第八讲沉析 3学时 、通过本章学习应掌握的问题 1、什么是沉析? 2、沉析法纯化蛋白质的优点有哪些? 3、沉析的一般操作步骤是什么? 4、何谓盐析?其原理是什么? 5、盐析操作时常用的盐是什么? 6、影响盐析的主要因素有哪些? 7、有机溶剂沉析法的原理是什么? 8、影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些? 9、等电点沉析的工作原理是什么? 10、其它常用的沉析方法有哪些? 二、何谓沉析?( Precipitation) 利用沉析剂( precipitator)使所需提取的生化物质或杂质在溶液中的溶解度 降低而形成无定形固体沉淀的过程。 沉析的特点 操作简单、经济、浓缩倍数高,但针对复杂体系而言,分离度不高、选择性不强 四、分类 盐析、有机溶剂沉析、等电点沉析等 五、沉析操作的一般过程
第八讲 沉析 3 学时 一、通过本章学习应掌握的问题 1、什么是沉析？ 2、沉析法纯化蛋白质的优点有哪些？ 3、沉析的一般操作步骤是什么？ 4、何谓盐析？其原理是什么？ 5、盐析操作时常用的盐是什么？ 6、影响盐析的主要因素有哪些？ 7、有机溶剂沉析法的原理是什么？ 8、影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？ 9、等电点沉析的工作原理是什么？ 10、其它常用的沉析方法有哪些？ 二、何谓沉析？（Precipitation） 利用沉析剂（precipitator）使所需提取的生化物质或杂质在溶液中的溶解度 降低而形成无定形固体沉淀的过程。 三、沉析的特点 操作简单、经济、浓缩倍数高，但针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强 四、分类 盐析、有机溶剂沉析、等电点沉析等 五、沉析操作的一般过程
1、在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂; 2、沉淀物的陈化,促进晶体生长 3、离心或过滤,收集沉淀物 六、盐析( Salt induced precipitation 1、概念∶在高浓度的中性盐存在下,蛋白质(酶)等生物大分子物质在水溶液 中的溶解度降低,产生沉淀的过程 The most common type of precipitation for proteins is Salt induced precipitation Protein solubility depends on several factors. It is observed that at low concentration of the salt, solubility of the proteins usually increases slightly. This is termed Salting in. But at high concentrations of salt, the solubility of the proteins drops sharply. This is termed Salting out and the proteins precipitate out Solubility versus Salt Concentration 2、盐析原玨 首先需要了 (1)两性 散系 Salt concentration (2)蛋白质周围形成水化膜,保护了蛋白质粒子,避免了相互碰撞
1、在经过滤或离心后的样品中加入沉析剂； 2、沉淀物的陈化，促进晶体生长； 3、离心或过滤，收集沉淀物； 六、盐析(Salt induced precipitation) 1、概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液 中的溶解度降低，产生沉淀的过程。 The most common type of precipitation for proteins is Salt induced precipitation. Protein solubility depends on several factors. It is observed that at low concentration of the salt, solubility of the proteins usually increases slightly. This is termed Salting in. But at high concentrations of salt, the solubility of the proteins drops sharply. This is termed Salting out and the proteins precipitate out. 2、盐析原理 首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在状态： （1）两性电解质，由于静电力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散系 （2）蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞
3、盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况: (1)“盡盐溶现象_低盐浓度下,蛋白质溶解度增大 (2)“盐析ˆ现象—高盐浓度下,蛋白质溶解度随之下降,原因如下 (a)无机离子与蛋白质表面电荷中和,形成离子对,部分中和了蛋白质的电性 使蛋白质分子之间的排斥力减弱,从而能够相互靠拢 (b)中性盐的亲水性大,使蛋白质脱去水化膜,疏水区暴露,由于疏水区的相 互作用导致沉淀 4、离子强度对盐析过程的影响 log s=B-kl Cohn经验公式 S—蛋白质溶解度,molL =∑ Ⅰ离子强度c:离子浓度;Z:离子化合价 β_盐浓度为0时,蛋白质溶解度的对数值。与蛋白质种类、温度、pH值有 关,与盐无关; Ks盐析常数,与蛋白质和无机盐的种类有关,与温度、pH值无关。Ks盐 析法∶在一定pH和温度下,改变体系离子强度进行盐析的方法; 盐析法:在一定离子强度下,改变pH和温度进行盐析
3、盐析过程 当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况： （1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大 （2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下： （a）无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性， 使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢； （b）中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相 互作用导致沉淀； 4、离子强度对盐析过程的影响 Cohn 经验公式 S—蛋白质溶解度，mol/L; I—离子强度 c:离子浓度；Z：离子化合价 β—盐浓度为 0 时，蛋白质溶解度的对数值。与蛋白质种类、温度、pH 值有 关，与盐无关； Ks—盐析常数，与蛋白质和无机盐的种类有关，与温度、pH 值无关。Ks 盐 析法：在一定 pH 和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法； β盐析法：在一定离子强度下，改变 pH 和温度进行盐析； S K I = − s log 2 2 1 iZi I = c
其中,Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感,易产生共沉淀现 象,因此常用于提取液的前处理。 邴β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢,且变化幅度小,因此分辨率更高,常 用于初步的纯化 5、盐析用盐的选择在相同离子强度下,盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定 差异,一般的规律为 半径小的高价离子的盐析作用较强,半径大的低价离子作用较弱 (Ks)磷酸钾丶硫酸钠λ硫酸铵柠檬酸钠硫酸镁 选用盐析用盐的几点考虑 (1)盐析作用要强 (2)盐析用盐需有较大的溶解度 (3)盐析用盐必须是惰性的 (4)来源丰富、经济 6、常用的盐析用盐 #硫酸铵:溶解度大(767gL) 硫酸钠 磷酸盐 柠檬酸盐 7、影响盐析的因素 (1)溶质种类的影响:Ks和β值
其中，Ks 盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现 象，因此常用于提取液的前处理。 而β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常 用于初步的纯化。 5、盐析用盐的选择在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定 差异，一般的规律为： 半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱 （Ks）磷酸钾>硫酸钠>硫酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁 选用盐析用盐的几点考虑： （1）盐析作用要强 （2）盐析用盐需有较大的溶解度 （3）盐析用盐必须是惰性的 （4）来源丰富、经济 6、常用的盐析用盐 #硫酸铵：溶解度大（767g/L） 硫酸钠 磷酸盐 柠檬酸盐 7、影响盐析的因素 （1）溶质种类的影响：Ks 和β值
(2)溶质浓度的影响:蛋白质浓度大,盐的用量小,但共沉作用明显,分辨率 低 (3)蛋白质浓度小,盐的用量大,分辨率高; (4)pH值:影响蛋白质表面净电荷的数量,通常调整体系pH值,使其在pI 附近 (5)盐析温度:大多数情况下,高盐浓度下,温度升高,其溶解度反而下降; 8、盐析用盐的用量选择 饱和度的概念 以硫酸铵为例 25°C时,硫酸铵的饱和溶解度是7679,定义为100%饱和度 Final Concentration of Ammonium Sulfate ( saturation) 20251303540455055606570758090 Grams of solid(NH4 h SO4 to be added to I liter of solution. 01414417620[243273133390[4047256I561[662 202[592155825262|3[340[382424|520 306193125158193230267307348390485 30 30@1276282327314[356|449 40 363913216820524528375 3265991341m1210250339 33|66■1o13716214302 36■T3I42 9■05■143 34元0107190 3615 七、有机溶剂沉淀 1、概念∶在含有溶质的水溶液中加λ一定量亲水的有机溶剂,降低溶质的溶解 度,使其沉淀析出
（2）溶质浓度的影响：蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率 低； （3）蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高； （4）pH 值：影响蛋白质表面净电荷的数量，通常调整体系 pH 值，使其在 pI 附近； （5）盐析温度：大多数情况下，高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降； 8、盐析用盐的用量选择 饱和度的概念： 以硫酸铵为例： 25oC 时，硫酸铵的饱和溶解度是 767g/L，定义为 100%饱和度 七、有机溶剂沉淀 1、概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解 度，使其沉淀析出
2原理 (1)降低了溶质的介电常数,使溶质之间的静电引力增加,从而出现聚集现象, 导致沉淀。 (2)由于有机溶剂的水合作用,降低了自由水的浓度,降低了亲水溶质表面水 化层的厚度,降低了亲水性,导致脱水凝聚。3、常用的有机溶剂沉析剂 乙醇:沉析作用强,挥发性适中,无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子 的沉析; 丙酮:沉析作用更强,用量省,但毒性大,应用范围不广 特点:介电常数小,60%乙醇的介电常数是48 丙酮的介电常数是22 容易获取 4、有机溶剂沉析的特点 (1)分辨率高 (2)溶剂容易分离,并可回收使用; (3)产品洁净 (4)容易使蛋白质等生物大分子失活; (5)应注意在低温下操作 (6)成本高 5、溶剂选择 (1)介电常数要小
2 原理： （1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象， 导致沉淀。 （2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水 化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。3、常用的有机溶剂沉析剂 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子 的沉析； 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广； 特点：介电常数小，60%乙醇的介电常数是 48 丙酮的介电常数是 22 容易获取 4、有机溶剂沉析的特点 （1）分辨率高； （2）溶剂容易分离，并可回收使用； （3）产品洁净； （4）容易使蛋白质等生物大分子失活； （5）应注意在低温下操作； （6）成本高 5、溶剂选择 （1）介电常数要小
(2)致变性作用要小(甲醇) (3)毒性要小、挥发性适中 (4)水溶性要好 6、影响有机溶剂沉析的主要因素 (1)温度:低温有利于防止溶质变性;有利于提高收率(溶解度下降); (2)搅拌速度:散热 (3)溶液pH值:原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的电荷,防止共沉现象。 (pI (4)离子强度:离子强度低有利于沉析,001~0.05molL (5)样品浓度:0.5~2% 稀:溶剂用量大,回收率低,但共沉淀作用小 浓:节省溶剂用量,共沉作用强,分辨率低 (6)金属离子的助沉析作用:Zn2+、Ca2+ 八、等电点沉淀法 1、概念 调节体系pH值,使两性电解质的溶解度下降,析岀的操作称为等电点沉淀。 2、原理 蛋白质是两性电解质,当溶液pH值处于等电点时,分子表面净电荷为0, 双电层和水化膜结构被破坏,由于分子间引力,形成蛋白质聚集体,进而产生沉 淀。 Fraction of Protein Precipitated versus pH
（2）致变性作用要小（甲醇） （3）毒性要小、挥发性适中 （4）水溶性要好 6、影响有机溶剂沉析的主要因素 （1）温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）； （2）搅拌速度：散热 （3）溶液 pH 值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的电荷，防止共沉现象。 （pI） （4）离子强度：离子强度低有利于沉析，0.01~0.05mol/L （5）样品浓度：0.5~2% 稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小 浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低 （6）金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+ 八、等电点沉淀法 1、概念： 调节体系 pH 值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称为等电点沉淀。 2、原理： 蛋白质是两性电解质，当溶液 pH 值处于等电点时，分子表面净电荷为 0， 双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉 淀
3、特点 由于在等电点附近,溶质仍然有一定的溶解度,等电点沉淀法往往不能获得 高的回收率,因此等电点沉淀法通常与盐析、有机溶剂沉淀法联合使用 操作时的注意事项 (1)由于无机离子的影响,蛋白质的等电点通常会发生漂移”,阳高,阴低 (2)溶质的稳定性 (3)盐析效应 九、其它沉淀法 (1)水溶性非离子型聚合物沉淀剂 PEG(聚乙二醇)NPEO(王苯乙烯化氧λ葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯 常用的此类沉淀剂是PEG,相对分子量一般为6000; (2)成盐类复合物沉析剂 A.金属复合盐:与生物分子的酸性基团作用,Cu2、Ag、Zn2 B.有机酸复合盐:与生物分子的碱性基团作用
3、特点： 由于在等电点附近，溶质仍然有一定的溶解度，等电点沉淀法往往不能获得 高的回收率，因此等电点沉淀法通常与盐析、有机溶剂沉淀法联合使用 操作时的注意事项： （1）由于无机离子的影响，蛋白质的等电点通常会发生“漂移”，阳-高，阴-低 （2）溶质的稳定性 （3）盐析效应 九、其它沉淀法 （1） 水溶性非离子型聚合物沉淀剂 PEG（聚乙二醇）、NPEO（壬苯乙烯化氧）、葡聚糖、右旋糖苷硫酸酯 常用的此类沉淀剂是 PEG，相对分子量一般为 6000； （2） 成盐类复合物沉析剂 A. 金属复合盐：与生物分子的酸性基团作用，Cu2＋、Ag＋、Zn2＋ B. 有机酸复合盐：与生物分子的碱性基团作用
C.无机复合盐:磷钨酸盐、磷钼酸盐 (3)离子型表面活性剂 CI^AB(十六烷基三甲基季铵盐溴化物)十二烷基磺酸钠(SDS) (4)离子型多聚物沉析剂 核酸(多聚阴离子)鱼精蛋白(多聚阳离子) (5)氨基酸类沉析剂 一类选择性沉淀剂。如组氨酸-氯化汞,精氨酸-苯甲醛,亮氨酸-邻二甲 基苯磺酸等 (6)分离核酸用沉析剂 酚、氯仿、SDS (7)分离粘多糖用沉析剂 乙醇、CTAB )选择性变性沉析法 十、本章作业 (1)常用的蛋白质沉淀方法有哪些? (2)影响盐析的主要因素有哪些? 3)何谓中性盐的饱和度?盐析操作中,中性盐的用量(40%硫酸铵饱和度) 如何计算?
C. 无机复合盐：磷钨酸盐、磷钼酸盐 （3） 离子型表面活性剂 CTAB（十六烷基三甲基季铵盐溴化物）、十二烷基磺酸钠（SDS） （4） 离子型多聚物沉析剂 核酸（多聚阴离子）、鱼精蛋白（多聚阳离子） （5） 氨基酸类沉析剂 一类选择性沉淀剂。如组氨酸－氯化汞，精氨酸－苯甲醛，亮氨酸－邻二甲 基苯磺酸等 （6） 分离核酸用沉析剂 酚、氯仿、SDS （7） 分离粘多糖用沉析剂 乙醇、CTAB （8）选择性变性沉析法 十、本章作业 （1）常用的蛋白质沉淀方法有哪些？ （2）影响盐析的主要因素有哪些？ （3）何谓中性盐的饱和度？盐析操作中，中性盐的用量（40% 硫酸铵饱和度） 如何计算？