2.4指纹图谱技术(DGGE)
2.4 指纹图谱技术（DGGE）
-MicrobialFingerprint MethodscommunityExtracttotalcommunityDNAAmplifybyPCRusing fluorescentlyDNAtaggedprimersAmplify165RNADNA多态性，生物的不genes using generalPCRprimers (forexample,Bacteria-specific)or同个体或种群在DNA结morerestrictiveRestrictionSampleprimers (to targetenzymedigest andendospore-forming1234构上的差异。Bacteria)runongelGelAll16SSamplerRNA以DNA的多态性为基础1234福genesT-RFLPgelSample产生具有高度个体特异1234性的DNA指纹图谱。DifferentDGGEgel16SrRNAExcisebandsgenesandclone16SExciserRNAgenesDGGE, SSCP, T-RFLPbandsSequenceSequenceBacillussubtilisEnv1GenerateGenerateBacilus cereustreefromtreefromresultsresultsBacillusmegateriumusingusingEnv2endospore-endospore-Clostridiumhistolyticumspecificspecificprimers-Env3primers4
Fingerprint Methods DNA多态性，生物的不 同个体或种群在DNA结 构上的差异。 以DNA的多态性为基础， 产生具有高度个体特异 性的DNA指纹图谱。 DGGE, SSCP, T-RFLP, 4
变性梯度凝胶电泳denaturedgradientgelelectrophoresis,DGGE5
变性梯度凝胶电泳 (denatured gradient gel electrophoresis, DGGE) 5
概述变性梯度凝胶电泳（denaturedgradientgelelectrophoresis，DGGE），最初是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变。Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)。此后十年间，该技术被广泛应用于环境微生物学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的常用分子生物学方法之一。6
概述 变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）, 最初 是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段 中的点突变。Muyzer 等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究。 后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis, TGGE)。 此后十年间，该技术被广泛应用于环境微生物学研究的各个领域，目前 已经发展成为研究微生物群落结构的常用分子生物学方法之一。 6
DGGE原理DNA片段的序列组成决定了其解链区域（meltingdomain）和解链行为OAFAOOFSingle strands1.2(meltingbehavior)。Melting一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段特异1.0Tm=85.0°的碱基组成。当变性剂逐渐增加达到其最低的解链条件时，该区域这一段碱基Doublestrand对发生解链。0.8当变性剂浓度再升高依次达到各其它解72768084889296'C链区域解链条件时，这些区域也依次发生解链，直到双链DNA完全解链。7
DNA片段的序列组成决定了其解链区 域（melting domain）和解链行为 （melting behavior)。 一个几百个碱基对的DNA片段一般有 几 个解链区域，每个解链区域有一段特 异 的碱基组成。当变性剂逐渐增加达到 其 最低的解链条件时，该区域这一段碱 基 对发生解链。 当变性剂浓度再升高依次达到各其它解 链区域解链条件时，这些区域也依次发 生解链，直到双链DNA完全解链。 DGGE原理 7
DGGE时，开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和一般的聚丙烯酰胺胶中一样。当DNA片段迁移到一特定位置，其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧降低。Coa同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达(a)PCRamplification到各自最低解链条件，因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。(b)DGGEA
DGGE时，开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA片段最低的解 链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和一般的聚丙烯酰胺胶中一 样。 当DNA片段迁移到一特定位置，其变性剂浓度刚好能使双链DNA片 段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生 解链。部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧降低。 同样长度但序列不同的DNA 片段会在胶中不同位置处达 到各自最低解链条件，因此 它们会在胶中的不同位置处 发生部分解链导致迁移速率 大大下降，从而在胶中被区 分开来。 8
DGGE对DNA片断的分离示意图Denaturant0%100% sampleElectrophoresis1 sample 2Partiallymelted2D1TTTTTTPartiallymeltedSinglestrandsTTDoublestrando
DGGE对DNA片断的分离示意图 1 2 9
一旦变性剂浓度达到DNA片段最高的解链区域温度时，DNA片段会完全解链，成为单链DNA分子，此时它们又能在胶中继续迁移。如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夹子，一般30一50个碱基对）可以解决这个问题。■含有GC夹子的DNA片段最高的解链区域在GC夹子这一段序列处，它的解链温度很高，可以防止DNA片段在DGGE/TGGE胶中完全解链。当加了GC夹子后，DNA片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开。40bpGC-clampP153416SrDNAF2341Kp210
一旦变性剂浓度达到DNA片段最高的解链区域温度时，DNA片段会完全 解链，成为单链DNA分子，此时它们又能在胶中继续迁移。 如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不 能被区分开来。在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夹 子，一般30－50个碱基对）可以解决这个问题。 含有GC夹子的DNA片段最高的解链区域在GC夹子这一段序列处，它的解 链温度很高，可以防止DNA片段在DGGE/TGGE胶中完全解链。当加了 GC夹子后，DNA片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开。 1 0
-withGC-clamp(A)-withoutGC-clampE.coliDGGEseparationpatternof111PCR-amplified16SrDNA0255075100%denaturantfragments from E. coli (A)andD. desulfuricans (B) obtained-withGC-damp(B)with primers, which introduce-withoutGC-clampa40-bpGCclampatthe5'endof the fragments.D.desulfuricans0255075100%denaturant11
DGGE separation pattern of PCR-amplified 16S rDNA fragments from E. coli (A) and D. desulfuricans (B) obtained with primers, which introduce a 40-bp GC clamp at the 5' end of the fragments. 1 1 E. coli D. desulfuricans
PCR-DGGE技术路线PCR扩增(Polymerase Chain Reaction)优化模板量。设置阴性对照和阳性对照。采用TOUCHDOWN模式扩增DNA样品。用通用引物扩增细菌16SrRNA基因，通常对应于16SrRNA基因V3变区
PCR-DGGE技术路线 PCR扩增(Polymerase Chain Reaction) 优化模板量。 设置阴性对照和阳性对照。 采用TOUCHDOWN模式扩增DNA样品。 用通用引物扩增细菌16S rRNA基因，通常对应于 16S rRNA基因V3变区