第九讲电泳与膜分离 6学时 、通过本章学习应掌握的内容 1、膜分离的概念 膜的概念 3、膜分离技术的分类 4、基本的膜材料有哪些? 5、常用的膜组件有哪些? 6、何谓反渗透?实现反渗透分离的条件是什么? 7、强制膜分离的概念? 8、电渗析的工作原理? 9、电泳的概念 10、电泳的基本原理 11、电泳技术的分类 12、基本的电泳系统组成 13、常规聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离原理 14、 SDS PAGE的分离原理 何谓等电聚焦?如何形成载体两性电解质pH梯度? 16、何谓双相电泳?其作用是什么? 二、膜分离技术 膜分离的概念 利用膜的选择性(孔径大小),以膜的两侧存在的能量差作为推动力,由于溶
第九讲 电泳与膜分离 6 学时 一、通过本章学习应掌握的内容 1、膜分离的概念 2、膜的概念 3、膜分离技术的分类 4、基本的膜材料有哪些？ 5、常用的膜组件有哪些？ 6、何谓反渗透？实现反渗透分离的条件是什么？ 7、强制膜分离的概念？ 8、电渗析的工作原理？ 9、电泳的概念 10、 电泳的基本原理 11、 电泳技术的分类 12、 基本的电泳系统组成 13、 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离原理 14、 SDS PAGE 的分离原理 15、 何谓等电聚焦？如何形成载体两性电解质 pH 梯度？ 16、 何谓双相电泳？其作用是什么？ 二、膜分离技术 1、膜分离的概念 利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶
液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。 2、膜的概念 (1)在一种流体相间有一层薄的凝聚相物质,把流体相分隔开来成为两部分, 这一薄层物质称为膜 (2)膜本身是均一的一相或由两相以上凝聚物构成的复合体 (3)被膜分开的流体相物质是液体或气体 (4)膜的厚度应在0.5mm以下,否则不能称其为膜。 3、膜分离技术的类型和定义 膜分离过程的实质是物质透过或被截留于膜的过程,近似于筛分过程,依据 滤膜孔径大小而达到物质分离的目的,故而可以按分离粒子大小进行分类 (1)微滤:以多孔细小薄膜为过滤介质,压力为推动力,使不溶性物质得以 分离的操作,孔径分布范围在0.025~14μm之间; (2)超滤:分离介质同上,但孔径更小,为0001-002μm,分离推动力仍 为压力差,适合于分离酶、蛋白质等生物大分子物质; (3)反渗透:是一种以压力差为推动力,从溶液中分离岀溶剂的膜分离操作 孔径范围在0.0001~0.001ψm之间;(由于分离的溶剂分子往往很小,不能忽略 渗透压的作用,故而成为反渗透); (4)纳滤:以压力差为推动力,从溶液中分离300-1000小分子量的膜分离 过程,孔径分布在平均2nm (5)电渗析:以电位差为推动力,利用离子交换膜的选择透过性,从溶液中 脱除或富集电解质的膜分离操作
液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。 2、膜的概念 （1）在一种流体相间有一层薄的凝聚相物质，把流体相分隔开来成为两部分， 这一薄层物质称为膜。 （2）膜本身是均一的一相或由两相以上凝聚物构成的复合体 （3）被膜分开的流体相物质是液体或气体 （4）膜的厚度应在 0.5mm 以下，否则不能称其为膜。 3、膜分离技术的类型和定义 膜分离过程的实质是物质透过或被截留于膜的过程，近似于筛分过程，依据 滤膜孔径大小而达到物质分离的目的，故而可以按分离粒子大小进行分类： （1）微滤：以多孔细小薄膜为过滤介质，压力为推动力，使不溶性物质得以 分离的操作，孔径分布范围在 0.025~14μm 之间； （2）超滤：分离介质同上，但孔径更小，为 0.001~0.02 μm，分离推动力仍 为压力差，适合于分离酶、蛋白质等生物大分子物质； （3）反渗透：是一种以压力差为推动力，从溶液中分离出溶剂的膜分离操作， 孔径范围在 0.0001~0.001 μm 之间；（由于分离的溶剂分子往往很小，不能忽略 渗透压的作用，故而成为反渗透）； （4）纳滤：以压力差为推动力，从溶液中分离 300~1000 小分子量的膜分离 过程，孔径分布在平均 2nm； （5）电渗析：以电位差为推动力，利用离子交换膜的选择透过性，从溶液中 脱除或富集电解质的膜分离操作；
4、膜的分类 ◆按孔径大小:微滤膜、超滤膜、反渗透膜、纳滤膜 ◆按膜结构∶对称性膜、不对称膜、复合膜 ◆按材料分:合成有机聚合物膜、无机材料膜 5、膜材料的特性 对于不同种类的膜都有一个基本要求 (1)耐压:膜孔径小,要保持高通量就必须施加较高的压力,一般模操作的 压力范围在0.1~0.5Mpa,反渗透膜的压力更高,约为1~10MPa (2)耐高温髙通量带来的温度升高和清洗的需要 (3)耐酸碱∶防止分离过程中,以及清洗过程中的水解; (4)化学相容性:保持膜的稳定性; (5)生物相容性:防止生物大分子的变性 (6)成本低 6、各种膜材料 (1)有机高分子膜 纤维素酯膜、缩合系聚合物(聚砜类λ聚烯烃及其共聚物、脂肪族或芳香族 聚酰胺类聚合物、全氟磺酸共聚物和全氟羧酸共聚物、聚碳酸酯 (2)无机多孔膜:陶瓷膜 7、膜组件 (1)管式 (2)中空纤维
4、膜的分类 ◆按孔径大小：微滤膜、超滤膜、反渗透膜、纳滤膜 ◆按膜结构：对称性膜、不对称膜、复合膜 ◆按材料分：合成有机聚合物膜、无机材料膜 5、膜材料的特性 对于不同种类的膜都有一个基本要求： （1）耐压：膜孔径小，要保持高通量就必须施加较高的压力，一般模操作的 压力范围在 0.1~0.5Mpa，反渗透膜的压力更高，约为 1~10MPa （2）耐高温:高通量带来的温度升高和清洗的需要 （3）耐酸碱：防止分离过程中，以及清洗过程中的水解； （4）化学相容性：保持膜的稳定性； （5）生物相容性：防止生物大分子的变性； （6）成本低； 6、各种膜材料 （1）有机高分子膜： 纤维素酯膜、缩合系聚合物（聚砜类）、聚烯烃及其共聚物、脂肪族或芳香族 聚酰胺类聚合物、全氟磺酸共聚物和全氟羧酸共聚物、聚碳酸酯； （2）无机多孔膜：陶瓷膜 7、膜组件 （1）管式 （2）中空纤维
(3)螺旋卷绕式 (4)平板式 共同的特点 (1)尽可能大的膜表面积 (2)可靠的支撑装置 (3)可引出透过液 (4)膜表面浓度差极化达到最小 8、超滤和反渗透 目的:将溶质通过一层具有选择性的薄膜,从溶液中分离出来 分离时的推动力都是压强,由于被分离物质的分子量和直径大小差别及膜孔 结构不同,其采用的压强大小不同 反渗透膜的操作压力高达10MPa 超滤和反渗透操作中的渗透压由于超滤和反渗透过程都是用一种半透膜把两 种不同浓度的溶液隔开(淡水或盐水),因此都存在渗透压。 渗透压的大小取决于溶液的种类、浓度和温度 一般说来,无机小分子的渗透压要比有机大分子溶质的渗透压高得多。 9、渗透与反渗透 渗透是由于存在化学势存在梯度而引起的自发扩散现象 溶液中水的化学势 u=Ho+RTIn a n的
（3）螺旋卷绕式 （4）平板式 共同的特点 （1）尽可能大的膜表面积 （2）可靠的支撑装置 （3）可引出透过液 （4）膜表面浓度差极化达到最小 8、超滤和反渗透 目的：将溶质通过一层具有选择性的薄膜，从溶液中分离出来 分离时的推动力都是压强，由于被分离物质的分子量和直径大小差别及膜孔 结构不同，其采用的压强大小不同。 反渗透膜的操作压力高达 10 MPa 超滤和反渗透操作中的渗透压由于超滤和反渗透过程都是用一种半透膜把两 种不同浓度的溶液隔开（淡水或盐水），因此都存在渗透压。 渗透压的大小取决于溶液的种类、浓度和温度； 一般说来，无机小分子的渗透压要比有机大分子溶质的渗透压高得多。 9、渗透与反渗透 渗透是由于存在化学势存在梯度而引起的自发扩散现象。 溶液中水的化学势 = 0 + RT ln 0 溶液中水的活度 纯水的化学势
因此,通常情况下,μ〉μ其结果是水从纯水一侧透过半透膜向溶液侧渗透, 使后者的液位抬高。 如果在溶液一侧施加压力P,外界力做功使溶液中水的化学势升高,则纯水 通过膜的渗透就会逐渐减小,并最终停止(条件?),此时的压力差就是溶液的 渗透压。 超P>P>户m 半透膜 反渗遗户>户。≯户tm 淡水盐水 v三 1 :°。°?; 图10-6渗透平衡 压力户一操作压力,户一渗遭压,户一大 溶剂;2一溶液,3一半透旗;。一高分子化合物 低分子化合物 当-P>π时,水将从溶液—侧向纯水一侧移动,此种渗透称之为反渗透。 0、实现超滤和反渗透的条件 ◆超滤:需要增加流体的静压力,改变天然过程的方向,才可能发生含有低分子量化合物的溶 剂流通过膜,此时的推动力是流体静压力与渗透压的压差 p>Po pa P> po >> p ◆反渗透:过程类似于超滤,只是纯溶剂通过膜,而低分子量的化合物被截留。因此,操作压 力比超滤大得多。◆因此,超滤和反渗透通常又被称之为ˆ强制膜分离过程'I、超 滤的基本方程 12、纳米膜过滤 度(单位时间、单位膜面积的处理量) 介于反渗透与超滤膜之间,能截留有机小分孑而使大部分无机盐通过;
因此，通常情况下， o 其结果是水从纯水一侧透过半透膜向溶液侧渗透， 使后者的液位抬高。 如果在溶液一侧施加压力 P1 ，外界力做功使溶液中水的化学势升高，则纯水 通过膜的渗透就会逐渐减小，并最终停止（条件？），此时的压力差就是溶液的 渗透压 。 当 P1 − P0 时，水将从溶液一侧向纯水一侧移动，此种渗透称之为反渗透。 10、实现超滤和反渗透的条件 ◆超滤：需要增加流体的静压力，改变天然过程的方向，才可能发生含有低分子量化合物的溶 剂流通过膜，此时的推动力是流体静压力与渗透压的压差； ◆反渗透：过程类似于超滤，只是纯溶剂通过膜，而低分子量的化合物被截留。因此，操作压 力比超滤大得多。◆因此，超滤和反渗透通常又被称之为“强制膜分离过程”11、超 滤的基本方程 12、纳米膜过滤技术 介于反渗透与超滤膜之间，能截留有机小分子而使大部分无机盐通过； pp p0 patm pp p0 patm J L ( p a ) w = p − Lp：穿透度（单位时间、单位膜面积的处理量）
特点 (1)在过滤分离过程中,能截留小分子有机物,并可以同时透析除盐,集浓 缩与透析为一体; (2)操作压力低 13、电渗析技术 电渗析技术是在直流电场的作用下,由于离子交换膜的阻隔作用,实现溶液 的淡化和浓缩,分离推动力是静电引力。 EB 阳牒M 电泳ⅹ 电泳概念 Arne tiselius物理化学家、诺贝尔类 金获得者 定义荷电的胶体粒子在电场中的移 Albumin 动 Apply alpha nple 20 min globulins 电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的 beta 扩散双电层,离子尺寸越大、溶液中的离子 globulins 强度越高时,电泳现象变得越明显。因此 globulins 电泳现象中的表面电势和双电层的因素起 Separating serum proteins by electrophoresis
特点： （1）在过滤分离过程中，能截留小分子有机物，并可以同时透析除盐，集浓 缩与透析为一体； （2）操作压力低 13、电渗析技术 电渗析技术是在直流电场的作用下，由于离子交换膜的阻隔作用，实现溶液 的淡化和浓缩，分离推动力是静电引力。 三、电泳技术 1、电泳概念 Arne Tiselius——物理化学家、诺贝尔奖 金获得者 定义——荷电的胶体粒子在电场中的移 动； 电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的 扩散双电层，离子尺寸越大、溶液中的离子 强度越高时，电泳现象变得越明显。因此， 电泳现象中的表面电势和双电层的因素起
着决定性的作用。 2、电泳的原理 蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中,它们的净电荷取决于介质的 H浓度或与其它大分子的相互作用 带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺寸大小和形状、分子所带电荷 或分子的生物学与化学特性 3、电泳迁移率 电泳迁移率( mobility)在电位梯度E的影响下,带电颗粒在时间t中的迁 移距离d t·E 其单位是cm2ec1V-1 电泳迁移率的不同提供了从混合物中分离不同物质的基础 4、电泳的大致分类 依据电泳原理,现有三种形式的电泳分离系统 (1)移动界面电泳( moving boundary electrophoresis (2)区带电泳( zone electrophoresis) (3)稳态电泳( steady state electrophoresis) 其中以区带电泳为目前常用的电泳系统。 5、区带电泳的主要技术 具有支持介质的区带电泳具有防止电泳过程中的对流和扩散,可使被分离的 成分得到最大分辨率的分离
着决定性的作用。 2、电泳的原理 蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的 H+浓度或与其它大分子的相互作用。 带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺寸大小和形状、分子所带电荷 或分子的生物学与化学特性。 3、电泳迁移率 电泳迁移率（mobility）:在电位梯度 E 的影响下，带电颗粒在时间 t 中的迁 移距离 d。 其单位是 cm2·sec-1 ·V-1 电泳迁移率的不同提供了从混合物中分离不同物质的基础 4、电泳的大致分类 依据电泳原理，现有三种形式的电泳分离系统 （1）移动界面电泳（moving boundary electrophoresis） （2）区带电泳（zone electrophoresis ） （3）稳态电泳（steady state electrophoresis ） 其中以区带电泳为目前常用的电泳系统。 5、区带电泳的主要技术 具有支持介质的区带电泳具有防止电泳过程中的对流和扩散，可使被分离的 成分得到最大分辨率的分离； t E d m =
区带电泳中的常用技术 载体电泳:粉未电泳、纸电泳、凝胶电泳、聚焦电泳 无载体电泳:自由电泳、毛细管电泳 6、凝胶电泳 作为电泳支持介质必须具有:化学惰性、不干扰大分子的电泳过程,化学稳 定性好、均匀、重复性好、电内渗小等特性 凝胶电泳的支持介质: (1)聚丙烯酰胺凝胶( polyacrylamide gel,PGA) 由丙烯酰胺和交联剂N,Nˉ甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的作用下, 聚合而成 (2)琼脂糖凝胶 从琼脂中精制分离岀的胶状多糖,其分子结构大部分是由1,3连接的β-D 吡喃半乳糖和1,4连接的3,6脱水α-D吡喃半乳糖交替形成的 8、丙烯酰胺的聚合 烯酰胺的聚合通常是由化学或光化学过程完成的,通常采用过硫酸铵、过硫 酸钾或核黄素(引发剂)来引发该过程以N,N,NN-四甲基乙二胺( TEMED) 为增速剂 该引发-增速的催化系统实质是自由基催化的氧化还原过程。 丙烯酰胺的化学聚合是由过硫酸铵在碱性条件下,产生游离氧自由基引发单 体丙烯酰胺成为自由基状态,经过一系列的自由基反应得到的聚合物 9、影响聚合的主要因素
区带电泳中的常用技术 载体电泳：粉末电泳、纸电泳、凝胶电泳、聚焦电泳 无载体电泳：自由电泳、毛细管电泳 6、凝胶电泳 作为电泳支持介质必须具有：化学惰性、不干扰大分子的电泳过程，化学稳 定性好、均匀、重复性好、电内渗小等特性。 凝胶电泳的支持介质： （1）聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel, PGA） 由丙烯酰胺和交联剂 N，N’-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的作用下， 聚合而成； （2）琼脂糖凝胶： 从琼脂中精制分离出的胶状多糖，其分子结构大部分是由 1，3 连接的β-D 吡喃半乳糖和 1，4 连接的 3，6 脱水α-D 吡喃半乳糖交替形成的； 8、丙烯酰胺的聚合 烯酰胺的聚合通常是由化学或光化学过程完成的，通常采用过硫酸铵、过硫 酸钾或核黄素（引发剂）来引发该过程；以 N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED） 为增速剂。 该引发-增速的催化系统实质是自由基催化的氧化-还原过程。 丙烯酰胺的化学聚合是由过硫酸铵在碱性条件下，产生游离氧自由基引发单 体丙烯酰胺成为自由基状态，经过一系列的自由基反应得到的聚合物； 9、影响聚合的主要因素
(1)引发剂和增速剂的浓度:浓度小易导致聚合速度慢;浓度过大则易导 致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变;一般控制使聚合过程在40-60分钟内完成 (2)系统pH值:酸性条件、碱性条件均可,但仍然存在一个最佳pH值, 以获得最佳的聚合结果; (3)温度:低温下聚合导致凝胶变脆和混浊;适当提高温度可以是凝胶透 明而有弹性; (4)分子氧:分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合;抽气 (5)系统纯度:金属离子会影响凝胶的聚合 10、聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子筛效应 在使用凝胶介质的电泳中,由于电泳介质具有高粘度和高的摩擦阻力,因此 不仅可以防止对流,而且可以把扩散减到最小 凝胶中的大分子分离取决于它的电荷、尺寸和形状 凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力(size sieving capacity),这种现象被称为分子筛效应( molecular sieving effect 图中A,B,C均为阳离子,在直流电场作用下电泳情况示意图 分子量大小依次为MA=MBMC,所带电荷量相同QA=QB=QC
（1）引发剂和增速剂的浓度：浓度小易导致聚合速度慢；浓度过大则易导 致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使聚合过程在 40~60 分钟内完成。 （2）系统 pH 值：酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳 pH 值， 以获得最佳的聚合结果； （3）温度：低温下聚合导致凝胶变脆和混浊；适当提高温度可以是凝胶透 明而有弹性； （4）分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气 （5）系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合； 10、聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子筛效应 在使用凝胶介质的电泳中，由于电泳介质具有高粘度和高的摩擦阻力，因此 不仅可以防止对流，而且可以把扩散减到最小。 凝胶中的大分子分离取决于它的电荷、尺寸和形状 凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力（size sieving capacity），这种现象被称为分子筛效应（molecular sieving effect） A B C + - 图中 A，B，C 均为阳离子，在直流电场作用下电泳情况示意图 分子量大小依次为 MA=MB>MC，所带电荷量相同 QA=QB=QC
lⅠ、琼脂糖凝胶的性能、结构与特点 (1)琼脂糖凝胶孔径较大,0.075%琼脂糖的孔径为800nm,可以分析百万 道尔顿分子量的大分子,但分辨率较凝胶电泳低 (2)机械强度高:可以在浓度1%以下使用 (3)无毒 (4)染色、脱色程序简单,背景色较低 (5)热可逆性 (6)生物中性:一般不与生物材料结合 (7)电内渗(EEO)大:对于对流电泳有益 12、电泳系统的基本组成 (1)电泳槽:是凝胶电泳系统的核心部分,管式电泳槽、垂直板电泳槽、 水平板电泳槽 (2)电源聚丙烯酰胺凝胶电泳200-600V,载体两性电解质等电聚焦电泳 1000~2000V,固相梯度等电聚焦3000-8000V (3)外循环恒温系统高电压会产生高热,需冷却 (4)凝胶干燥器用于电泳和染色后的干燥; (5)灌胶模具:制胶,玻璃板和梳子 (6)电泳转移装置:利用低电压,大电流的直流电场,使凝胶电泳的分离 区带或电泳斑点转移到特定的膜上,如PVDF膜 (7)电泳洗脱仪:回收样品 (8)凝胶扫描和摄录裝置:对电泳区带进行扫描,从而给岀定量的结果
11、琼脂糖凝胶的性能、结构与特点 （1）琼脂糖凝胶孔径较大，0.075%琼脂糖的孔径为 800nm，可以分析百万 道尔顿分子量的大分子，但分辨率较凝胶电泳低。 （2）机械强度高：可以在浓度 1%以下使用； （3）无毒； （4）染色、脱色程序简单，背景色较低； （5）热可逆性； （6）生物中性：一般不与生物材料结合； （7）电内渗（EEO）大：对于对流电泳有益 12、电泳系统的基本组成 （1）电泳槽：是凝胶电泳系统的核心部分，管式电泳槽、垂直板电泳槽、 水平板电泳槽 （2）电源:聚丙烯酰胺凝胶电泳 200~600V，载体两性电解质等电聚焦电泳 1000~2000V，固相梯度等电聚焦 3000~8000V （3）外循环恒温系统:高电压会产生高热，需冷却； （4）凝胶干燥器:用于电泳和染色后的干燥； （5）灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子； （6）电泳转移装置：利用低电压，大电流的直流电场，使凝胶电泳的分离 区带或电泳斑点转移到特定的膜上，如 PVDF 膜 （7）电泳洗脱仪：回收样品 （8）凝胶扫描和摄录装置：对电泳区带进行扫描，从而给出定量的结果