聚合酶链反应及基因突变检测方法
聚合酶链反应 及基因突变检测方法
聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司白K.Mullis建立，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖为生命科学领域的研究开创了渐新时代
◼ 聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的 K.Mullis建立，并和定点突变的发明者 M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖， 为生命科学领域的研究开创了崭新时代
PCR反应的特点特异性强引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性灵敏度高指数增长，从pg(10-12)可扩增至μg(10-)水平简便、快速2~4小时完成扩增对标本的纯度要求低DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板
PCR反应的特点 ◼ 特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 ◼ 灵敏度高 指数增长，从pg (10-12)可扩增至 mg (10-6 )水平 ◼ 简便、快速 2～4 小时完成扩增 ◼ 对标本的纯度要求低 DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板
一、PCR反应原理和反应过程DNA的体外复制包括3个步骤：变性（denaturation):94°C~95°C退火（annealing）:40°C ～70°C延伸(extension）:72C3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长
一、PCR反应原理和反应过程 DNA的体外复制包括3个步骤： ◼ 变性（denaturation）:94 C ~95 C ◼ 退火（annealing）:40 C ~70 C ◼ 延伸（extension）:72 C 3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一 个循环，一个分子的模板被复制为二个， 产物量以指数形式增长
PCR原理d-NTPS引物添加反应混合液耐热DNA聚合酶及样本加入试管中变性退火
PCR原理 5’ 5’ 3’ 3’ d .NTPs 耐热DNA聚合酶 引物 添加反应混合液 及样本 变性 退火 加入试管中
PCR原理延伸TaqTaq继续延伸TaqTaq循环
延伸 5’ 3’ 3’ 5’ 继续延伸 5’ 3’ 3’ 5’ Taq Taq 3’ 3’ 5’ Taq Taq 循环 PCR原理
PCR原理第二个循环4个拷贝第三个循环8个拷贝第n个循环2n个拷贝
3’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 第二个循环 4个拷贝 第三个循环 8个拷贝 3’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 第n个循环 2n个拷贝 PCR原理
The Polymerase Chain Reaction (PCR)40-60°C72°℃(30 s)(30-60 s/kb)94°C(30 s)ExtendAnnealMelt20-30X18
94 C (30 s) 40-60 C (30 s) 72 C (30-60 s/kb) Melt Anneal Extend The Polymerase Chain Reaction (PCR) 18 20-30X
Cycle #240-60°C72°℃C(30 s)(30-60 s/kb)94°℃C(30 s)ExtendAnnealMelt20-30XNIH
94 C (30 s) 40-60 C (30 s) 72 C (30-60 s/kb) Melt Anneal Extend Cycle #2 NIH 20-30X
30n1 copydNTPSCycle1Taq polCycle2toCycle38020 more cycles2097.152 copies一copyright M.W.King 1996