重庆医科大学内部使用教材 生物化学与分子生物学实验 重庆医科大学 2008年1月重庆
重庆医科大学内部使用教材 生物化学与分子生物学实验 重庆医科大学 2008 年 1 月 重庆
目 录 第一章生物化学部分 实验一、双缩脲法测定血清蛋白质含量 实验二、纸层析法观察转氨基作用 .2 实验三、血清醋酸纤维薄膜电泳4 实验四、血清丙氨酸氨基转移酶活性测定 .7 实验五、胰酶对蛋白质的消化和影响酶作用的因素 0.10 实验六、酶的竞争性抑制作用13 实验七、血糖浓度的测定 .16 实验八、血清Y球蛋白的分离纯化与鉴定 .18 第二章分子生物学部分25 实验一、质粒DNA的提取制备与检测 .25 实验二、PCR技术 . 28 实验三、DNA的限制性酶切与电泳 31 实验四、DNA连接实验 38 实验五、重组DNA转化与篮白斑筛选 41 实验六、SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量 44
目 录 第一章 生物化学部分.1 实验一、双缩脲法测定血清蛋白质含量. 1 实验二、纸层析法观察转氨基作用. 2 实验三、血清醋酸纤维薄膜电泳. 4 实验四、血清丙氨酸氨基转移酶活性测定. 7 实验五、胰酶对蛋白质的消化和影响酶作用的因素. 10 实验六、酶的竞争性抑制作用. 13 实验七、血糖浓度的测定. 16 实验八、血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定. 18 第二章 分子生物学部分.25 实验一、质粒 DNA 的提取制备与检测. 25 实验二、PCR 技术. 28 实验三、DNA 的限制性酶切与电泳. 31 实验四、DNA 连接实验. 38 实验五、重组 DNA 转化与篮白斑筛选. 41 实验六、SDS-PAGE 测定蛋白质的相对分子量. 44
第一章生物化学部分 实验一、双缩脲法测定血清蛋白质含量 【实验目的】 1,掌握双缩脲法测定蛋白质的原理。 2.学习掌握分光光度计的使用。 【实验原理】 分子中含有两个或两个以上肽键(-CONH-)的化合物，在碱性溶液中能与硫酸铜中Cu+反应生 成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多肽键，具有双缩脲反应，且在 一定范围内紫红色颜色的深浅与蛋白质含量成正比，因此可以用光吸收法测定样品中蛋白质的含 量。 双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一，该方法的优点是操作简便、迅速、受蛋白质性 质的影响较小。在体液中小分子多肽含量极少，除蛋白质外几乎不存在能与双缩脲试剂显色的物 质。各种血浆蛋白质，包括正常和病理的，呈色程度基本相同，因此双缩脲法是测定血浆蛋白较 简便的方法。但本方法灵敏度较差，需要样本含蛋白质1~20mg水平才能检测到：而且特异性不 高，除含-CONH-的化合物有此反应外，凡是含-CONH2、-CHNH2、-CS-NH等基团的化合物也有 此反应。 【实验材料与仪器】 1.仪器和材料 (1)721型分光光度计。 (2)玻璃仪器：试管13支：1毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支（或移液器一个）。 (3)坐标纸。 2.试剂 (1)6 mol NaOH:称取240g氢氧化钠溶于1000ml水中。 (2)双缩脲试剂：称取CuS04·5H02.5g,酒石酸钾10.0g和碘化钾5.0g,分别溶解后混 匀，加5 mol NaOH100ml,最后加水至1000ml,贮于棕色瓶中，避光保存（有暗红色沉淀不能 使用)。 (3)9 g/L NaCl溶液。 (4)蛋白质标准液(10mgml):称取干燥牛血清蛋白100.0mg,以少量9 g/L NaC1溶液溶解 后倒入I0ml容量瓶中，淋洗称量瓶数次，一并倒入容量瓶中，最后用9 g/L NaCl溶液加至刻度。 或用凯氏定氮法测定血清蛋白质含量，然后稀释成10mgml作为蛋白质标准液。 (5)待测血清样本：将人血清、或动物血清用9 g/L NaCl溶液稀释10倍，即可用于测定。 【实验步骤】 1.取试管13支，编号（除空白管只做1管外，其它各号测定管均重复做两管），按下表操作 并记录： 表1-1双缩脲法测定血清蛋白质含量 管号 标准管 测定管 空白管 试剂(ml) 1x2 2×2 3×2 4×2 5×2 ×2 蛋白质标准液 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 (1ml=10mg) 待测血清样本 1.0 9g/L NaCl溶液 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 光吸收值
1 第一章 生物化学部分 实验一、双缩脲法测定血清蛋白质含量 【实验目的】 1．掌握双缩脲法测定蛋白质的原理。 2．学习掌握分光光度计的使用。 【实验原理】 分子中含有两个或两个以上肽键(-CONH-)的化合物，在碱性溶液中能与硫酸铜中 Cu2+反应生 成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多肽键，具有双缩脲反应，且在 一定范围内紫红色颜色的深浅与蛋白质含量成正比，因此可以用光吸收法测定样品中蛋白质的含 量。 双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一，该方法的优点是操作简便、迅速、受蛋白质性 质的影响较小。在体液中小分子多肽含量极少，除蛋白质外几乎不存在能与双缩脲试剂显色的物 质。各种血浆蛋白质，包括正常和病理的，呈色程度基本相同，因此双缩脲法是测定血浆蛋白较 简便的方法。但本方法灵敏度较差，需要样本含蛋白质 1~20mg 水平才能检测到；而且特异性不 高，除含-CONH-的化合物有此反应外，凡是含-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2 等基团的化合物也有 此反应。 【实验材料与仪器】 1．仪器和材料 （1）721 型分光光度计。 （2）玻璃仪器：试管 13 支；l 毫升刻度吸管 3 支，10 毫升刻度吸管 1 支（或移液器一个）。 （3）坐标纸。 2．试剂 （1）6 mol NaOH：称取 240g 氢氧化钠溶于 1000ml 水中。 （2）双缩脲试剂：称取 CuS04·5H2O 2.5g，酒石酸钾 10.0 g 和碘化钾 5.0 g，分别溶解后混 匀，加 5 mol NaOH l00 ml，最后加水至 1000 ml，贮于棕色瓶中，避光保存（有暗红色沉淀不能 使用）。 （3）9 g/L NaCl 溶液。 （4）蛋白质标准液(10 mg/m1)：称取干燥牛血清蛋白 100.0 mg，以少量 9 g/L NaCl 溶液溶解 后倒入 l0 ml 容量瓶中，淋洗称量瓶数次，一并倒入容量瓶中，最后用 9 g/L NaCl 溶液加至刻度。 或用凯氏定氮法测定血清蛋白质含量，然后稀释成 l0 mg/m1 作为蛋白质标准液。 （5）待测血清样本：将人血清、或动物血清用 9 g/L NaCl 溶液稀释 10 倍，即可用于测定。 【实验步骤】 1．取试管 13 支，编号（除空白管只做 1 管外，其它各号测定管均重复做两管），按下表操作 并记录： 表 1-1 双缩脲法测定血清蛋白质含量 管号 试剂(ml) 空白管 标准管 测定管 1×2 2×2 3×2 4×2 5×2 ×2 蛋白质标准液 （1ml=10mg） — 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 — 待测血清样本 — — — — — — 1.0 9g/L NaCl 溶液 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 — — 双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 光吸收值
(=540nm) 混匀各管，室温(20℃~30℃)放置30分钟。以空白管调零，在波长540m比色，读取各管 光吸收值，并记录。 2.在座标纸上以各管蛋白质含量为横座标，光吸收值（两管平均值）为纵座标，绘制标准曲 线。 3.以测定管的吸收值在标准曲线中查出该待测血清样本的蛋白质浓度(gL)。 4.再从标准管中选择一管与测定管光吸收值接近者，按光吸收法计算公式计算出该血清样本 的蛋白质浓度(gL)。 【注意事项】 1.本实验是定量实验，要求所有玻璃仪器必须洁净、干燥，蛋白质标准液和血清取量必须准 确。 2.各管加好样后必须充分混匀。显色反应需要20min~30min才能完成，显色后放置4小时 光吸收值稳定。 【思考题】 1.用双缩脲法和分光光度法的基本原理解释为什么双缩脲法可以定量测定蛋白质的含量。 2.为什么标准曲线法与计算法测定的蛋白质数值有差异？分析两种方法产生差异的可能原 因。 3.本实验应于加双缩脲试剂多少时间才能进行比色测定？并应在显色多少时间内完成比色读 数，为什么？ 4.标准曲线法绘制时应该注意什么？为什么必须是直线？且横、纵轴不能有截距？ (王继红) 实验二、纸层析法观察转氨基作用 【实验目的】 1.学习氨基酸纸层析的基本原理 2.掌握氨基酸纸层析的操作技术 【实验原理】 转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应。在转氨酶的催化下，氨基酸的-氨基与 酮酸的-酮基的互换反应称为转氨基作用。每种转氨基反应均由专一的转氨酶催化，转氨酶广泛 分布于机体各组织、器官。 本实验用纸层析法观察-酮戊二酸与丙酮酸在肝脏谷丙转氨酶(ALT)催化下的转氨基作用 (图2-1)。 COOH COOH CH3 CH3 (CH22 ALT (CH2) H C一NH CH—NH2 C=0 C=0 COOH COOH COOH COOH Q-酮戊二酸 丙氨酸 谷氨酸 丙酮酸 图1-1ALT催化的转氨基反应 实验组发生转氨基反应，在最后的体系中存在有两种氨基酸：而对照组不发生转氨基反应， 最后体系中只有反应物中一种氨基酸。用煮沸方法使得谷丙转氨酶(ALT)失活而终止反应，然 后用纸层法对两种氨基酸进行分离鉴定
2 (λ=540nm) 混匀各管，室温（20℃~30℃）放置 30 分钟。以空白管调零，在波长 540nm 比色，读取各管 光吸收值，并记录。 2．在座标纸上以各管蛋白质含量为横座标，光吸收值（两管平均值）为纵座标，绘制标准曲 线。 3．以测定管的吸收值在标准曲线中查出该待测血清样本的蛋白质浓度（g/L）。 4．再从标准管中选择一管与测定管光吸收值接近者，按光吸收法计算公式计算出该血清样本 的蛋白质浓度（g/L）。 【注意事项】 1．本实验是定量实验，要求所有玻璃仪器必须洁净、干燥，蛋白质标准液和血清取量必须准 确。 2．各管加好样后必须充分混匀。显色反应需要 20 min ~30 min 才能完成，显色后放置 4 小时 光吸收值稳定。 【思考题】 1．用双缩脲法和分光光度法的基本原理解释为什么双缩脲法可以定量测定蛋白质的含量。 2．为什么标准曲线法与计算法测定的蛋白质数值有差异？分析两种方法产生差异的可能原 因。 3．本实验应于加双缩脲试剂多少时间才能进行比色测定？并应在显色多少时间内完成比色读 数，为什么？ 4．标准曲线法绘制时应该注意什么？为什么必须是直线？且横、纵轴不能有截距？ （王继红） 实验二、纸层析法观察转氨基作用 【实验目的】 1．学习氨基酸纸层析的基本原理 2．掌握氨基酸纸层析的操作技术 【实验原理】 转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应。在转氨酶的催化下，氨基酸的 α-氨基与 α- 酮酸的 α-酮基的互换反应称为转氨基作用。每种转氨基反应均由专一的转氨酶催化，转氨酶广泛 分布于机体各组织、器官。 本实验用纸层析法观察 α-酮戊二酸与丙酮酸在肝脏谷丙转氨酶（ALT）催化下的转氨基作用 （图 2-1）。 COOH (CH2 )2 C=O COOH + CH3 H C NH2 COOH CH NH2 COOH (CH2 )2 COOH + C=O CH3 COOH ALT α-酮戊二酸 丙氨酸 谷氨酸 丙酮酸 图 1-1 ALT 催化的转氨基反应 实验组发生转氨基反应，在最后的体系中存在有两种氨基酸；而对照组不发生转氨基反应， 最后体系中只有反应物中一种氨基酸。用煮沸方法使得谷丙转氨酶（ALT）失活而终止反应，然 后用纸层法对两种氨基酸进行分离鉴定
纸层析按操作方法分成两类即垂直型和水平型。垂直型是将滤纸条悬挂，使流动相向上或向 下扩散。水平型是将圆形滤纸置于水平位，溶剂由中心向四周扩散。纸层析法的分离原理是分配 层析，分配层析是利用混合物在二种或二种以上的不同溶剂中总的分配系数的不同而使物质分离 的方法，相当于一种连续的萃取过程。 纸层析以滤纸为支持介质，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。某些与水不相 溶的有机溶剂如醇、酚等为常用的流动相。把预分离的物质加在纸的一端，使流动溶剂经此向另 一端移动，这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配。由于物质分配系数的差异， 移动速度就不一样，在固定相中分配趋势较大的组分，随流动相移动的速度就慢：反之，在流动 相分配趋势较大的成分，移动速度就快，最终不同的组分彼此分离。物质在纸上移动的速率可以 用比移值(R)表示： Rf三溶质中心到原点中心的距离 溶剂前缘到原点中心的距离 物质在一定的溶剂中的分配系数是一定的，故比移值(R)也相对恒定，因此在同一层析体 系中可用R值来鉴别被分离的物质。 用纸层系法分离氨基酸混合物时，影响R值的主要因素是侧链基团的极性。例如丙氨酸侧链 极性要小于谷氨酸侧链的极性，所以混合物中丙氨酸在滤纸上运动要快，R:值大：反之谷氨酸在 滤纸上运动慢，R值小。 【实验材料与仪器】 1.仪器 剪刀：镊子：托盘：培养皿：表面皿：毛细管：喷雾器：吹风机：水浴箱：电炉。 2.试剂 (1)pH7.40.01molM磷酸缓冲液：取0.2molM磷酸氢二钠溶液81ml和0.2molM磷酸二氢 钠溶液19ml混匀，用蒸馏水稀释20倍。 (2)0.2mo1丙氨酸溶液：称取丙氨酸0.891g先溶于少量pH7.410mol1磷酸缓冲液中， 以1mol1氢氧化钠仔细调节至pH7.4后，用磷酸缓冲液加至100ml。 (3)0.1mol1a-酮戊二酸溶液：称取a-酮戊二酸1.461g先溶于少量的pH7.410mol1磷酸 缓冲液中以1mol/1氢氧化钠仔细调节至PH7.4后，用磷酸缓冲液加至100ml。 (4)0.1mol/1谷氨酸溶液：称取谷氨酸0.735g先溶于少量的pH7.40.01mol1磷酸缓冲液 中，以1mol/M氢氧化钠仔细调节至pH7.4后，用磷酸缓冲液加至50ml。 (5)0.5%茚三酮溶液：称取茚三酮0.5g溶于100ml丙酮中。 (6)层析溶剂（酚的饱和水溶液）：将重蒸过的酚2份和水1份（按重量计算）混合后，放 入分液漏斗中，振荡，静止24小时后分层，将下部酚层放到瓶中备用。 【实验步骤】 1.肝匀浆制备：取新鲜的动物肝脏0.5g,在研钵中剪碎，研成匀浆，加入9倍体积(4.5ml) Ph7.40.01mol1磷酸缓冲液。 2.转氨基反应：取干燥小试管（或离心管）二支，分别标明测定管与对照管，各加入肝匀浆 10滴，测定管加入37℃水浴保温10分钟，对照管放入沸水浴中煮10分钟，待对照管冷却后，于 两试管中分别加入0.1mol1丙氨酸10滴，0.1mol1-酮戊二酸10滴，pH7.40.01moM磷酸缓冲 液1.5l,摇匀，放进37℃水浴保温30分钟，保温完毕，立即将测定管放入沸水浴中煮沸10分 钟以终止反应，取出冷却后，过滤。取滤液备用。 3.层析：取直径9cm圆形滤纸一张，用圆规作半径1cm同心圆，通过圆心作两条相互垂直 的线（见图2-2），在1、3两处分别点测定管和对照管上清液1-2滴。方法是用毛细管在纸上点样， 注意斑点不可太大（一般为直径0.5cm)而且每点一滴需干燥后方可在点第二滴，在2、4两处则 各加0.1mol/1丙氨酸和0.1mol/1谷氨酸1滴~2滴。 3
3 纸层析按操作方法分成两类即垂直型和水平型。垂直型是将滤纸条悬挂，使流动相向上或向 下扩散。水平型是将圆形滤纸置于水平位，溶剂由中心向四周扩散。纸层析法的分离原理是分配 层析，分配层析是利用混合物在二种或二种以上的不同溶剂中总的分配系数的不同而使物质分离 的方法，相当于一种连续的萃取过程。 纸层析以滤纸为支持介质，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。某些与水不相 溶的有机溶剂如醇、酚等为常用的流动相。把预分离的物质加在纸的一端，使流动溶剂经此向另 一端移动，这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配。由于物质分配系数的差异， 移动速度就不一样，在固定相中分配趋势较大的组分，随流动相移动的速度就慢；反之，在流动 相分配趋势较大的成分，移动速度就快，最终不同的组分彼此分离。物质在纸上移动的速率可以 用比移值（Rf）表示： 到原点中心的距离 中心到原点中心的距 离 Rf 溶剂前缘 溶质 = 物质在一定的溶剂中的分配系数是一定的，故比移值（Rf）也相对恒定，因此在同一层析体 系中可用 Rf值来鉴别被分离的物质。 用纸层系法分离氨基酸混合物时，影响 Rf值的主要因素是侧链基团的极性。例如丙氨酸侧链 极性要小于谷氨酸侧链的极性，所以混合物中丙氨酸在滤纸上运动要快，Rf 值大；反之谷氨酸在 滤纸上运动慢，Rf值小。 【实验材料与仪器】 1．仪器 剪刀；镊子；托盘；培养皿；表面皿；毛细管；喷雾器；吹风机；水浴箱；电炉。 2．试剂 （1） pH 7.4 0.01 mol/l 磷酸缓冲液：取 0.2 mol/l 磷酸氢二钠溶液 81 ml 和 0.2 mol/l 磷酸二氢 钠溶液 19 ml 混匀，用蒸馏水稀释 20 倍。 （2） 0.2 mol/l 丙氨酸溶液：称取丙氨酸 0.891 g 先溶于少量 pH 7.4 10 mol/l 磷酸缓冲液中， 以 1 mol/l 氢氧化钠仔细调节至 pH 7.4 后，用磷酸缓冲液加至 100 ml。 （3） 0.1 mol/l α-酮戊二酸溶液：称取 α-酮戊二酸 1.461 g,先溶于少量的 pH 7.4 10 mol/l 磷酸 缓冲液中以 1 mol/l 氢氧化钠仔细调节至 PH 7.4 后，用磷酸缓冲液加至 100 ml。 （4） 0.1 mol/l 谷氨酸溶液：称取谷氨酸 0.735 g 先溶于少量的 pH 7.4 0.01 mol/l 磷酸缓冲液 中,以 1 mol/l 氢氧化钠仔细调节至 pH 7.4 后，用磷酸缓冲液加至 50 ml。 （5） 0.5 %茚三酮溶液：称取茚三酮 0.5 g 溶于 100 ml 丙酮中。 （6） 层析溶剂（酚的饱和水溶液）：将重蒸过的酚 2 份和水 1 份（按重量计算）混合后，放 入分液漏斗中，振荡，静止 24 小时后分层，将下部酚层放到瓶中备用。 【实验步骤】 1．肝匀浆制备：取新鲜的动物肝脏 0.5 g，在研钵中剪碎，研成匀浆，加入 9 倍体积（4.5 ml） Ph 7.4 0.01 mol/l 磷酸缓冲液。 2．转氨基反应：取干燥小试管（或离心管）二支，分别标明测定管与对照管，各加入肝匀浆 10 滴，测定管加入 37℃水浴保温 10 分钟，对照管放入沸水浴中煮 10 分钟，待对照管冷却后，于 两试管中分别加入 0.1 mol/l 丙氨酸 10 滴，0.1 mol/l α-酮戊二酸 10 滴，pH 7.4 0.01 mol/l 磷酸缓冲 液 1.5 ml，摇匀，放进 37℃水浴保温 30 分钟，保温完毕，立即将测定管放入沸水浴中煮沸 10 分 钟以终止反应，取出冷却后，过滤。取滤液备用。 3．层析：取直径 9 cm 圆形滤纸一张，用圆规作半径 1 cm 同心圆，通过圆心作两条相互垂直 的线（见图 2-2），在 1、3 两处分别点测定管和对照管上清液 1-2 滴。方法是用毛细管在纸上点样， 注意斑点不可太大（一般为直径 0.5 cm）而且每点一滴需干燥后方可在点第二滴，在 2、4 两处则 各加 0.1 mol/l 丙氨酸和 0.1 mol/l 谷氨酸 1 滴～2 滴
图1-2滤纸点样示意图 1.测定管上清液2.0.1molM丙氨酸3.对照管上清液4.0.1mol1谷氨酸 在滤纸圆心处打一小孔（如铅笔芯大小)另取同类型滤纸约1cm2,下半剪成须状，卷成圆筒， 如灯芯，插入小孔（勿使突出滤纸面）。 培养皿 滤纸 滤纸筒 层析液 图1-3纸层析装置示意图 将层析溶剂放入直径3cm~3cm的衣圃皿止甲，（衣皿以人且伦ycm的养皿正中）将滤纸 平放在培养皿上，灯芯浸入溶剂中，将另一同样大小培养皿反盖上（见图2-3），可见溶剂沿灯芯 上升到滤纸，在向四周扩散，约25分钟后，溶剂前缘距滤纸边缘约1c时即可取出，用吹风机 吹干或在60℃烘箱中烤干。 4.显色：将上述滤纸平放在培养皿上，用喷雾器喷上0.5%茚三酮之丙酮溶液，使滤纸全部 湿润再用吹风机或60℃烘箱干燥之，此时可见紫色斑出现，比较色斑的位置及色泽深浅，计算 值，分析是否发生了转氨基反应。 【注意事项】 1.层析液中含有腐蚀性酚，取用时注意安全，防止溅到皮肤及眼睛： 2.操作中接触滤纸前要洗手擦净，并尽量避免手与滤纸中间部位接触： 3.点样点不宜过大，直径小于0.5cm。 【思考题】 1.为什么对照管是一个色斑，而测定管是两个色斑？这些色斑分别代表什么物质？又是如何 证明的？ (冯涛) 实验三、血清醋酸纤维薄膜电泳 【实验目的】 1.学习醋酸纤维薄膜电泳的原理。 2.掌握血清醋酸纤维博膜电泳分离血清蛋白质的技术。 3.熟悉血清蛋白组分定量方法，并确定血清中清蛋白与球蛋白的比值。 【实验原理】 血清绝大多数蛋白质的等电点在pH5.0~7.0。在pH8.6的巴比妥缓冲液中，血清蛋白全部带负电 荷，在直流电场中向正极移动。移动的速度与带电蛋白质颗粒所带电荷成正比，与蛋白质颗粒的 大小成反比。如果样品点在醋酸纤维薄膜的同一条线上，电泳相同的时间，不同的蛋白质颗粒移 动的距离不同，通过染色，薄膜条上的血清的蛋白质被分离成不同的条带。将此薄膜条透明，可 以进行扫描，或将色带剪下，将颜色洗脱，进行比色都能获得各色带所含蛋白质占血清总蛋白的 百分比。 4
4 图 1-2 滤纸点样示意图 1. 测定管上清液 2. 0.1 mol/l 丙氨酸 3.对照管上清液 4. 0.1 mol/l 谷氨酸 在滤纸圆心处打一小孔（如铅笔芯大小）另取同类型滤纸约 1 cm2 ,下半剪成须状，卷成圆筒， 如灯芯，插入小孔（勿使突出滤纸面）。 将层析溶剂放入直径 3 cm～5 cm 的表面皿正中，（表面皿放入直径 9 cm 的养皿正中）将滤纸 平放在培养皿上，灯芯浸入溶剂中，将另一同样大小培养皿反盖上（见图 2-3），可见溶剂沿灯芯 上升到滤纸，在向四周扩散，约 25 分钟后，溶剂前缘距滤纸边缘约 1 cm 时即可取出，用吹风机 吹干或在 60℃烘箱中烤干。 4．显色：将上述滤纸平放在培养皿上，用喷雾器喷上 0.5 %茚三酮之丙酮溶液，使滤纸全部 湿润再用吹风机或 60℃烘箱干燥之，此时可见紫色斑出现，比较色斑的位置及色泽深浅，计算 Rf 值，分析是否发生了转氨基反应。 【注意事项】 1．层析液中含有腐蚀性酚，取用时注意安全，防止溅到皮肤及眼睛； 2．操作中接触滤纸前要洗手擦净，并尽量避免手与滤纸中间部位接触； 3．点样点不宜过大，直径小于 0.5 cm。 【思考题】 1．为什么对照管是一个色斑，而测定管是两个色斑？这些色斑分别代表什么物质？又是如何 证明的？ （冯涛） 实验三、血清醋酸纤维薄膜电泳 【实验目的】 1．学习醋酸纤维薄膜电泳的原理。 2．掌握血清醋酸纤维博膜电泳分离血清蛋白质的技术。 3．熟悉血清蛋白组分定量方法，并确定血清中清蛋白与球蛋白的比值。 【实验原理】 血清绝大多数蛋白质的等电点在pH5.0~7.0。在pH8.6的巴比妥缓冲液中，血清蛋白全部带负电 荷，在直流电场中向正极移动。移动的速度与带电蛋白质颗粒所带电荷成正比，与蛋白质颗粒的 大小成反比。如果样品点在醋酸纤维薄膜的同一条线上，电泳相同的时间，不同的蛋白质颗粒移 动的距离不同，通过染色，薄膜条上的血清的蛋白质被分离成不同的条带。将此薄膜条透明，可 以进行扫描，或将色带剪下，将颜色洗脱，进行比色都能获得各色带所含蛋白质占血清总蛋白的 百分比。 图 1-3 纸层析装置示意图
【实验材料与仪器】 1.仪器 电泳仪（电泳电源）、醋酸纤维薄膜电泳槽、721或722型分光光度计、光密度计。 2.材料 醋酸纤维薄膜、试管、滤纸、1℃m×5cm×5cm玻璃缸、镊子、血清。 3.试剂 (1)pH8.6的巴比妥缓冲液(pH8.6,离子强度0.07)：巴比妥2.76g,巴比妥纳15.45g,加水 至1000ml。 (2)0.5%氨基黑10B溶液：氨基黑10B0.25g,甲醇50ml,冰醋酸10ml,水40ml(可重复使 用)。 (3)漂洗液：含甲醇或乙醇45ml,冰醋酸5ml,水50ml。 (4)洗脱液：0.4mol/L NaOH。 (5)透明液：含无水乙醇7份，冰醋酸3份。 【实验步骤】 1.准备醋酸纤维薄膜的预处理：辨认薄膜的光滑面、粗糙面。将15×8cm的薄膜，裁减成2.5×8 c的薄膜条。并用铅笔在粗糙面离薄膜条一端1.5厘米处划线作标记，即为点样线。将薄膜条浸泡 在pH8.6的巴比妥缓冲液中，光滑面向上。让薄膜条被缓冲液饱和（需要时间约30min)。 Scm 酸纤锥素 粗糖面 点样线 十 光滑面 +1.5c1m 图1-4醋酸纤维薄膜 a平面图 b横切面图 2.上样将薄膜取出，用滤纸吸取过多的缓冲液。用2.5×2c的胶片，沾样品，样品在胶片 一端呈线状，宽1mm~2mm。将胶片沾有样品的一端压在薄膜条粗糙面的标记上。 3.电泳将点样后的薄膜条置于电泳槽，点样端置于负极，点样面（粗面）向下。平衡5分 钟。然后打开电源，调节电压至90~100V,电流0.4~0.6mA/厘米薄膜条宽。电泳时间：大约1小 时。 66 图1-5醋酸纤维薄膜电泳槽示意图 1.滤纸桥2.电泳槽缓冲液3.醋酸纤维素薄膜4.电泳槽膜支架5.电泳槽 4.染色电泳完毕，取出薄膜条，浸入含0.5%aminoblack10B染色液的染色盒中，染色时间： 5~10min。如有多条薄膜，应一条一条的浸入，避免重叠在一起浸入。 5.漂洗漂洗原则少量多次。将然色后的薄膜条放入盛有漂洗液(95%乙醇45ml,乙酸5ml, 蒸馏水50l)的漂洗盒，不停的摆动薄膜条。当漂洗液的颜色和薄膜条颜色深浅相近时，将用后 漂洗液倒入回收瓶，换新的漂洗液，反复漂洗，至背景无色为止。 6.结果血清蛋白通过醋酸纤维薄膜电泳，可被分成5条带。 7.定量有两种方法：洗脱定量法和扫描定量法。 (1)洗脱法定量取试管6支，编好号码，分别用吸管取0.4olL氢氧化钠4l。剪下薄膜上
5 【实验材料与仪器】 1．仪器 电泳仪（电泳电源）、醋酸纤维薄膜电泳槽、721或722型分光光度计、光密度计。 2．材料 醋酸纤维薄膜、试管、滤纸、1℃m×5cm×5cm玻璃缸、镊子、血清。 3．试剂 （1）pH8.6的巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.07）：巴比妥2.76 g，巴比妥纳15.45 g，加水 至1000 ml。 （2）0.5%氨基黑10B溶液：氨基黑10B 0.25 g，甲醇50 ml，冰醋酸10 ml，水40 ml（可重复使 用）。 （3）漂洗液：含甲醇或乙醇45 ml，冰醋酸5 ml，水50 ml。 （4）洗脱液：0.4 mol/L NaOH。 （5）透明液：含无水乙醇7份，冰醋酸3份。 【实验步骤】 1．准备 醋酸纤维薄膜的预处理：辨认薄膜的光滑面、粗糙面。将15×8cm的薄膜，裁减成2.5×8 cm的薄膜条。并用铅笔在粗糙面离薄膜条一端1.5厘米处划线作标记，即为点样线。将薄膜条浸泡 在pH8.6的巴比妥缓冲液中，光滑面向上。让薄膜条被缓冲液饱和（需要时间约30 min）。 图1-4 醋酸纤维薄膜 a 平面图 b 横切面图 2．上样 将薄膜取出，用滤纸吸取过多的缓冲液。用2.5×2cm的胶片，沾样品，样品在胶片 一端呈线状，宽1 mm～2 mm。将胶片沾有样品的一端压在薄膜条粗糙面的标记上。 3．电泳 将点样后的薄膜条置于电泳槽，点样端置于负极，点样面（粗面）向下。平衡5分 钟。然后打开电源，调节电压至90～100V，电流0.4～0.6mA/厘米薄膜条宽。电泳时间：大约1小 时。 图1-5 醋酸纤维薄膜电泳槽示意图 1. 滤纸桥 2. 电泳槽缓冲液 3. 醋酸纤维素薄膜 4. 电泳槽膜支架 5. 电泳槽 4．染色 电泳完毕，取出薄膜条，浸入含0.5% aminoblack 10B染色液的染色盒中，染色时间： 5～10min。如有多条薄膜，应一条一条的浸入，避免重叠在一起浸入。 5．漂洗 漂洗原则少量多次。将然色后的薄膜条放入盛有漂洗液（95%乙醇45 ml，乙酸5 ml， 蒸馏水50 ml）的漂洗盒，不停的摆动薄膜条。当漂洗液的颜色和薄膜条颜色深浅相近时，将用后 漂洗液倒入回收瓶，换新的漂洗液，反复漂洗，至背景无色为止。 6．结果 血清蛋白通过醋酸纤维薄膜电泳，可被分成5条带。 7．定量 有两种方法：洗脱定量法和扫描定量法。 （1）洗脱法定量 取试管6支，编好号码，分别用吸管取0.4 mol/L氢氧化钠4 ml。剪下薄膜上
各条蛋白色带，另于空白部位剪一平均大小的薄膜条作为空白。将各条分别浸于上述试管内，不 时摇动，使蓝色洗出。约0.5h后，用分光光度计进行比色，波长用650m,以空白薄膜条洗出液 调0，读取白蛋白A,1、2、B、y球蛋白各管的吸光度。 计算：吸光度总和：A总=A清+Aa1+A02+AB+Ay 血清蛋白组分的相对百分数： 清蛋白%=A清÷A总×100% 1球蛋白%=Aa1÷A总×100% 2球蛋白%=A2÷A总×100% B球蛋白%=A8÷A总×100% y球蛋白%=Ay÷A总×100% 清蛋白与球蛋白的比值=A清÷(Aa1+Aa2+A+A,) (2)扫描定量法薄膜条的透明，将染色后漂洗干净的薄膜用烘干，浸入透明液的甲液中， 浸泡2min,立即取出浸入透明液的乙液中，浸泡1min(要准确)，然后迅速取出薄膜，将它紧贴 在玻璃板上，排出薄膜与玻璃板之间的气泡。大约2~3min内的薄膜完全透明，放置10~l5min 后，晾干。用蒸馏水润湿玻璃板上透明的薄膜，用单面刀片撬起膜的一角，并划开一端，再用手 捏住撬起的膜，从玻璃板上轻轻撕下透明的薄膜。用滤纸吸干，浸入液体石腊中，约3mi后取出。 再用干净的滤纸吸干，压平，则成为色泽鲜艳而又透明的血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳图谱，可长 期保存不褪色。 (-) 点样线 02 球 BQ21清蛋白 球蛋白 图1-6血清蛋白腊酸纤维素电泳后染色的薄膜及扫描结果 将干燥的电泳染色后的血清蛋白醋酸纤维素薄膜图放入自动扫描光密度仪（或色谱扫描仪） 内，通过反射（使用未透明的薄膜时）或透射（用已透明的薄膜时）方式，在记录器上自动绘出 血清蛋白质各组分曲线图，横坐标为膜的长度，纵坐标为光密度（或光强度），每一个峰代表一种 蛋白质组分。然后，测量出各峰的面积，计算每个峰的面积与它们总面积的百分比就代表血清中 各种蛋白质组分的百分含量。或将曲线图上各峰沿曲线剪下，称量各峰的重量，计算每个峰的重 量与它们总重量的查分比也可以代表血清中各种蛋白质组分的百分含量。在使用具有电子计算机 附件的自动扫描光密度仪时，可以由显示部分或打字带上获得血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱 上每条区带所代表的蛋白质组分的含量。 b 图1-7某些疾病患者血清血清醋酸纤维薄膜电泳结果 a营养不良水肿患者：A32.9%:a13.1%:a225.0%:B13.3%:y25.8% b肾病患者血清：A12.1%:11.4%:0262.0%:B13.9%:Y10.8% 6
6 各条蛋白色带，另于空白部位剪一平均大小的薄膜条作为空白。将各条分别浸于上述试管内，不 时摇动，使蓝色洗出。约0.5 h后，用分光光度计进行比色，波长用650 nm，以空白薄膜条洗出液 调0，读取白蛋白A，α1、α2、β、γ球蛋白各管的吸光度。 计算：吸光度总和： A总=A清+Aα1+Aα2 +Aβ +Aγ 血清蛋白组分的相对百分数： 清蛋白 % = A清÷A总×100% α1球蛋白 % = Aα1÷A总×100% α2 球蛋白% = Aα2÷A总×100% β球蛋白 % = Aβ÷A总×100% γ球蛋白 % = Aγ÷A总×100% 清蛋白与球蛋白的比值＝A清÷（Aα1+Aα2 + Aβ+ Aγ） （2）扫描定量法 薄膜条的透明，将染色后漂洗干净的薄膜用烘干，浸入透明液的甲液中， 浸泡2 min，立即取出浸入透明液的乙液中，浸泡1 min（要准确），然后迅速取出薄膜，将它紧贴 在玻璃板上，排出薄膜与玻璃板之间的气泡。大约2～3 min内的薄膜完全透明，放置10～15 min 后，晾干。用蒸馏水润湿玻璃板上透明的薄膜，用单面刀片撬起膜的一角，并划开一端，再用手 捏住撬起的膜，从玻璃板上轻轻撕下透明的薄膜。用滤纸吸干，浸入液体石腊中，约3 min后取出。 再用干净的滤纸吸干，压平，则成为色泽鲜艳而又透明的血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳图谱，可长 期保存不褪色。 图1-6 血清蛋白醋酸纤维素电泳后染色的薄膜及扫描结果 将干燥的电泳染色后的血清蛋白醋酸纤维素薄膜图放入自动扫描光密度仪（或色谱扫描仪） 内，通过反射（使用未透明的薄膜时）或透射（用已透明的薄膜时）方式，在记录器上自动绘出 血清蛋白质各组分曲线图，横坐标为膜的长度，纵坐标为光密度（或光强度），每一个峰代表一种 蛋白质组分。然后，测量出各峰的面积，计算每个峰的面积与它们总面积的百分比就代表血清中 各种蛋白质组分的百分含量。或将曲线图上各峰沿曲线剪下，称量各峰的重量，计算每个峰的重 量与它们总重量的查分比也可以代表血清中各种蛋白质组分的百分含量。在使用具有电子计算机 附件的自动扫描光密度仪时，可以由显示部分或打字带上获得血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱 上每条区带所代表的蛋白质组分的含量。 γ β α2 α1 清蛋白 － ＋ － ＋ a b 图1-7 某些疾病患者血清血清醋酸纤维薄膜电泳结果 a 营养不良水肿患者：A 32.9%；α13.1%；α2 25.0%；β13.3%；γ25.8% b 肾病患者血清：A 12.1%；α1 1.4%；α2 62.0%；β13.9%；γ10.8%
【注意事项】 1.醋酸纤维素薄膜的预处理市售醋酸纤维素薄膜是醋酸纤维素制成干膜片，厚薄均匀的薄 膜适用于电泳。选择的方法是将干膜片漂浮于电极缓冲液表面15~30s,膜片无白色斑点或条纹， 提示膜片吸水均匀，表明膜片厚薄均匀一致，否则应弃去不用。使用厚薄不均的薄膜可造成电泳 后背景脱色困难，色区带扭曲，界线不清，结果难以重复。预处理是将醋酸纤维素薄膜漂浮于缓 冲液，让的薄膜吸满缓冲液后自然下沉，并在缓冲液中浸泡30，让膜片饱和缓冲液，恢复原 来的多孔网状结构，避免膜片上聚集的小气泡。点样时，用滤纸吸去膜片表面多余的缓冲液，以 免样品因薄膜上的缓冲液太多引起扩散。但也不能吸得太干，太干则薄膜的网孔萎缩，样品不易 进入其内，造成样品在点样线参差不齐，影响分离效果。应用镊子取膜，防止指纹污染。 2.缓冲液醋酸纤维素薄膜电泳用的是pH8.6,浓度为0.05~0.09mol/L的巴比妥缓冲液。缓 冲液浓度对样品泳动的速度有较大的影响：浓度过低，样品泳动速度快，染色后色带扩散变宽： 浓度过高，样品泳动速度慢，染色后色带过于集中，给分辨造成困难。 选择缓冲液浓度的方法是，预定下某一浓度的缓冲液，在正负极之间距离为8~10cm的电泳 槽中电泳，电压和电流如果能分别达到25V/cm膜长，0.4~0.5mA/cm膜宽，这表明缓冲液浓度比 较适当：如果电压、电流达不到或超过这个值时，则应增加缓冲液浓度或进行稀释。 3.点样点样好坏是获得理想的电泳图谱的重要环节之一。点样的量不宜过多，也不宜太少。 用于电泳的样品量过大，电泳后染色较费时，色带分离不清楚，甚至互相干扰：过少色带颜色过 浅，难于定量。上样的量与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。一般， 上样胶片下端沾有线状、2mm左右宽、均匀的样品液即可。平稳地、轻轻地压在薄膜的点样线上。 避免将薄膜压破或压出凹陷影响电泳结果。 4.电压与电流电泳时电压为10~12V/cm膜长、电流强度一般为0.4~0.5mA/cm宽膜为宜。 电泳时电流强度大，则产生热量大，尤其在夏秋季能引起蛋白变性、水分蒸发，使缓冲液浓度增 加，膜片干涸等。电流过小，样品泳动速度慢，容易扩散。 5.染色液电泳后应根据样品性质选择染料。血清蛋白通常选氨基黑10B,脂蛋白宜选择嗜 脂质染料、糖蛋白宜嗜糖染料。染料应该与待分离的样品有较强亲和力，背景易脱色：水溶性染 料为宜，醇溶性染料易引起醋酸纤维素薄膜溶解。 应控制染色时间。氨基黑10B染色5mi为宜，时间长，空白薄膜不易褪色；时间太短，条带 着色浅，不易区分。对于条带着色浅时，可进行复染。 6.透明及保存透明液最好选用分析纯试剂配制，含乙酸和乙醇。乙酸和乙醇均易挥发，故 透明液应临用前配制，以免影响透明效果。用于透明的薄膜应完全干燥。透明液处理薄膜的时间 应适当，浸泡时间太长则薄膜溶解，太短则透明度不佳。 干燥透明后的薄膜，浸入液体石蜡中，使薄膜软化。如薄膜没有完全干燥，含有水分，则液 体石蜡不易浸入，薄膜不易展平。 【思考题】 1.简述醋酸纤维素薄膜电泳原理。 2.以血清为样品，和滤纸比较，用醋酸纤维薄膜电泳有什么优点？ (曾昭淳) 实验四、血清丙氨酸氨基转移酶活性测定 【实验目的】 1.掌握血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的原理及方法。 2.熟悉血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的临床意义。 【实验原理】 7
7 【注意事项】 1．醋酸纤维素薄膜的预处理 市售醋酸纤维素薄膜是醋酸纤维素制成干膜片，厚薄均匀的薄 膜适用于电泳。选择的方法是将干膜片漂浮于电极缓冲液表面15～30 s，膜片无白色斑点或条纹， 提示膜片吸水均匀，表明膜片厚薄均匀一致，否则应弃去不用。使用厚薄不均的薄膜可造成电泳 后背景脱色困难，色区带扭曲，界线不清，结果难以重复。预处理是将醋酸纤维素薄膜漂浮于缓 冲液，让的薄膜吸满缓冲液后自然下沉，并在缓冲液中浸泡30 min，让膜片饱和缓冲液，恢复原 来的多孔网状结构，避免膜片上聚集的小气泡。点样时，用滤纸吸去膜片表面多余的缓冲液，以 免样品因薄膜上的缓冲液太多引起扩散。但也不能吸得太干，太干则薄膜的网孔萎缩，样品不易 进入其内，造成样品在点样线参差不齐，影响分离效果。应用镊子取膜，防止指纹污染。 2．缓冲液 醋酸纤维素薄膜电泳用的是pH8.6，浓度为0.05～0.09 mol/L的巴比妥缓冲液。缓 冲液浓度对样品泳动的速度有较大的影响：浓度过低，样品泳动速度快，染色后色带扩散变宽； 浓度过高，样品泳动速度慢，染色后色带过于集中，给分辨造成困难。 选择缓冲液浓度的方法是，预定下某一浓度的缓冲液，在正负极之间距离为8～10 cm的电泳 槽中电泳，电压和电流如果能分别达到25 V/cm膜长，0.4～0.5 mA/cm膜宽，这表明缓冲液浓度比 较适当；如果电压、电流达不到或超过这个值时，则应增加缓冲液浓度或进行稀释。 3．点样 点样好坏是获得理想的电泳图谱的重要环节之一。点样的量不宜过多，也不宜太少。 用于电泳的样品量过大，电泳后染色较费时，色带分离不清楚，甚至互相干扰；过少色带颜色过 浅，难于定量。上样的量与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。一般， 上样胶片下端沾有线状、2 mm左右宽、均匀的样品液即可。平稳地、轻轻地压在薄膜的点样线上。 避免将薄膜压破或压出凹陷影响电泳结果。 4．电压与电流 电泳时电压为10～12 V/cm膜长、电流强度一般为0.4～0.5 mA/cm宽膜为宜。 电泳时电流强度大，则产生热量大，尤其在夏秋季能引起蛋白变性、水分蒸发，使缓冲液浓度增 加，膜片干涸等。电流过小，样品泳动速度慢，容易扩散。 5．染色液 电泳后应根据样品性质选择染料。血清蛋白通常选氨基黑10B，脂蛋白宜选择嗜 脂质染料、糖蛋白宜嗜糖染料。染料应该与待分离的样品有较强亲和力，背景易脱色；水溶性染 料为宜，醇溶性染料易引起醋酸纤维素薄膜溶解。 应控制染色时间。氨基黑10B染色5 min为宜，时间长，空白薄膜不易褪色；时间太短，条带 着色浅，不易区分。对于条带着色浅时，可进行复染。 6．透明及保存 透明液最好选用分析纯试剂配制，含乙酸和乙醇。乙酸和乙醇均易挥发，故 透明液应临用前配制，以免影响透明效果。用于透明的薄膜应完全干燥。透明液处理薄膜的时间 应适当，浸泡时间太长则薄膜溶解，太短则透明度不佳。 干燥透明后的薄膜，浸入液体石蜡中，使薄膜软化。如薄膜没有完全干燥，含有水分，则液 体石蜡不易浸入，薄膜不易展平。 【思考题】 1．简述醋酸纤维素薄膜电泳原理。 2．以血清为样品，和滤纸比较，用醋酸纤维薄膜电泳有什么优点？ （曾昭淳） 实验四、血清丙氨酸氨基转移酶活性测定 【实验目的】 1．掌握血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的原理及方法。 2．熟悉血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的临床意义。 【实验原理】
转氨基作用是指-氨基酸的氨基转移到α-酮酸的酮基上，使原来的a-酮酸生成相应的-氨基 酸，而原来的-氨基酸则转变为-酮酸。这是可逆反应，实际反应方向取决于反应体系中4种反 应物质的相对浓度。转氨基作用是氨基酸脱氨的重要方式，也是体内非必需氨基酸合成的重要途 径。催化转氨基反应的酶称为转氨酶，其辅酶为磷酸吡哆醛。转氨酶种类很多，其中与医学关系 密切的转氨酶有丙氨酸氨基转移酶(ALT,又称谷丙转氨酶GPT)和谷氨酸氨基转移酶(AST, 又称谷草转氨酶GOT)。 ALT广泛存在于机体心、脑、肝、肾、横纹肌等各组织中，但含量不等。肝细胞中此酶活性 极高，心肌细胞中此酶活性也很高。正常人血清中此酶活性很低。在肝脏疾病（尤其是急性病毒 性肝炎、急性肝细胞坏死等)或心肌梗死时，细胞膜通透性增高或细胞破坏，ALT酶释放入血， 导致血中ALT活性显著升高。此外，在阻塞性黄疸、胆道炎症、多发性肌炎时血清ALT活性也会 有所增高。因此测定血清ALT活性对于某些疾病的诊断具有重要的参考价值。 本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，在一定温度和时间内经血清中ALT催化，生成丙酮酸 和谷氨酸。丙酮酸可以与2,4二硝基苯肼作用，生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙，后者在碱性条件 下呈棕红色，其颜色的深浅与丙酮酸的量呈正比。反应体系中，丙酮酸的量与血清ALT活性高低 有关。因此利用分光光度法，与同样条件下丙酮酸标准液的结果进行比较，可测定出样品血清中 ALT活性。反应式如下： COOH COOH CH3 CH2 CH3 CH2 ALT HC-NH2 CH2 C二0 + CH2 C二0 HC-NH2 COOH COOH COOH COOH 丙氨酸 α酮戊二酸 丙酮酸 谷氨酸 CH3 NO2 CH3 NO2 C二0 +H2N一N NO2 NO2 H20 COOH COOH 丙酮酸 2,4-二硝基苯肼 丙酮酸2,4-二硝基苯腙 图1-8丙氨酸氨基转移酶活性测定反应原理 【实验材料与仪器】 1.器材： 新鲜的血清、试管及试管架、吸量管或移液器、恒温水浴箱、分光光度计、坐标纸。 2.试剂： (1)0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.4):称取Na2HP0,·2H202.8844g(或Na2P0,·12H05.8028 g)、称取NaH2P0,·H200.5244g(或NaH2P0,·2Hz00.5930g)溶解于蒸馏水中，定容至200ml。 此混合液pH值应为7.4。 (2)2mmo1/L丙酮酸标准液：精确称取丙酮酸钠22mg,溶于0.1mo1/L磷酸缓冲液(pH7.4), 定容至100m1。丙酮酸钠不稳定，其纯度对于标准曲线有明显影响。如果丙酮酸钠颜色变黄或潮 解，则不可用。此溶液应临用前新鲜配制，不能存放。 (3)丙氨酸氨基转移酶底物液：称取a-DL-丙氨酸1.782g(或L-丙氨酸0.891g,相当于 200μmo1/L)和a-酮戊二酸29.2mg(相当于2μmo1/L),溶解于50ml0.1mo1L磷酸缓冲 8
8 转氨基作用是指 α-氨基酸的氨基转移到 α-酮酸的酮基上，使原来的 α-酮酸生成相应的 α-氨基 酸，而原来的 α-氨基酸则转变为 α-酮酸。这是可逆反应，实际反应方向取决于反应体系中 4 种反 应物质的相对浓度。转氨基作用是氨基酸脱氨的重要方式，也是体内非必需氨基酸合成的重要途 径。催化转氨基反应的酶称为转氨酶，其辅酶为磷酸吡哆醛。转氨酶种类很多，其中与医学关系 密切的转氨酶有丙氨酸氨基转移酶（ALT，又称谷丙转氨酶 GPT）和谷氨酸氨基转移酶（AST， 又称谷草转氨酶 GOT）。 ALT 广泛存在于机体心、脑、肝、肾、横纹肌等各组织中，但含量不等。肝细胞中此酶活性 极高，心肌细胞中此酶活性也很高。正常人血清中此酶活性很低。在肝脏疾病（尤其是急性病毒 性肝炎、急性肝细胞坏死等）或心肌梗死时，细胞膜通透性增高或细胞破坏，ALT 酶释放入血， 导致血中 ALT 活性显著升高。此外，在阻塞性黄疸、胆道炎症、多发性肌炎时血清 ALT 活性也会 有所增高。因此测定血清 ALT 活性对于某些疾病的诊断具有重要的参考价值。 本实验以丙氨酸和 α-酮戊二酸为底物，在一定温度和时间内经血清中 ALT 催化，生成丙酮酸 和谷氨酸。丙酮酸可以与 2，4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸 2，4-二硝基苯腙，后者在碱性条件 下呈棕红色，其颜色的深浅与丙酮酸的量呈正比。反应体系中，丙酮酸的量与血清 ALT 活性高低 有关。因此利用分光光度法，与同样条件下丙酮酸标准液的结果进行比较，可测定出样品血清中 ALT 活性。反应式如下： 【实验材料与仪器】 1．器材： 新鲜的血清、试管及试管架、吸量管或移液器、恒温水浴箱、分光光度计、坐标纸。 2．试剂： （1）0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH7.4）：称取 Na2HPO4·2H2O 2.8844 g（或 Na2HPO4·12H2O 5.8028 g）、称取 NaH2PO4·H2O 0.5244 g（或 NaH2PO4·2H2O 0.5930 g）溶解于蒸馏水中，定容至 200 ml。 此混合液 pH 值应为 7.4。 （2）2 mmol/L 丙酮酸标准液：精确称取丙酮酸钠 22 mg，溶于 0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH7.4）， 定容至 100 ml。丙酮酸钠不稳定，其纯度对于标准曲线有明显影响。如果丙酮酸钠颜色变黄或潮 解，则不可用。此溶液应临用前新鲜配制，不能存放。 （3）丙氨酸氨基转移酶底物液：称取 α-DL-丙氨酸 1.782 g（或 L-丙氨酸 0.891 g，相当于 200μ mol/L）和 α-酮戊二酸 29.2 mg（相当于 2 μmol/L），溶解于 50 ml 0.1 mol/L 磷酸缓冲 图 1-8 丙氨酸氨基转移酶活性测定反应原理