学定量法，是定量DNA、RNA常用且快速的方法。组成核酸的五种碱基（G，A，T，C，U）均在260nm处有强吸收峰，正是利用这一强吸收峰而对核酸进行定量的。碱基的种类不同，最大吸收波长以及吸光系数不同，即使是相同碱基，也会随pH的变化，吸光系数也会产生变化，一般在中性附近进行测定。采用本法能够对纯度较好的核酸进行准确定量，对纯度不高的样品，因为糖和蛋白质均具有紫外吸收，常会产生定量不准的结果。另外纯化核酸所用的试剂如苯酚、EDTA等也有紫外吸收，在定量时需注意，特别是苯酚有很强的吸收，用苯酚处理过的样品定量时要特别的小心。核酸样品在260nm和280nm波长下均有一定的光吸收值。如果比较纯的核酸样品，其OD260/OD280是固定的，对DNA样品而言其值大约为1.8一2.2,如高于2.2则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染，因此可用测定样品OD260/OD280的方法来分析核酸样品的纯度。六：试验结果计算并记录你所提取的质粒DNA的浓度。实验二.质粒DNA的酶切和电泳鉴定一，实验目的1.了解限制性内切酶酶解DNA分子的原理2.学习琼脂糖凝胶电泳分离和纯化DNA片断的方法二.基本原理通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二脂键，导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶称作核酸酶，是DNA重组技术得以创立的工具酶。其中能识别双链DNA分子中的某一特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的酶称为限制性内切酶，主要是从原核生物中分离和纯化出来的，目前已发现的限制性内切酶有数百种。例如和HindIII是常用的两种限制性内切酶，其识别序列和切口是：
对于ssDNA：[ssDNA]=33X（OD260—OD310）X稀释倍数 对于dsDNA：[dsDNA]=50X（OD260—OD310）X稀释倍数 对于ssRNA：[ssRNA]=40X（OD260—OD310）X稀释倍数 五、问题讨论 1． 提取质粒DNA有多种方法，所有这些方法都包括3个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和 裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。可采用溶菌酶破坏菌体细胞壁，SDS（十二烷基硫酸钠）可 使细胞壁裂解。经溶菌酶和SDS处理后，在碱性条件下细菌染色体DNA和质粒DNA都变性，而 当加入乙酸钾在中性条件下，巨大的染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA很快得以复性，离 心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清夜中，用异丙醇或乙醇沉 淀后洗涤，可得到质粒DNA。 2． 利用核酸的紫外吸收测定核酸浓度的光学定量法，是定量DNA、RNA常用且快速的方法。组 成核酸的五种碱基（G，A，T，C，U）均在260nm处有强吸收峰，正是利用这一强吸收峰而 对核酸进行定量的。碱基的种类不同，最大吸收波长以及吸光系数不同，即使是相同碱基，也 会随pH的变化，吸光系数也会产生变化，一般在中性附近进行测定。采用本法能够对纯度较好 的核酸进行准确定量，对纯度不高的样品，因为糖和蛋白质均具有紫外吸收，常会产生定量不 准的结果。另外纯化核酸所用的试剂如苯酚、EDTA等也有紫外吸收，在定量时需注意，特别 是苯酚有很强的吸收，用苯酚处理过的样品定量时要特别的小心。核酸样品在260nm和280nm 波长下均有一定的光吸收值。如果比较纯的核酸样品，其OD260 /OD280是固定的，对DNA样品 而言其值大约为1.8－2.2,如高于2.2则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染，因此可用测 定样品OD260 /OD280的方法来分析核酸样品的纯度。 六．试验结果 计算并记录你所提取的质粒DNA的浓度。 实验二. 质粒DNA的酶切和电泳鉴定 一．实验目的 1. 了解限制性内切酶酶解DNA分子的原理 2. 学习琼脂糖凝胶电泳分离和纯化DNA片断的方法 二．基本原理 通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二脂键，导致核酸分子多核苷酸链发生水解断 裂的蛋白酶称作核酸酶，是DNA重组技术得以创立的工具酶。其中能识别双链DNA分子中的 某一特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的酶称为限制性内切酶，主要是从原核生物 中分离和纯化出来的，目前已发现的限制性内切酶有数百种。例如和HindⅢ是常用的两种限 制性内切酶，其识别序列和切口是：
ECoRI:GAATTCHindIII: A AGCT TC TTAAGT TCGA -A如上所示，GAATTC和AAGCTT核苷酸序列表示识别位点，线条表示切口。某种限制性内切酶对特定环状质粒DNA有多少个酶切位点，就能产生多少个酶解片断，酶切后的片断用琼脂糖凝胶电泳来分离鉴定，进而制作DNA分子的限制性酶切图谱。电泳是分离和纯化DNA片断的常用技术，把DNA样品加入一块包含电解质的多孔支持介质的样品孔中，并置于静电场中，DNA分子将向阳极移动，这是因为DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基。当DNA长度增加时，来自电场的驱动力和来自凝胶阻力之间的比率就会降低，不同长度DNA片断就会表现出不同的迁移率，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。该过程可通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物可以提供一个用于确定DNA片断大小的标准。依据制备凝胶的材料，凝胶电泳可被分成琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。相比之下琼脂糖凝胶在分离度上比聚丙烯酰胺差一些，而在分离范围上优于聚丙烯酰胺。三、仪器、材料和试剂1.仪器微量移液器常用玻璃器血电泳仪电泳槽凝胶成像系统2.材料实验一中提纯得到的质粒DNA以及标准DNA3.试剂EcoRI酶解缓冲液（10×）：1mol/LpH7.5Tris.HC10.5mol/LNaC1, 0. 1mo1/LMgC12HindIII酶解缓冲液（10×）：0.1mol/LpH7.4Tris.HC1,1mo1/L NaC1,0.07mo1/LMgC12TBE缓冲液(10X）：称取Tris108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA（Ph8.0）40ML，用H20定容到1000mL高压灭菌作为10X贮藏，稀释10倍后作为工作液使用。上样液（6×）：0.25%溴酚蓝，质量浓度为40%蔗糖水溶液溴化乙啶染色液（10mg/M1）：在20mLH20中溶解0.2克溴化乙啶，混匀后于4℃避光保存。四．操作步骤1)将上一试验提纯并溶于20μLTE的质粒DNA以及标准DNA用于酶切，按下表分别加入所需试剂.质粒样品酶液酶解缓冲液自提质粒16μL2 μL2 μL标准质粒16μL2 μ L2 μL加样后小心混匀，置于37℃水浴中酶解半小时（有时可以长一点，数小时或过夜），然后向管中加入上样液4μL后等待电泳分析。2)琼脂糖凝胶液的制备：称取0.8克琼脂糖，置于三角瓶中，加入100mLTBE工作液，瓶口倒扣一个小烧杯或小平血，将该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂溶解。此外也可用沸水浴或高压锅加热溶解琼脂糖。3)胶板的制备：将有机玻璃内槽洗净，晒干放入制胶模具中，并在固定位置插上梳子。将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液轻轻摇匀，小心的倒在有机玻璃内槽上，使胶液缓慢展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置30min左右，凝固完全后，轻轻拔出梳子，这时在胶板上即形成相互隔开的上样孔。将铺好胶的有机玻璃内槽放入含有电泳缓冲液TBE的电泳槽中备用。4）用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔中，每加完一个样品，换一个加样头，加样时应防止碰环样品孔周围的凝胶面
EcoRⅠ： G AATT C HindⅢ: A AGCT T C TTAA G T TCGA A 如上所示，GAATTC和AAGCTT核苷酸序列表示识别位点，线条表示切口。某种限制 性内切酶对特定环状质粒DNA有多少个酶切位点，就能产生多少个酶解片断，酶切后的片断 用琼脂糖凝胶电泳来分离鉴定，进而制作DNA分子的限制性酶切图谱。 电泳是分离和纯化DNA片断的常用技术，把DNA样品加入一块包含电解质 的多孔支持介质的样品孔中，并置于静电场中，DNA分子将向阳极移动，这是因为DNA分子的 双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基。当DNA长度增加时，来自电场的驱动力和来自 凝胶阻力之间的比率就会降低，不同长度DNA片断就会表现出不同的迁移率，因而可依据DNA 分子的大小来使其分离。该过程可通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行 电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物可以提供一个用于确定DNA片断大小的标准。依 据制备凝胶的材料，凝胶电泳可被分成琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。相比之下琼 脂糖凝胶在分离度上比聚丙烯酰胺差一些，而在分离范围上优于聚丙烯酰胺。 三． 仪器、材料和试剂 1.仪器 微量移液器 常用玻璃器皿 电泳仪 电泳槽 凝胶成像系统 2.材料 实验一中提纯得到的质粒DNA以及标准DNA 3.试剂 EcoRⅠ酶解缓冲液（10×）：1mol/LpH 7.5 Tris .HCl,0.5mol/L NaCl,0.1mol/LMgCl2. HindⅢ酶解缓冲液（10×）：0.1mol/LpH 7.4 Tris .HCl,1mol/L NaCl,0.07mol/LMgCl2. TBE缓冲液(10Χ)：称取Tris 108g，硼酸55g，0.5mol/L EDTA（Ph8.0）40ML，用H2O定容到1000mL高压灭菌作为10Χ贮藏，稀释10倍 后作为工作液使用。 上样液（6×）：0.25%溴酚蓝，质量浓度为40%蔗糖水溶液 溴化乙啶染色液（10mg/Ml）：在20mLH2O中溶解0.2克溴化 乙啶，混匀后于4℃避光保存。 四．操作步骤 1)将上一试验提纯并溶于20μL TE的质粒DNA以及标准DNA用于酶切，按下表分别加入所需 试剂. 质粒 样品 酶解缓冲液 酶液 自提质粒 16μL 2μL 2μL 标准质粒 16μL 2μL 2μL 加样后小心混匀，置于37℃水浴中酶解半小时（有时可以长一点，数小时或过夜），然后 向管中加入上样液4μL后等待电泳分析。 2)琼脂糖凝胶液的制备：称取0.8克琼脂糖，置于三角瓶中，加入100mLTBE工作液，瓶口 倒扣一个小烧杯或小平皿，将该三角瓶置于微波炉加热直至琼脂溶解。此外也可用沸水浴 或高压锅加热溶解琼脂糖。 3)胶板的制备：将有机玻璃内槽洗净，晒干放入制胶模具中，并在固定位置插上梳子。将冷 却至65℃左右的琼脂糖凝胶液轻轻摇匀，小心的倒在有机玻璃内槽上，使胶液缓慢展开， 直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置30min左右，凝固完全后，轻轻 拔出梳子，这时在胶板上即形成相互隔开的上样孔。将铺好胶的有机玻璃内槽放入含有电 泳缓冲液TBE的电泳槽中备用。 4)用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔中，每加完一个样品，换一个加样头，加 样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面
5)对加完样后的凝胶板通电进行电泳：建议在80V一100V的电压或20mA下电泳。当溴酚蓝移动到距离到胶板下沿约1cm处时，停止电泳。在低电压下，线性DNA片断的迁移速度与电压成比例关系。但在电场强度增加时，不同相对分子质量的DNA片断泳动度的增加是有差别的。随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围会随之减小，为了获得电泳分离DNA片断的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm.电泳温度视需要而定，对大分子DNA的分离以低温为好，也可在室温下进行，在琼脂糖凝胶浓度低于0.5%时，由于胶太稀，最好在4℃进行电泳。6）染色观察：将电泳完成后的凝胶浸在含有溴化乙啶（浓度为0.5μg/mL）的电泳缓冲液中，染色约20min，在紫外灯（254nm或302nm波长）下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。一般紫外光激发30s左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应带上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼晴遭受紫外光损伤。采用凝胶成像系统拍摄电泳条谱。五：问题讨论1）在细胞内质粒DNA是共价闭合环状DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处缺刻，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛的分子叫做开还DNA（ocDNA）：若两条链在同一处或其附近断裂则变成线性DNA分子。在电泳时，同一质粒的电泳速度因DNA的构型不同而异，其次序为：CccDNA>直线DNA>ocDNA，因此在本次试验中琼脂糖凝胶电泳上自制质粒呈现3条带。琼脂糖是一种从海藻中提取出来的线状高聚物，当熔化再凝固后就会形成固体基2）质，其密度取决于溶液中所含琼脂糖的量。带负电荷的核酸就可以在这种基质中，在电场的作用下向阳极移动。核酸在琼脂糖基质中的迁移率取决于下列参数：1.DNA的分子大小；2.琼脂糖的浓度；3.DNA的构象；4.所加电压；5.电场方向；6.碱基组成与温度：7.嵌入的染料：8.电泳缓冲液的组成等。琼脂糖浓度对核酸迁移率的影响是：一定大小的DNA片断，在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率不同；在一定浓度的琼脂糖凝胶中，核酸片断的迁移率与其相对分子质量大小相反。3)溴化乙啶的化学名称是3,8-二氨基一5-乙基一6-苯基菲锭溴盐（简称EB或EtBr）由于溴化乙啶分子插入，在紫外光的照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带呈现出桔黄色的荧光，便于检测。EB能插入DNA分子中的碱基对之间，完成与DNA的结合。EB染色具有以下特点：1.操作简便快速，室温下染色15min-20min；2.不会使核酸断裂；3.灵敏度高，10ng或更少的DNA就可检出；4.可以加到样品中，随时用紫外追踪检查。但应该特别注意的是，溴化乙啶是诱变剂，配置和使用溴化乙啶的器血或物品，必须经特殊处理后再进行清洗或弃去。4）限制性内切酶是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。细菌细胞内同时存在一对酶，即限制性内切酶和DNA甲基化酶。它们对DNA底物有相同的识别序列，但生物功能相反，前者是限制作用，后者是修饰作用。由于细胞内存在DNA甲基化酶，它能在限制性内切酶所识别的若干碱基上甲基化，这就避免了限制性内切酶对细胞自身DNA的切割破还。对感染的外来噬菌体DNA，因无甲基化就会被切割破还。六：实验结果分析：实验三重组DNA分子的构建一.实验目的：了解DNA克隆技术的概念及其在分子生物学研究中重大意义，掌握DNA重组的方法.二，实验原理
5)对加完样后的凝胶板通电进行电泳：建议在80V—100V的电压或20mA下电泳。当溴酚蓝移 动到距离到胶板下沿约1cm处时，停止电泳。在低电压下，线性DNA片断的迁移速度与电压 成比例关系。但在电场强度增加时，不同相对分子质量的DNA片断泳动度的增加是有差别 的。随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围会随之减小，为了获得电泳分离DNA片 断的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm.电泳温度视需要而定，对大分子DNA的分离以 低温为好，也可在室温下进行，在琼脂糖凝胶浓度低于0.5%时，由于胶太稀，最好在4℃ 进行电泳。 6)染色观察：将电泳完成后的凝胶浸在含有溴化乙啶（浓度为0.5μg/mL ）的电泳缓冲液 中，染色约20min，在紫外灯（254nm或302nm波长）下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示 出红色的荧光条带。一般紫外光激发30s左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观 察时，应带上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受紫外光损伤。采用凝胶成像系 统拍摄电泳条谱。 五：问题讨论 1) 在细胞内质粒DNA是共价闭合环状DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在。如果两条 链中有一条链发生一处或多处缺刻，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛的分 子叫做开还DNA（ocDNA）；若两条链在同一处或其附近断裂则变成线性DNA分子。在 电泳时，同一质粒的电泳速度因DNA的构型不同而异，其次序为：cccDNA>直线 DNA>ocDNA，因此在本次试验中琼脂糖凝胶电泳上自制质粒呈现3条带。 2) 琼脂糖是一种从海藻中提取出来的线状高聚物，当熔化再凝固后就会形成固体基 质，其密度取决于溶液中所含琼脂糖的量。带负电荷的核酸就可以在这种基质中， 在电场的作用下向阳极移动。核酸在琼脂糖基质中的迁移率取决于下列参数：1.DNA 的分子大小；2.琼脂糖的浓度；3.DNA的构象；4.所加电压；5.电场方向；6.碱基组 成与温度；7.嵌入的染料；8.电泳缓冲液的组成等。琼脂糖浓度对核酸迁移率的影 响是：一定大小的DNA片断，在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率不同；在一定浓度 的琼脂糖凝胶中，核酸片断的迁移率与其相对分子质量大小相反。 3) 溴化乙啶的化学名称是3,8-二氨基－5-乙基－6-苯基菲锭溴盐（简称EB或EtBr）， 由于溴化乙啶分子插入，在紫外光的照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带呈现出桔 黄色的荧光，便于检测。EB能插入DNA分子中的碱基对之间，完成与DNA的结合。EB 染色具有以下特点：1.操作简便快速，室温下染色15min-20min；2.不会使核酸断 裂；3.灵敏度高，10ng或更少的DNA就可检出；4.可以加到样品中，随时用紫外追踪 检查。但应该特别注意的是，溴化乙啶是诱变剂，配置和使用溴化乙啶的器皿或物 品，必须经特殊处理后再进行清洗或弃去。 4) 限制性内切酶是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。细菌细胞内同时存在 一对酶，即限制性内切酶和DNA甲基化酶。它们对DNA底物有相同的识别序列，但生 物功能相反，前者是限制作用，后者是修饰作用。由于细胞内存在DNA甲基化酶，它 能在限制性内切酶所识别的若干碱基上甲基化，这就避免了限制性内切酶对细胞自 身DNA的切割破还。对感染的外来噬菌体DNA，因无甲基化就会被切割破还。 六：实验结果分析： 实验三 重组DNA分子的构建 一. 实验目的:了解DNA克隆技术的概念及其在分子生物学研究中重大意义,掌握DNA重组的方 法. 二. 实验原理
DNA重组技术是2O世纪的，是DNA克隆技术中的一项关键技术，所请DNA重组，就是指把外源既DNA的重新组合.这种重新组合的DNA是由两种不同来合DN的基因片断共价结合形成重组体后，进入适合的宿备下列基本特征：1必须具有能够在特定宿源基因装入该载体后，才能在载体复制起始点应具有内容检测的遗传标记（选择标记包括抗药快的能力等），用以区分阳性于阴性立点，限制性内切酶的切点最好是重组分十：3以具位于检测表型的遗进载体就可以通过其表型的改变与操作，载体分子不宜过大，而且载体DNA应与否而得知，便于筛选重维宿主细胞核DNA容易分升DNA重组本质设连接在一起的过程，是一个酶促生化反应在体外将不同来源的DN虽有粘性未端和平未端DNA片段的连接之分，但其共同点都是利DNA功能.在体外DNA重组中用于DNA连接过程的DN接酶和大肠杆菌DNA连接酶个相对稳定的结构.连接酶其有租日粘利用这个相对稳定的结构DNA分子比较容易连在一起.大肠杆菌DNA莲接酶和T生末端的DNA分子连在一起特性，既可使两个平末端的的功能，但T4噬菌体DNA生末端的连接效率要低的多！双链DNA分子连接起来的可能是因为平未端DNA分一对稳定的结构.一般通过增加DNA的浓度或提高T4噬菌体差效率在重组DNA实验粘性末端，这将是最简单的连接反应.相同粘性末端可！以是不同的内切酶切成的限制酶切位点，可以利用相同或互补的粘性未端，原内切酶将插入片未端DNA片段，通常除了直接采用T41端核苷酸转移酶给末端DNA分子加上同聚物尾巴月2先将衔接物（一段由10个~12个核苷酸具有苷酸短片段）5末端和待克隆的DNA片段的5未站4DNA连接酶将二者连接起来.接着用适当的限制酶果都产生出彼此互补的粘性末端，然后就可以用常规的粘性未百载体分子连接起来，3还可采用DNA接头连接法，既先将一链寡核苷酸短片段与待克隆的ADNA片段以平末端相连接，形成具再采用粘性末端连接法进行重组分子克隆中，连接反应通常发生通过调整插入片段与载体之间的比例可以达到最大效率的重组连接.最佳比例是由类型所决定的.参与反应的末端不相容时，最佳比例为1：1：参与反应的两个末端相容时妾都需要较高的插入片段与载体的比例，如2：1或/甚至4：1若设计一个实验，既将一个含目的基因x的I粒载体，目的DNA可以是从琼脂糖凝胶中回收的单一片段，或是来自女刃.如果自的片段是由EcoRI酶所制备的那么该片段可以与体上应该只含有相关酶的唯切割位点，否则正确的产效率将是非常低的.这种连接反应会产生多种可能的产生反应条件，但目的产物将是目的片段插入在载体分子EcoRI酶成的环状分子既重组分子，原质粒载体的再生，经该线性载体的自环化，会给重组产物的鉴定带来困难.解决办法是用一对特异的限制性酶酶解目的的片段与载体，这样他们的两端互为不相补的粘末端，载体自身环化的可能性就会大大降低三：主要仪器、材料和试剂1)主要仪器与材料恒温摇床、隔水式恒温培养箱、涡旋振荡器、台式离心机、大肠杆菌（含质粒Puc19）、无菌双蒸水、限制性核酸内切酶BamHI酶（5单位-10单位），HindIII酶（5单位-10单位），T4噬菌体DNA连接酶2)试剂：
DNA重组技术是20世纪70年代发展起来的,是DNA克隆技术中的一项关键技术.所谓 DNA重组,就是指把外源目的的基因"装进"载体这一过程,既DNA的重新组合.这种重新组合的 DNA是由两种不同来源的DNA组合而成,所以称作重组体或嵌合DNA. DNA克隆中不可缺少的基本元件之一是载体,目的基因片断共价结合形成重组体 后,进入适合的宿主细胞内才能进行复制.作为载体DNA分子,应具备下列基本特征:1必须具有 能够在特定宿主细胞中独立自我复制的复制起始点,只有这样,外源基因装入该载体后,才能 在载体复制起始点的驱动下一起复制,达到无性繁殖的目的;2应具有内容检测的遗传标记(选 择标记包括抗药性基因、酶基因、营养缺陷型及形成噬菌斑的能力等),用以区分阳性于阴性 重组分子;3应具有多个限制性内切酶的单一切点既多克隆位点,限制性内切酶的切点最好是 位于检测表型的遗传标记基因之内,这样目地基因是否连进载体就可以通过其表型的改变与 否而得知,便于筛选重组分子;4为拉便于DNA体外操作,载体分子不宜过大,而且载体DNA应与 宿主细胞核DNA容易分开以便于提纯. DNA重组本质上是将不同来源的DNA片段连接在一起的过程,是一个酶促生化反应. 在体外将不同来源的DNA片段连接组成新的杂种DNA分子虽有粘性末端和平末端DNA片段的连 接之分,但其共同点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA功能.在体外DNA重组中 用于DNA连接过程的DNA连接酶主要有两种,既T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶. 具有相同粘性末端的DNA分子容易通过碱基配对形成一个相对稳定的结构.连接酶 利用这个相对稳定的结构,行使间断修复的功能,就可以使两个DNA分子比较容易连在一起.大 肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶均具有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起 的功能,但T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性,既可使两个平末端的 双链DNA分子连接起来的功能.但总的来说,这种连接的效率比粘性末端的连接效率要低的多, 可能是因为平末端DNA分子无法形成类似粘性末端分子那样相对稳定的结构.一般通过增加 DNA的浓度或提高T4噬菌体DNA连接酶浓度的办法来提高末端的连接效率. 在重组DNA实验中,若DNA插入片段与特定载体为相同粘性末端,这将是最简单的连 接反应.相同粘性末端可以是同一种内切酶切成的的粘性末端,也可以是不同的内切酶切成的 相同或互补的粘性末端.粘性末端连接法所得到的重组质粒可保留原限制酶切位点,可以利用 原内切酶将插入片段从重组体上完整地重新切割下来.另一方面,对于平末端DNA片段,通常除 了直接采用T4DNA连接酶连接外,还可以采用以下几种方法:1先用末端核苷酸转移酶给末端DNA 分子加上同聚物尾巴后,再用DNA连接酶进行连接,既同聚物加尾法.2先将衔接物(一段由10个 ～12个核苷酸具有一个或数个限制酶识别位点地平末端的双链寡核苷酸短片段)5｀末端和待 克隆的DNA片段的5｀末端,用多核苷酸激酶处理使之磷酸化后,再用T4DNA连接酶将二者连接起 来.接着用适当的限制酶消解具衔接物的DNA分子和载体分子,结果都产生出彼此互补的粘性末 端,然后就可以用常规的粘性末端连接法,将待克隆的DNA片段与载体分子连接起来.3还可采用 DNA接头连接法,既先将一端为粘性末端而另一端为平末端的双链寡核苷酸短片段与待克隆的 DNA片段以平末端相连接,形成具有粘性末端的新的DNA分子,再采用粘性末端连接法进行重组. 分子克隆中,连接反应通常发生在插入片段与载体之间,通过调整插入片段与载体之间的比例 可以达到最大效率的重组连接.最佳比例是由构造及末端的类型所决定的.参与反应的末端不相 容时,最佳比例为1:1;参与反应的两个末端相容时,重组连接都需要较高的插入片段与载体的比 例,如2:1或/甚至4:1. 若设计一个实验,既将一个含目的基因X的DNA片段插入质粒载体.目的DNA可以是从琼脂糖凝 胶中回收的单一片段,或是来自如基因组DNA的多个片段的混合物.如果目的片段是由EcoRI酶所 制备的,那么该片段可以与用相同酶降解后的载体DNA连接.实际载体上应该只含有相关酶的唯 一切割位点,否则正确的产物须由3个甚至更多个片段连接而成,那效率将是非常低的.这种连接 反应会产生多种可能的产物,最终结果取决于不同片段的相对浓度及反应条件,但目的产物将是 目的片段插入在载体分子EcoRI酶切位点处(正反插入均有)形成的环状分子既重组分子.原质粒 载体的再生,经该线性载体的自环化,是一种竞争性副反应,会给重组产物的鉴定带来困难.解决 办法是用一对特异的限制性酶酶解目的的片段与载体,这样他们的两端互为不相补的粘末端,载 体自身环化的可能性就会大大降低 三:主要仪器、材料和试剂 1)主要仪器与材料 恒温摇床、隔水式恒温培养箱、涡旋振荡器、台式离心机、大肠杆菌(含质粒Puc19)、无 菌双蒸水、限制性核酸内切酶BamHⅠ酶(5单位-10单位),HindⅢ酶(5单位-10单位),T4噬菌体 DNA连接酶. 2)试剂:
1.酶解缓冲液（10×）2.TE缓冲液：10mmol/LTrisHC1（pH8.0)，1mmol/LEDTA3.T4噬菌体DNA连接酶缓冲液（10×）：660mmo1/LTris?HC1（pH7.0），5mmo1/LMgC1250mmo1/LDTT, 10 mmo1/L ATP.4.溴化乙啶染色液：将溴化乙啶溶于蒸馏水或电泳缓冲液使浓度达到10mg/mL，避光保存，临用前用电泳缓冲液稀释10000倍-20000倍四.操作步骤1）质粒DNA的提取（参见实验一）2)制备重组质粒1.在灭菌的Eppendorf管中加入制备Puc19质粒2μg(20μL体积），4μL10×酶切缓冲液，14μL无菌双蒸水，1uLBamHI酶（5单位～10单位），1uLHindII酶（5单位～10单位），与37℃保温1h～3h.2.在另一管中加入PCR扩增并纯化的DNA片段2μg(20μL），4μL10X酶切缓冲液，14μL无菌双蒸水，1μLBamHI酶（5单位10单位），1μLHindII酶（5单位10单位），同样与37℃保温3h3.保温完毕后各取2ⅡL酶解液做电泳分析4.将余下的酶解液（38μL)用TE缓冲液稀释至300μL，加入1/10体积的醋酸钾溶液，再加入2倍体积的乙醇，置--20℃冰箱30min以上.12000r/min离心5min，弃上清液，70%乙醇洗涤沉淀物，去上清液，室温干燥后加入16μLTE缓冲液5.互补粘端连接：2个DNA片段溶解液各取4uL混合于一试管中，加入T4噬菌体DNA连接酶缓冲液4uL（10单位），无菌双蒸水28μL，于14℃保温14h16h.取2μL作电泳检查，鉴定反应连接产物符合预想结构，可迅速做转化实验五.问题讨论1）连接反应是DNA重组过程中的关键步骤，其中重要参数之一就是温度.连接酶的最佳温度是37℃，理论上讲连接反应的最佳温度也应该是37℃，但在此温度下粘性未端分子形成的配对结构极不稳定，不能获得理想结果，在实验中人们发现I2℃一16℃可以取得最佳连接效果，找到了最适温度12℃-16℃.此时既可最大限度的发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构的稳定。2进行粘性未端连接时，会产生一定数量的载体自身环化分子，导致转化菌中过高的假阳性克隆，针对这一问题，常采用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）去掉载体的5-磷酸以抑制DNA片断的自身环化碱性磷酸酶从DNA分子的5-未端去除磷酸基.因为没有连接反应所需的磷酸基，线性载体将无法再连接成环状，但与目的DNA插入片段的连接仍可进行，因为每个酶切位点处都有一个磷酸基可连接一条链.剩下的另一条链的缺刻将在转化后由细胞修复机制修补六.结果分析实验四重组子的筛选与鉴定
1.酶解缓冲液(10×) 2.TE缓冲液:10mmol/L Tris•HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA 3.T4噬菌体DNA连接酶缓冲液(10×):660mmol/L Tris•HCl(pH7.0),5mmol/LMgCl2,50mmol/L DTT,10 mmol/L ATP. 4.溴化乙啶染色液:将溴化乙啶溶于蒸馏水或电泳缓冲液使浓度达到10mg/mL,避光保存,临 用前用电泳缓冲液稀释10000倍-20000倍. 四.操作步骤 1)质粒DNA的提取(参见实验一) 2)制备重组质粒 1.在灭菌的Eppendorf管中加入制备Puc19质粒2μg(20μL体积),4μL 10×酶切缓冲液,14μL无 菌双蒸水,1μLBamHI酶(5单位～10单位),1μLHindⅢ酶(5单位～10单位),与37℃保温1h～3h. 2.在另一管中加入PCR扩增并纯化的DNA片段2μg(20μL),4μL10×酶切缓冲液,14μL无菌双蒸 水, 1μL BamHI酶(5单位～10单位),1μLHindⅢ酶(5单位～10单位),同样与37℃保温3h 3.保温完毕后各取2μL酶解液做电泳分析. 4.将余下的酶解液(38μL)用TE缓冲液稀释至300μL,加入1/10体积的醋酸钾溶液,再加入2倍体积 的乙醇,置-20℃冰箱30min以上.12000r/min离心5min,弃上清液,70%乙醇洗涤沉淀物,去上清 液,室温干燥后加入16μL TE缓冲液. 5.互补粘端连接:2个DNA片段溶解液各取4μL混合于一试管中,加入T4噬菌体DNA连接酶缓冲液 4 μL(10单位),无菌双蒸水28μL,于14℃保温14 h～16h.取2μL作电泳检查,鉴定反应连接产 物符合预想结构,可迅速做转化实验. 五.问题讨论 1)连接反应是DNA重组过程中的关键步骤,其中重要参数之一就是温度.连接酶的最佳温度是37℃, 理论上讲连接反应的最佳温度也应该是37℃,但在此温度下粘性末端分子形成的配对结构极不 稳定,不能获得理想结果,在实验中人们发现12℃-16℃可以取得最佳连接效果,找到了最适温度 12℃-16℃.此时既可最大限度的发挥连接酶的活性,又有助于短暂配对结构的稳定. 2)进行粘性末端连接时,会产生一定数量的载体自身环化分子,导致转化菌中过高的假阳性克隆. 针对这一问题,常采用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)去掉载体的5´-磷酸以抑制DNA片断的自身环化. 碱性磷酸酶从DNA分子的5´-末端去除磷酸基.因为没有连接反应所需的磷酸基,线性载体将无法 再连接成环状,但与目的DNA插入片段的连接仍可进行,因为每个酶切位点处都有一个磷酸基可 连接一条链.剩下的另一条链的缺刻将在转化后由细胞修复机制修补. 六.结果分析 实验四 重组子的筛选与鉴定
一.实验目的：掌握鉴别重组体和非重组体的方法二：实验原理：1.一种巧妙的鉴定重组质粒的方法是篮白筛选，该法可在同一转化平板上完成.其原理涉及插入失活，利用一种蓝色化合物的形成作为指示剂.现在使用的许多载体上都带有一个LacZ截断后的衍生片断LacZ，此基因编码B-半乳糖苷酶C部分能与a肽互补产生有活性的酶，所以也称a-互补现象.由a-互补产生的LacZ细菌容易识别，因为在蓝色底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-B-半乳糖苷）存在下形成蓝色菌落，而外源DNA片断插入到质粒的多克隆位点后，不可避免的会导致产生无a-互补能力的a肽不能利用蓝色底物从而形成白色菌落，2.pUC19质粒带有抗氨苄青霉素的特性.将经过转化的全部受体细胞进行适当修饰，在含氨卡青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨卡青霉素的能力而死亡三：主要仪器、材料和试剂1)主要仪器与材料恒温摇床、隔水式恒温培养箱、涡旋振荡器、台式离心机、大肠杆菌（含质粒Puc19）、无菌双蒸水、限制性核酸内切酶BamHI酶（5单位-10单位）,HindII酶（5单位-10单位），EcoRI,PstI，T噬菌体DNA连接酶.大肠杆菌DHsa2)试剂：1.0.1mo1/LCaC12溶液：每100mL溶液含CaC12（无水，分析纯）1.1克，用双蒸水配制，灭菌处理.2.X-gal（20mg/mL）：将20mgX-gal溶于1mL二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存3.IPTG（20mg/mL）：将1gIPTG溶于4mL去离子双蒸水中，定容至5mL，0.22m过滤器除菌-20℃保存备用，四.实验步骤一)细胞转化1.将大肠杆菌DH5a的过夜菌接种到3mLLB培养基上，置37℃摇床于180r/min-200r/min振荡培养3h-4h.2.将细菌转移到一个无菌的Eppendorf管中，冰上放置10min，使培养物冷却至0℃3.8000r/min离心1min，回收细胞，弃上清液，将管倒置使残留的痕量培养液流尽。4.600μL冰冷的0.1mo1/LCaC12悬浮沉淀，放置于冰浴15min。5.4000r/min离心10min，回收细胞且使培养液流尽。6.取400μL冰冷的0.1mol/LCaC12悬浮细胞，将细胞分成50μL-100uL装入Eppendorf管中，置4℃冰箱备用。此时的细胞为感受态细胞。7.将100μL的感受态细胞各加入连接产物10uL，轻轻旋转以混匀，冰上放置30min。8.42℃水浴2min，不要摇动。9.冰浴中放置2min。10.每管加入200μL培养基，37℃摇床80r/min-120r/min振荡30min。二）重组子的检测1.制备含氨卡青霉素的琼脂平板。2.于平板表面加X-gal20μL和IPTG4μL，并用无菌玻璃涂布器将试剂均匀涂布于整个平板平面。置37℃、1h直至所有液体蒸发。3.取200uL菌液铺在含有氨下青霉素及X-ga1和IPTG的琼脂板，用无菌玻璃涂布器，轻轻将细胞涂在平板表面，将平板置于37℃培养箱15min，至液体被吸收。4.倒置平板于37℃培养12h-16h，可出现菌落。5.于4℃将平板放置1h，使蓝色充分出现，用火菌牙签挑取白色单菌落置1.5mLLB液体培养基（含氨卡青霉素）中，37℃摇床培养8h-12h.五.问题讨论
一.实验目的:掌握鉴别重组体和非重组体的方法 二:实验原理: 1. 一种巧妙的鉴定重组质粒的方法是篮白筛选,该法可在同一转化平板上完成.其原理 涉及插入失活,利用一种蓝色化合物的形成作为指示剂.现在使用的许多载体上都带有一个LacZ 截断后的衍生片断LacZ´,此基因编码ß-半乳糖苷酶C部分能与a肽互补产生有活性的酶,所以也 称a-互补现象.由a-互补产生的LacZ细菌容易识别,因为在蓝色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚- ß-半乳糖苷)存在下形成蓝色菌落,而外源DNA片断插入到质粒的多克隆位点后,不可避免的会导 致产生无a-互补能力的a肽不能利用蓝色底物从而形成白色菌落. 2. pUC19质粒带有抗氨苄青霉素的特性.将经过转化的全部受体细胞进行适当修饰,在含氨卞青霉 素的平板培养基上培养,只有转化体才能存活,而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素 的能力而死亡. 三:主要仪器、材料和试剂 1)主要仪器与材料 恒温摇床、隔水式恒温培养箱、涡旋振荡器、台式离心机、大肠杆菌(含质粒Puc19)、无 菌双蒸水、限制性核酸内切酶BamHⅠ酶(5单位-10单位),HindⅢ酶(5单位-10单 位),EcoRⅠ,PstⅠ,T4噬菌体DNA连接酶.大肠杆菌DH5a 2)试剂: 1. 0.1 mol/L CaCl2溶液:每100mL溶液含CaCl2(无水,分析纯)1.1克,用双蒸水配制,灭菌 处理. 2.X-gal(20mg/mL):将20mg X-gal溶于1mL二甲基甲酰胺中,-20℃避光保存. 3.IPTG(20mg/mL):将1gIPTG溶于4mL去离子双蒸水中,定容至5mL,0.22µm过滤器除菌, -20℃保存备用. 四.实验步骤 一)细胞转化 1.将大肠杆菌DH5a的过夜菌接种到3mL LB培养基上,置37℃摇床于180r/min-200r/min振荡培 养3h-4h. 2.将细菌转移到一个无菌的Eppendorf管中,冰上放置10min,使培养物冷却至0℃. 3. 8000r/min离心1min,回收细胞,弃上清液，将管倒置使残留的痕量培养液流尽。 4．600μL冰冷的0.1mol/L CaCl2悬浮沉淀，放置于冰浴15min。 5．4000r/min离心10min，回收细胞且使培养液流尽。 6．取400μL冰冷的0.1 mol/L CaCl2悬浮细胞，将细胞分成50μL-100μL装入Eppendorf管 中，置4℃冰箱备用。此时的细胞为感受态细胞。 7．将100μL的感受态细胞各加入连接产物10μL，轻轻旋转以混匀，冰上放置30min。 8．42℃水浴2min，不要摇动。 9．冰浴中放置2min。 10．每管加入200μL培养基，37℃摇床80r/min-120r/min振荡30min。 二）重组子的检测 1．制备含氨卞青霉素的琼脂平板。 2．于平板表面加X-gal 20μL和IPTG 4μL，并用无菌玻璃涂布器将试剂均匀涂布于整个平 板平面。置37℃、1h直至所有液体蒸发。 3．取200μL菌液铺在含有氨卞青霉素及X-gal和IPTG的琼脂板，用无菌玻璃涂布器，轻轻将 细胞涂在平板表面，将平板置于37℃培养箱15min，至液体被吸收。 4．倒置平板于37℃培养12h-16h，可出现菌落。 5．于4℃将平板放置1h，使蓝色充分出现，用灭菌牙签挑取白色单菌落置1.5mLLB液体培养 基(含氨卞青霉素)中,37℃摇床培养8h-12h. 五.问题讨论
六.结果分析实验五大肠杆菌感受态细胞的制备一。实验目的1.学习氯化钙法制备大肠杆菌DH5a感受态细胞二，实验原理人们发现用含Ca2+的溶液处理的大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA，这一过程被称为转化。转化是将异源DNA分子引入另一细胞系的过程，是受体细胞获得新的遗传性状的一种手段是分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制一修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用R一、M二表示。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法、CaC12，RuC1等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能允许许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。在一定条件下，将带有外源DNA的载体分子与感受态细胞混合保温，使载体DNA分子进入受体细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。三．仪器、材料和试剂1.仪器和材料超净台台式离恒温摇床电热恒温培养箱分光光度计心机离心管大肠杆菌DH5a2.试剂（1）基本培养基在三角瓶中，将15克琼脂与725mL水混合并高压灭菌。待冷却至55℃在到培养皿之前向琼脂溶液中加入：250mL灭过菌的4倍盐溶液，2mL灭过菌的1moL/L的MgSO4，2mL灭过菌的50mmoL/LCaC12，20mL灭过菌的10%葡萄糖以及2mL灭过菌的10mg/mL维生素B1（过滤除菌）。（4倍盐溶液：6gNa2HP04，3gKH2P04，0.5gNaCl,1gNH4C1,加水至250mL并调pH至7.4）。（2）LB培养基（1L）将10g胰蛋白陈，5g酵母提取物及5gNaC1溶于1L水中并高压灭菌，若要配置含氨卡青霉素的LB培养基，则将15
六.结果分析 实验五.大肠杆菌感受态细胞的制备 一．实验目的 1． 学习氯化钙法制备大肠杆菌DH5a感受态细胞 二． 实验原理 人们发现用含Ca2+的溶液处理的大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA，这一过程被称为转化。 转化是将异源DNA分子引入另一细胞系的过程，是受体细胞获得新的遗传性状的一种手段是分子遗 传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷 的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用R—、M－表示。受体细胞经过一些特殊 方法（如电击法、CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能允许 许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。在一定条件下，将带有外源DNA的载体分子与感受 态细胞混合保温，使载体DNA分子进入受体细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信 息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 三． 仪器、材料和试剂 1.仪器和材料 恒温摇床 电热恒温培养箱 超净台 分光光度计 台式离 心机 离心管 大肠杆菌DH5a 2．试剂 （1）基本培养基 在三角瓶中，将15克琼脂与725mL水混合并高 压灭菌。待冷却至55℃在到培养皿之前向琼脂溶液中加入：250mL灭过菌的4 倍盐溶液，2mL灭过菌的1moL/L的MgSO4，2mL灭过菌的50mmoL/L CaCl2，20mL 灭过菌的10%葡萄糖以及2mL灭过菌的10mg/mL维生素B1（过滤除菌）。 （4倍盐溶液：6g Na2HPO4，3g KH2PO4， 0.5gNaCl,1g NH4Cl,加水至250mL并调pH至7.4）。 （2）LB培养基（1L）将10g胰蛋白胨，5g酵母提取物及 5gNaCl溶于1L水中并高压灭菌，若要配置含氨卞青霉素的LB培养基，则将15
克琼脂加1LLB培养液中高压灭菌，待冷却至55℃，向其中加入1.5mL100mg/ml的氨下青霉素。（3）0.1mo1/LMgC12和0.1mol/LCaC12（含20%甘油）两者均调pH值至7.2并高压灭菌备用。四.操作步骤氯化钙法1．用划线培养法将大肠杆菌接种于基本培养基平皿上，于37℃倒置培养1d-2d.2.将单个菌落接种于10mLLB培养液的试管中，37℃振荡（250r/min）培养过夜。3.向两个装有200mLLB培养液的500mL三角瓶中各加入4mL过夜培养细胞，37℃振荡培养至光密度（0D600）值在0.5-0.6之间。（约需1h-2h）：4.将每份细菌培养物分别倒入一个预先冰浴的无菌250mL离心瓶并置于冰上保持20min.于4℃下离心10min，（8000r/min），弃去上清夜。5将每份沉淀轻缓的悬于100mL冰冷的0.1mo1/LMgC12（Ph7.2)溶液中，按上述方法再次离心。6.去上清夜，并将每一份沉淀轻缓的悬浮于20mL冰冷的含20%甘油的0.1mo1/LCaCl2(Ph7.2)溶液中。7.分装于微量离心管中，（每支1mL），一80℃储存备用。注意：1.为了获得高感受态细胞，应选用处于生长对数期的细胞，OD600值不应高于0.6，并且在整个试验过程中均需将细胞置于冰上。2.细胞在冰冻后即获得了感受性，在一80℃几小时后感受性达到最高值，几个月内均能维持高水平的感受态。五.讨论1.试剂的质量与污染.所用的试剂如CaC12等应是高质量的，且最好保存于干燥的暗凉处.整个过程需要注意防止杂菌和其他DNA的污染；所用器血如离心管.分装用的微量离心管等一定要洗干净，最好用新的；并在整个过程中要无菌操作.少量其他试剂在器血中残留或DNA的污染均会影响转化率.实验中凡涉及溶液的移取，分装等敲开实验器血的操作，最好在无菌超净台中进行以防污染六.结果分析实验六：质粒DNA分子导入原核细胞一.实验目的：1.了解细胞转化的过程及其在分子生物学研究中的意义，2.外源质粒DNA转入受体菌感受态细胞并筛选转化体的方法
克琼脂加1L LB培养液中高压灭菌，待冷却至55℃,向其中加入 1.5mL100mg/ml的氨卞青霉素。 （3）0.1mol/LMgCl2和0.1mol/LCaCl2(含20%甘油)两者均调 pH值至7.2并高压灭菌备用。 四．操作步骤 氯化钙法 1. 用划线培养法将大肠杆菌接种于基本培养基平皿上，于37℃倒置培养1d-2d. 2. 将单个菌落接种于10mL LB培养液的试管中，37℃振荡（250r/min）培养过夜。 3. 向两个装有200mLLB培养液的500mL三角瓶中各加入4mL过夜培养细胞，37℃振荡培养至 光密度（OD600）值在0.5-0.6之间。（约需1h-2h）. 4. 将每份细菌培养物分别倒入一个预先冰浴的无菌250mL离心瓶并置于冰上保持20min.于 4℃下离心10min,（8000r/min）,弃去上清夜。 5. 将每份沉淀轻缓的悬于100mL冰冷的0.1mol/L MgCl2(Ph7.2)溶液中，按上述方法再次离 心。 6. 去上清夜，并将每一份沉淀轻缓的悬浮于20mL冰冷的含20%甘油的0.1 mol/L CaCl2(Ph7.2)溶液中。 7. 分装于微量离心管中，(每支1mL)，－80℃储存备用。 注意：1.为了获得高感受态细胞，应选用处于生长对数期的细胞，OD600值不应高于0.6，并 且在整个试验过程中均需将细胞置于冰上。 2.细胞在冰冻后即获得了感受性，在－80℃几小时后感受性达到最高值，几个 月内均能维持高水平的感受态。 五.讨论 1.试剂的质量与污染.所用的试剂如CaCl2等应是高质量的,且最好保存于干燥的暗凉处.整个过 程需要注意防止杂菌和其他DNA的污染;所用器皿如离心管.分装用的微量离心管等一定要洗干 净,最好用新的;并在整个过程中要无菌操作.少量其他试剂在器皿中残留或DNA的污染均会影响 转化率.实验中凡涉及溶液的移取,分装等敞开实验器皿的操作,最好在无菌超净台中进行以防污 染. 六.结果分析: 实验六. 质粒DNA分子导入原核细胞 一.实验目的: 1.了解细胞转化的过程及其在分子生物学研究中的意义. 2.外源质粒DNA转入受体菌感受态细胞并筛选转化体的方法