实验8分光光度法检测有色溶液吸收光谱 实验目的 1.掌握单光束分光光度计检测有色溶液吸收光谱的方法 2.了解双光束分光光度计扫描有色溶液吸收光谱的方法。 3.对已知最大吸收峰波长值的溶液进行测定，当出现实际测得的值与理论值 不符时，能分析其产生的原因。 实验器材 单光束可见分光光度计一台，双光束紫外-可见分光光度计一台，光径1©m 玻璃比色杯2个，光径1cm石英比色杯2个，用蒸馏水稀释200倍的抗凝血10ml, 偏重亚硫酸钠粉末。 实验原理 如果将两种适当颜色的单色光按一定的强度比例混合可以成为白光，这样的 两种光互称为互补光。紫外-可见分光光度计的可见光谱分析要求被测溶液的颜 色与所用的单色光互补，以求达到溶液对光的最大吸收。在某些方法学研究中要 预先测定某种溶液的最大吸收光的波长。 紫外可见分光光度计是利用物质对光的有选择吸收现象，对物质进行定性、 定量分析。可在一定波长范围内扫描出溶液的吸收光谱图，并且确定其最大吸收 波长值。血红蛋白与氧结合生成氧合血红蛋白，在可见光范围内有两个最大吸收 峰，即542nm和576nm,而未氧合的血红蛋白仅在552nm处有一个较宽的吸收 峰。向氧合血红蛋白溶液中加入少量还原剂偏重亚硫酸钠，可以看到542m和 576nm吸收峰消失，在552nm处出现新的吸收峰。 仪器描述 常用的分光光度计包括含有紫外光的分光光度计和不含紫外光的分光光度 计。前者称为紫外可见分光光度计，含有发射紫外光的光源：后者称为可见光 分光光度计，不含有发射紫外光的光源。分光光度计按着光路结构不同，又可分 为单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波长分光光度计，前两者比较常用 双光束分光光度计可以进行光谱扫描，单光束分光光度计不能进行光谱扫描。 紫外-可见分光光度计种类很多，结构不尽相同。但其基本结构都由光源
实验 8 分光光度法检测有色溶液吸收光谱 实验目的 1.掌握单光束分光光度计检测有色溶液吸收光谱的方法。 2.了解双光束分光光度计扫描有色溶液吸收光谱的方法。 3.对已知最大吸收峰波长值的溶液进行测定，当出现实际测得的值与理论值 不符时，能分析其产生的原因。 实验器材 单光束可见分光光度计一台，双光束紫外-可见分光光度计一台，光径 1cm 玻璃比色杯 2 个，光径 1cm 石英比色杯 2 个，用蒸馏水稀释 200 倍的抗凝血 10ml， 偏重亚硫酸钠粉末。 实验原理 如果将两种适当颜色的单色光按一定的强度比例混合可以成为白光，这样的 两种光互称为互补光。紫外-可见分光光度计的可见光谱分析要求被测溶液的颜 色与所用的单色光互补，以求达到溶液对光的最大吸收。在某些方法学研究中要 预先测定某种溶液的最大吸收光的波长。 紫外可见分光光度计是利用物质对光的有选择吸收现象，对物质进行定性、 定量分析。可在一定波长范围内扫描出溶液的吸收光谱图，并且确定其最大吸收 波长值。血红蛋白与氧结合生成氧合血红蛋白，在可见光范围内有两个最大吸收 峰，即 542nm 和 576nm，而未氧合的血红蛋白仅在 552nm 处有一个较宽的吸收 峰。向氧合血红蛋白溶液中加入少量还原剂偏重亚硫酸钠，可以看到 542nm 和 576nm 吸收峰消失，在 552nm 处出现新的吸收峰。 仪器描述 常用的分光光度计包括含有紫外光的分光光度计和不含紫外光的分光光度 计。前者称为紫外-可见分光光度计，含有发射紫外光的光源；后者称为可见光 分光光度计，不含有发射紫外光的光源。分光光度计按着光路结构不同，又可分 为单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波长分光光度计，前两者比较常用。 双光束分光光度计可以进行光谱扫描，单光束分光光度计不能进行光谱扫描。 紫外-可见分光光度计种类很多，结构不尽相同。但其基本结构都由光源
单色器、吸收池、检测器和信号显示系统五部分组成。光源是提供入射光的装置， 包括钨灯和卤钨灯、氢灯和氘灯、汞灯，其中氢灯和氘灯是提供紫外光的光源 单色器是产生单色光的装置，由入射狭缝、色散元件、准直镜和出射狭缝组成 其中色散元件能将来自光源的复合光分解为单色光，色散元件包括棱镜和光栅。 吸收池又称为比色皿、比色杯、样品池或液槽等，是用来盛放被测溶液的器件， 同时也决定着透光液层厚度、特定波长光的透光度等多种参数，应具有良好的透 光性和较强的耐腐蚀性。在可见光范围内，常用无色光学玻璃或塑料制作：在紫 外区，需用能透紫外线的石英玻璃或蓝宝石制作。检测器是把光信号转换为电信 号的装置，包括光电管、光电倍增管和光电二极管阵列。信号显示系统是把放大 的信号以适当的方式显示或记录下来的装置。常用的信号显示装置有指针显示 LD数字显示、VGA屏幕显示和计算机显示等四种类型。 实验步骤 1.单光束可见分光光度计检测氧合血红蛋白吸收光谱 (1)打开电源开关，打开单光束可见分光光度计测定室盖子，将测定波长调 至530nm,预热20min。 (2)取光径1cm玻璃比色杯2个，其中1个加入2ml蒸馏水，另一个加入2ml 蒸馏水稀释200倍的抗凝血 (3)在530nm~582nm的波长范围内，每隔2nm以蒸馏水调零测一次血红蛋 白吸光度值，将吸光度(A)值填入下表14-1。注意：每次改变测定波长后，都 要用蒸馏水调零。 (4)以波长为横坐标，以对应的吸光度值为纵坐标绘制出曲线，检查最大吸 收峰是否为542nm和576nm。 2.单光束可见分光光度计检测非氧合血红蛋白吸收光谱 (1)取蒸馏水稀释200倍的抗凝血8ml,加入0.5g偏重亚硫酸钠粉末，混匀， 静止10min,此时的血红蛋白为非氧合血红蛋白。 步骤(2)~(4)同上述(2)~(4)，并将吸光度(A)值填入下表14-1， 检查最大吸收峰是否为552nm。 3.双光束分光光度计扫描氧合血红蛋白吸收光谱 (1)打开电源开关，打开双光束可见分光光度计测定室盖子，将测定波长调至 530nm,预热20min
单色器、吸收池、检测器和信号显示系统五部分组成。光源是提供入射光的装置， 包括钨灯和卤钨灯、氢灯和氘灯、汞灯，其中氢灯和氘灯是提供紫外光的光源。 单色器是产生单色光的装置，由入射狭缝、色散元件、准直镜和出射狭缝组成。 其中色散元件能将来自光源的复合光分解为单色光，色散元件包括棱镜和光栅。 吸收池又称为比色皿、比色杯、样品池或液槽等，是用来盛放被测溶液的器件， 同时也决定着透光液层厚度、特定波长光的透光度等多种参数，应具有良好的透 光性和较强的耐腐蚀性。在可见光范围内，常用无色光学玻璃或塑料制作；在紫 外区，需用能透紫外线的石英玻璃或蓝宝石制作。检测器是把光信号转换为电信 号的装置，包括光电管、光电倍增管和光电二极管阵列。信号显示系统是把放大 的信号以适当的方式显示或记录下来的装置。常用的信号显示装置有指针显示、 LD 数字显示、VGA 屏幕显示和计算机显示等四种类型。 实验步骤 1.单光束可见分光光度计检测氧合血红蛋白吸收光谱 （1）打开电源开关，打开单光束可见分光光度计测定室盖子，将测定波长调 至 530nm，预热 20min。 （2）取光径 1cm 玻璃比色杯 2 个，其中 1 个加入 2ml 蒸馏水，另一个加入 2ml 蒸馏水稀释 200 倍的抗凝血。 （3）在 530nm～582nm 的波长范围内，每隔 2nm 以蒸馏水调零测一次血红蛋 白吸光度值，将吸光度（A）值填入下表 14-1。注意：每次改变测定波长后，都 要用蒸馏水调零。 （4）以波长为横坐标，以对应的吸光度值为纵坐标绘制出曲线，检查最大吸 收峰是否为 542nm 和 576nm。 2.单光束可见分光光度计检测非氧合血红蛋白吸收光谱 （1）取蒸馏水稀释 200 倍的抗凝血 8ml，加入 0.5g 偏重亚硫酸钠粉末，混匀， 静止 10min，此时的血红蛋白为非氧合血红蛋白。 步骤（2）～（4）同上述（2）～（4），并将吸光度（A）值填入下表 14-1， 检查最大吸收峰是否为 552nm。 3.双光束分光光度计扫描氧合血红蛋白吸收光谱 （1）打开电源开关,打开双光束可见分光光度计测定室盖子，将测定波长调至 530nm，预热 20min
(2)取光径1cm石英比色杯2个，其中1个加入2ml蒸馏水，另一个加入2m1 蒸馏水稀释200倍抗凝血。 (3)设定吸收光谱扫描程序，以装有蒸馏水的比色杯为对照，从波长530m 一直扫描到582m,波长连续变化，吸光度值随波长变化而变化，打印机自动输 出吸收光谱曲线，检查最大吸收峰对应的波长位置。 4.双光束分光光度计扫描非氧合血红蛋白吸收光谱 方法同3，只是将装有氧合血红蛋白液的石英比色杯换装成非氧合血红蛋白 液即可。 数据记录及处理 将所得的吸光度(A)值填入表14-1。 表141不同波长处的吸光度值 波长530532534536538540542544546548 550 559554 (nm) 吸光 度A 波长556558560562564568570572574576578580582 (nm) 吸光 度A 思考题 1.简述紫外可见分光光度计的工作原理。 2.简述紫外可见分光光度计的基本结构。 3.若测得的血红蛋白最大吸收峰与理论值不符，分析其原因 4.与单光束分光光度计相比，用双光束分光光度计扫描检测溶液最大吸收 峰有何优点？
（2）取光径 1cm 石英比色杯 2 个，其中 1 个加入 2ml 蒸馏水，另一个加入 2ml 蒸馏水稀释 200 倍抗凝血。 （3）设定吸收光谱扫描程序，以装有蒸馏水的比色杯为对照，从波长 530nm 一直扫描到 582nm，波长连续变化，吸光度值随波长变化而变化，打印机自动输 出吸收光谱曲线，检查最大吸收峰对应的波长位置。 4.双光束分光光度计扫描非氧合血红蛋白吸收光谱 方法同 3，只是将装有氧合血红蛋白液的石英比色杯换装成非氧合血红蛋白 液即可。 数据记录及处理 将所得的吸光度（A）值填入表 14-1。 表 14-1 不同波长处的吸光度值 波 长 （nm） 530 532 534 536 538 540 542 544 546 548 550 552 554 吸 光 度 A 波 长 （nm） 556 558 560 562 564 568 570 572 574 576 578 580 582 吸 光 度 A 思考题 1．简述紫外可见分光光度计的工作原理。 2. 简述紫外可见分光光度计的基本结构。 3．若测得的血红蛋白最大吸收峰与理论值不符，分析其原因 4．与单光束分光光度计相比，用双光束分光光度计扫描检测溶液最大吸收 峰有何优点？