实验二雅致放射毛霉产蛋白酶培养基本的确定 1、种子培养基（实验老师准备4个100ml种子） 培养基组成： 100ml:豆柏粉3g,饴糖0.5g,酵母音0.lg,Mgs0,0.2g,KP0,02g 高压 灭菌锅，121℃，20min灭菌。灭菌操作完毕，将上述物品并洗耳球转入超净台 接种前20min进行紫外空气灭菌。 接种前4小时从冰箱取出1支菌种，在25℃条件下活化。在超净台内，以无菌生理盐 水洗涤菌种斜面。孢子悬浮液以每瓶10m1的接种量，接入种子培养基。从超净台取出接好 2、产酶培养基确定（学生确定，每组做三瓶，250m1三角瓶中装100ml培养基） 2.1培养基的配制，每班分六组，各组分别选择以下六种培养基配方： 1)基础培养基：(100ml)豆粕粉3g,蔗糖0.8g,酵母音0.1g,Mgs0,0.36g,KH,P0 0.12g,CaC20.1g。(第- (2)第二组，将基础培养基中蔗糖按成等例葡萄糖： (3)第三组，将基础培养基中蔗糖按成等例马铃薯淀粉： (4)第四组，将基础培养基中去掉酵母膏： (5)第五组，将基础培养基中去掉豆粕粉，并将酵母膏添加量增至0.5%。 6)第六组，将基础培养基中去掉MgSO,和CaCl,。 2.2培养基灭菌 高压灭菌锅，121℃，20min灭菌。冷却至室温，将上述物品并洗耳球转入超净台，接 种前20min进行紫外空气灭菌。 2.3接种 冷却到室温开始接种，接种量10%，然后在在28℃、250rpm的条件下培养18小时 至发醇液颜色变深、澄清为止 2.4蛋白爵活力测定 根据各组测定酶活结果，比较确定最适培养基组成。 (1)定义：1g固体酶粉，在一定温度和pH值条件下，1mn水解酪素产生1g酪氨酸为 一个酶活单位，以g表示 (2)原理：蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止醇反 应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸 光度计算其酶活力。 (3)试剂和溶液 ①三氯乙酸c(CCl.C00H)=0.4molL:称取三氯乙酸32.7g,用水溶解并定容至500mL ②磷酸缓冲溶液(pH=7.5)适用于中性蛋白酶：称取磷酸氢二纳(NHPO:12H0)3.01g 和磷酸二氢纳(NaHzPO42H0)0.25g,加水溶解并定容至500mL。 ③100 ug/mLL-一酪氨酸标准溶液：
1 实验二 雅致放射毛霉产蛋白酶培养基本的确定 1、种子培养基（实验老师准备 4 个 100ml 种子） 培养基组成： 100ml：豆粕粉 3g， 饴糖 0.5g，酵母膏 0.1g，MgSO40.2g，KH2PO40.2g。 高压灭菌锅，121℃，20min 灭菌。灭菌操作完毕，将上述物品并洗耳球转入超净台， 接种前 20min 进行紫外空气灭菌。 接种前 4 小时从冰箱取出 1 支菌种，在 25℃条件下活化。在超净台内，以无菌生理盐 水洗涤菌种斜面。孢子悬浮液以每瓶 10ml 的接种量，接入种子培养基。从超净台取出接好 的种子三角瓶，转入摇床，在 28℃、250rpm 的条件下培养 14～16 小时，至种子瓶内呈粘稠 浆糊状为止。 2、产酶培养基确定（学生确定，每组做三瓶，250ml 三角瓶中装 100ml 培养基） 2.1 培养基的配制，每班分六组，各组分别选择以下六种培养基配方： （1）基础培养基：（100ml）豆粕粉 3g，蔗糖 0.8g，酵母膏 0.1g，MgSO4 0.36g，KH2PO4 0.12g，CaCl2 0.1g。（第一组） （2）第二组，将基础培养基中蔗糖按成等例葡萄糖； （3）第三组，将基础培养基中蔗糖按成等例马铃薯淀粉； （4）第四组，将基础培养基中去掉酵母膏； （5）第五组，将基础培养基中去掉豆粕粉，并将酵母膏添加量增至 0.5％。 （6）第六组，将基础培养基中去掉 MgSO4 和 CaCl2。 2.2 培养基灭菌 高压灭菌锅，121℃，20min 灭菌。冷却至室温，将上述物品并洗耳球转入超净台，接 种前 20min 进行紫外空气灭菌。 2.3 接种 冷却到室温开始接种，接种量 10％，然后在在 28℃、250rpm 的条件下培养 18 小时， 至发酵液颜色变深、澄清为止。 2.4 蛋白酶活力测定 根据各组测定酶活结果，比较确定最适培养基组成。 （1）定义：1 g 固体酶粉，在一定温度和 pH 值条件下，1 min 水解酪素产生 1 ug 酪氨酸为 一个酶活单位，以 u/g 表示。 （2）原理：蛋白酶在一定温度与 pH 条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反 应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸 光度计算其酶活力。 （3）试剂和溶液 ① 三氯乙酸 c（CCl3.COOH）=0.4 mol/L：称取三氯乙酸 32.7 g，用水溶解并定容至 500 mL ② 磷酸缓冲溶液（pH=7.5）适用于中性蛋白酶：称取磷酸氢二纳（Na2HPO4·12H2O）3.01 g 和磷酸二氢纳（NaH2PO4·2H2O）0.25 g，加水溶解并定容至 500 mL。 ③ 100 ug/mL L—酪氨酸标准溶液：
a称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.100g,精确至0.001g,用1molL盐酸 60mL溶解后定容至100mL,即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。 b.吸取1mgmL酪氨酸标准溶液10.00mL,用0.1mol/L盐酸定容至100mL,即得到 100ug/mLL一酪氨酸标准溶液。 ④10g/L酪素溶液：称取酪素1.000g,精确至0.001g,用少量0.5mol/L氢氧化钠湿润后， 加入适量的缓冲溶液约80L,在沸水域中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转 入100mL容量瓶中，用缓冲溶液稀释至刻度。 ⑤待测酶液：1ml发酵液稀释5倍。(1个试管) (4)分析步骤 ①求K值 (K取135) ②测定 a.先将酪素溶液放入(40士0.2)摄氏度恒温水域中，预热5min: b.按下列程序操作： 试管A(空白) (第二试管) 试管B(酶试样，作三个平行样) (第三试管) 加酶液2.00mL (移液管2ml) 加酶液2.00mL ↓(40±0.2℃)，2min ↓(40±0.2℃)，2min 加三氯乙酸4.00mL(摇匀)（移液管5ml) 加酪素2.00mL(摇匀) ↓(40±0.2℃)，10min ↓(40±0.2℃)，10min 加酪素2.00mL(摇匀)（移液管2ml) 加三氯乙酸4.00mL(摇匀) ↓ 取出静止10min,过滤（第四试管，小漏斗） 取出静止10min,过滤 在275nm波长下，用10mm 在275nm波长下，用10mm 比色皿测其吸光度 比色皿测其吸光度 (5)计算(=135) X=A×K×8/2×1/10×n×E=2/5×A×K×n×E 式中X一样品的酶活力(ug) A一试样溶液的平均吸光度 K一吸光常数(K=135) 8一反应试剂的总体积(mL) 2吸取酶液2.00mL,以1mL计 1/10一反应时间10min,以1min 计 n—稀释倍数 E一紫外法与福林法的换算系数（取0.50）
2 a.称取预先于 105 ℃干燥至恒重的 L-酪氨酸 0.100 g，精确至 0.001 g，用 1 mol/L 盐酸 60 mL 溶解后定容至 100 mL，即为 1 mg/mL 酪氨酸标准溶液。 b.吸取 1 mg/mL 酪氨酸标准溶液 10.00 mL，用 0.1 mol/L 盐酸定容至 100 mL，即得到 100 ug/mL L—酪氨酸标准溶液。 ④ 10 g/L 酪素溶液：称取酪素 1.000 g，精确至 0.001 g，用少量 0.5 mol/L 氢氧化钠湿润后， 加入适量的缓冲溶液约 80 mL，在沸水域中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转 入 100 mL 容量瓶中，用缓冲溶液稀释至刻度。 ⑤ 待测酶液：1ml 发酵液稀释 5 倍。（1 个试管） （4）分析步骤 ① 求 K 值 （K 取 135） ② 测定 a. 先将酪素溶液放入（40±0.2）摄氏度恒温水域中，预热 5 min； b. 按下列程序操作： 试管 A（空白） （第二试管） 试管 B（酶试样，作三个平行样） （第三试管） ↓ ↓ 加酶液 2.00 mL （移液管 2ml） 加酶液 2.00 mL ↓（40±0.2℃），2 min ↓（40±0.2℃），2 min 加三氯乙酸 4.00 mL（摇匀）（移液管 5ml） 加酪素 2.00 mL（摇匀） ↓（40±0.2℃），10 min ↓（40±0.2℃），10 min 加酪素 2.00 mL（摇匀）（移液管 2ml） 加三氯乙酸 4.00 mL（摇匀） ↓ ↓ 取出静止 10 min，过滤 （第四试管，小漏斗） 取出静止 10 min，过滤 ↓ ↓ 在 275 nm 波长下，用 10 mm 在 275 nm 波长下，用 10 mm 比色皿测其吸光度 比色皿测其吸光度 （5）计算（=135） X=A×K×8/2×1/10×n×E=2/5×A×K×n×E 式中 X——样品的酶活力（u/g） A——试样溶液的平均吸光度 K——吸光常数（K=135） 8——反应试剂的总体积（mL） 2——吸取酶液 2.00 mL，以 1 mL 计 1/10——反应时间 10 min，以 1 min 计 n——稀释倍数 E——紫外法与福林法的换算系数（取 0.50）