实验9玉米种子纯度测定（电泳法）吴承来13505384193CLWU@SDAU. EDU. CN
实验9 玉米种子纯度测定 （电泳法） 吴承来 13505384193 CLWU@SDAU.EDU.CN
一、实验目的练习玉米杂交种种子纯度的蛋白质电泳法的测定技术。二、材料与仪器1.玉米杂交种：鲁单981、农大1082.仪器：电泳仪（稳压0-500V、稳流0-400mA）、垂直板夹心式电泳槽、单籽粒粉碎器、天平、酸度计、移液管、烧杯、容量瓶）、试剂瓶、离心机、离心管（1.5mL）、离心管架、冰箱、微量移液器、磁力搅拌器、注射器、观片灯箱、油灰刀、染色盘、玻璃棒、研钵、滴管、毛刷等。3.试剂：（略）
一、实验目的 练习玉米杂交种种子纯度的蛋白质电泳法的测定技术。 二、材料与仪器 1.玉米杂交种：鲁单981、农大108 2.仪器： 电泳仪（稳压0-500 V、稳流0-400mA）、垂直板夹心式电泳槽、 单籽粒粉碎器、天平、酸度计、移液管、烧杯、容量瓶）、试剂 瓶、离心机、离心管（1.5mL）、离心管架、冰箱、微量移液器、 磁力搅拌器、注射器、观片灯箱、油灰刀、染色盘、玻璃棒、研 钵、滴管、毛刷等。 3.试剂：（略）
三、方法步骤（DB37/T273-1999）1.溶液配制（1）样品提取液：称取18g尿素，加水溶解后加12mL冰乙酸、4mL四甲基乙二胺，加水定容至100mL。转入试剂瓶并加入0.05g甲基绿，4℃贮存备用。（2）凝胶溶液：称取50g丙烯酰胺、50g尿素、1.0gN,N一亚甲基双丙烯酰胺，加水溶解，加15mL冰乙酸，再加0.10g硫酸亚铁，加水定容至500mL，4℃贮存备用。（3）催化剂溶液：称取1.75g过硫酸铵，加水溶解并定容至50mL，4℃可短期贮存。（4）电极缓冲液：量取15mL冰乙酸，加水定容至1000mL。（5）染色液（现用现配）：称取0.4g考马斯亮蓝R-250，用25mL无水乙醇溶解，倒入染色盘，加50-60g三氯乙酸，加水500mL，搅匀
1．溶液配制 （1）样品提取液：称取18g尿素，加水溶解后加12mL冰乙酸、4mL四 甲基乙二胺，加水定容至100mL。转入试剂瓶并加入0.05g甲基绿，4℃ 贮存备用。 （2）凝胶溶液：称取50g丙烯酰胺、50g尿素、1.0g N,N'—亚甲基双 丙烯酰胺，加水溶解，加15mL冰乙酸，再加0.10g硫酸亚铁，加水定容 至500mL，4℃贮存备用。 （3）催化剂溶液：称取1.75g过硫酸铵，加水溶解并定容至50mL， 4℃可短期贮存。 （4）电极缓冲液：量取15mL冰乙酸，加水定容至1000mL。 （5）染色液（现用现配）：称取0.4g考马斯亮蓝R-250，用25mL无 水乙醇溶解，倒入染色盘 ，加50-60g三氯乙酸，加水500mL，搅匀。 （ DB37/T273-1999） 三、方法步骤
2.操作步骤：一般包括：样品的提取、凝胶的制备、上样电泳、染色观察等步骤（1）蛋白质提取从送验样品随机数取100粒×2，用单粒粉碎器粉碎，置1.5mL离心管中，用滴管按样品体积的1.5-2倍加样品提取液混匀提取30min后离心（8000r/min）4min，取上清备用。（2）凝胶制备取预先洗净晾干的玻璃板装入橡胶框，固定在电泳槽内。取10mL左右凝胶溶液于烧杯中，加1滴催化剂溶液，迅速搅匀沿高玻璃板外侧倒入底部，迅速轻轻振动电泳槽2次并放平，5min左右凝胶聚合。取30mL左右凝胶溶液于烧杯中，加2滴催化剂溶液，迅速搅匀，将凝胶溶液倒满两玻璃板之间，迅速插入样品梳，2-3min聚合后将样品梳拔出，用注射器吸净样品槽中的水分
2.操作步骤: 一般包括：样品的提取、凝胶的制备、上样电泳、染色观察等步骤 （1）蛋白质提取 从送验样品随机数取100粒×2,用单粒粉碎器粉碎，置 1.5mL离心管中，用滴管按样品体积的1.5-2倍加样品提取液， 混匀提取30min后离心（8000r/min）4min，取上清备用。 （2）凝胶制备 取预先洗净晾干的玻璃板装入橡胶框，固定在电泳槽内。 取10mL左右凝胶溶液于烧杯中，加1滴催化剂溶液，迅速搅匀 沿高玻璃板外侧倒入底部，迅速轻轻振动电泳槽2次并放平， 5min左右凝胶聚合。 取30mL左右凝胶溶液于烧杯中，加2滴催化剂溶液，迅速 搅匀，将凝胶溶液倒满两玻璃板之间，迅速插入样品梳，2- 3min聚合后将样品梳拔出，用注射器吸净样品槽中的水分
（3）点样用微量移液器取离心后的样品上清液30～40uL加入样品槽，每加1个样，用去离子水清洗移液器2次。（4）电泳加样完毕，加入电极缓冲液，上槽电极缓冲液面要没过矮玻璃板，下槽电极缓冲液面要高于铂金丝。将电源线正极接上槽，负极接下槽。接通电源，85mA稳流电泳，待甲基绿下移至胶底部边缘时，停止电泳。（5）卸板、染色倒出电极液，卸电泳槽并用油灰刀取出胶片，置染色液12h左右
（3）点样 用微量移液器取离心后的样品上清液30～40μL加入样品槽，每加1 个样，用去离子水清洗移液器2次。 （4）电泳 加样完毕，加入电极缓冲液，上槽电极缓冲液面要没过矮玻璃板， 下槽电极缓冲液面要高于铂金丝。将电源线正极接上槽，负极接下槽。 接通电源，85mA稳流电泳，待甲基绿下移至胶底部边缘时，停止电泳。 （5）卸板、染色 倒出电极液，卸电泳槽并用油灰刀取出胶片，置染色液12h左右
（6）观察取出胶片冲洗干净，在观片灯上观察蛋白质谱带，鉴定各泳道谱带的特征和一致性。(7) 乡结果计算根据电泳谱带的特征和一致性，计数供检样品粒数和非本品种粒数，计算电泳测定纯度值。108母本父本杂交种母本自交
（6）观察 取出胶片冲洗干净，在观片灯上观察蛋白质谱带，鉴定各泳 道谱带的特征和一致性。 （7）结果计算 根据电泳谱带的特征和一致性，计数供检样品粒数和非本品 种粒数，计算电泳测定纯度值。 母本 父本 杂交种 母本自交 108