生物工程设备课程实验指导 前言 生物化工专业《综合性大型实验》是针对本专业四年级学生开设的一门独立设课的必修 实验课,是专业实践性教学中重要一环。 有以往各课程实验基础上,大型实验课将使学生获得科学实验的强化训练。受到多方面 更加深入、较为完整的运用所学知识,进行实践和提高动手能力的综合性锻炼。使学生不仅 有较扎实的理论知识,又有较强的分析问题和解决问题的实践能力,以适应国家对培养社会 主义现代化建设人才的需要 大型实验课在内容上,把生物化学、微生物学、生物化工的专业理论与实践有机地、紧 密地结合起来,成为对高年级学生进行较为全面、系统的综合训练的实验课 要求参加实验的学生,在教师的正确指导下,经过预习准备,按实验要求,自己独立拟 订实验实施方案,运用实验室条件进行操作,并写出具有一定水平的实验报告,使学生获得 一次类似做科研论文的训练 大型实验课侧重于提高学生的实践能力,引导学生把所学知识和实验内容紧密地结合起 来.并用理论指导实践,解决实验中的问题 学生实验成绩评定,由实验操作技能、实验态度、实验报告与实验中分析问题和解决问 题诸方面综合考核确定。其中实验态度与实验操作能力占50%,实验报告质量与回答问题水 平占50% 第一部分高核糖核酸含量酵母的筛选及发酵试验 (一)高核糖核酸含量的酵母的筛选 简介 核糖核酸是医药工业和食品工业调味剂的重要原科,关于微生物菌体内RNA的含量。 般细菌为0.3~5.1%,酵母为2.7~11%,霉菌为0.7~2.8%。工业上生产核糖核酸主要 由酵母提取制备。核糖核酸得率取决于酵母中核糖核酸的含量,因此提高酵母核糖核酸含量
生物工程设备课程实验指导 前言 生物化工专业《综合性大型实验》是针对本专业四年级学生开设的一门独立设课的必修 实验课，是专业实践性教学中重要一环。 有以往各课程实验基础上，大型实验课将使学生获得科学实验的强化训练。受到多方面 更加深入、较为完整的运用所学知识，进行实践和提高动手能力的综合性锻炼。使学生不仅 有较扎实的理论知识，又有较强的分析问题和解决问题的实践能力，以适应国家对培养社会 主义现代化建设人才的需要。 大型实验课在内容上，把生物化学、微生物学、生物化工的专业理论与实践有机地、紧 密地结合起来，成为对高年级学生进行较为全面、系统的综合训练的实验课。 要求参加实验的学生，在教师的正确指导下，经过预习准备，按实验要求，自己独立拟 订实验实施方案，运用实验室条件进行操作，并写出具有一定水平的实验报告，使学生获得 一次类似做科研论文的训练。 大型实验课侧重于提高学生的实践能力，引导学生把所学知识和实验内容紧密地结合起 来．并用理论指导实践，解决实验中的问题。 学生实验成绩评定，由实验操作技能、实验态度、实验报告与实验中分析问题和解决问 题诸方面综合考核确定。其中实验态度与实验操作能力占50％，实验报告质量与回答问题水 平占50％。 第－部分 高核糖核酸含量酵母的筛选及发酵试验 （一）高核糖核酸含量的酵母的筛选 简介 核糖核酸是医药工业和食品工业调味剂的重要原科，关于微生物菌体内ＲＮＡ的含量。 －般细菌为0.3～5.1％，酵母为2.7～11％，霉菌为0.7～2.8％。工业上生产核糖核酸主要 由酵母提取制备。核糖核酸得率取决于酵母中核糖核酸的含量，因此提高酵母核糖核酸含量
是工业生产核糖核酸的关键。 菌种的活化及扩大培养 (一)菌种与材料: l.菌种:丹麦啤酒酵母菌、产朊假丝酵母菌等 2.培养基:麦芽汁培养基 麦芽琼脂培养基 3.器材:水浴锅、烧杯、比色盘、碘液、纱布、灭菌锅、漏斗、试管等。 (二)方珐与步骤: 1.流程:液体石蜡保藏菌种 麦芽汁培养基活化(三天) 麦芽琼脂固体培养基(一天) 2.步骤 (Ⅰ)麦芽汁的制备:干麦芽首先进行压碎。加3~4倍水,浸泡1小时,然后升温至63℃糖 化4~6小时,用1/50N碘液测定为黄色至无色。用纱布过滤,可以反夏回流,直到滤液透 明澄清为止,即为麦芽汁。分装后1公斤/厘米蒸汽灭菌15分钟备用。 2)固体斜面麦芽培养基的制备:用12巴林的麦芽汁加2%琼脂加热使溶解,然后分装于 试管中(约装四分之一),放在灭菌釜中用1公斤/厘米,121℃灭菌15分钟。灭菌后倾 斜摆斜面,然后放在30℃恒温箱中使培养基上蒸汽水逐渐干燥,再置冰箱中保存待用。 要求 (1)麦芽汁浓度应为11~12巴林,pH5以上,制成的麦芽汁应为淡黄色透明,无其它悬浮 2)斜面培养基需待表面蒸汽水干燥后,才能接种 (3)制备培养基所用水份,应用自来水较好 、摇瓶发酵条件试验 摇瓶培养的目的有二:一是寻求发酵培养基的合适配方,二是寻找最佳发酵条件。微生 物发酵法是一个受多种因素影响的工艺过程,应用一般的简单比较法很难得到满意的结果, 实验室中往往采用正交设计方法,对所研究的菌种进行试验 正交试验法是一种安排和分析试验的方法,这种方法可以通过较少的试验次数和比较简便的
是工业生产核糖核酸的关键。 一、菌种的活化及扩大培养 （一）菌种与材料： ｌ．菌种：丹麦啤酒酵母菌、产朊假丝酵母菌等 ２．培养基：麦芽汁培养基 麦芽琼脂培养基 ３．器材：水浴锅、烧杯、比色盘、碘液、纱布、灭菌锅、漏斗、试管等。 （二）方珐与步骤： １．流程：液体石蜡保藏菌种 ↓ 麦芽汁培养基活化（三天） ↓ 麦芽琼脂固体培养基（一天） ２．步骤： （ｌ）麦芽汁的制备：干麦芽首先进行压碎。加3～4倍水，浸泡1小时，然后升温至63℃糖 化4～6小时，用1／50Ｎ碘液测定为黄色至无色。用纱布过滤，可以反夏回流，直到滤液透 明澄清为止，即为麦芽汁。分装后1公斤／厘米2蒸汽灭菌15分钟备用。 （２）固体斜面麦芽培养基的制备：用12巴林的麦芽汁加2％琼脂加热使溶解，然后分装于 试管中（约装四分之一），放在灭菌釜中用1公斤／厘米2，121℃灭菌１５分钟。灭菌后倾 斜摆斜面，然后放在30℃恒温箱中使培养基上蒸汽水逐渐干燥，再置冰箱中保存待用。 ３．要求： （ｌ）麦芽汁浓度应为11～12巴林，pＨ5以上，制成的麦芽汁应为淡黄色透明，无其它悬浮 物质。 （２）斜面培养基需待表面蒸汽水干燥后，才能接种。 （３）制备培养基所用水份，应用自来水较好。 二、摇瓶发酵条件试验 摇瓶培养的目的有二：一是寻求发酵培养基的合适配方，二是寻找最佳发酵条件。微生 物发酵法是一个受多种因素影响的工艺过程，应用一般的简单比较法很难得到满意的结果， 实验室中往往采用正交设计方法，对所研究的菌种进行试验。 正交试验法是一种安排和分析试验的方法，这种方法可以通过较少的试验次数和比较简便的
分析方法,获得较好的结果,它的特点是挑选一部分有代表性的试验项目,利用正交表来进 行整体设计。可以同时做一批试验,减少试验次数,缩短试验周期。通过分析,它能告诉我 们,哪些因索是显著因素,哪些是非显著因素,以及哪些因素同有交互作用和交互作用的大 小,还能分析出试验误差的大小。 正交试验包括两部分内容,设计试验方案和分析试验结果。 (一)菌种与材料: 1.茵种:同(一) 2.摇瓶发酵培养基:葡萄糖、硫酸铵、 KH2 POA0.3%、ZnSO0.1%、FeSO0.05%(pH5. 温度30℃) 3.材料:按正交表配制培养基,确定发酵条件。 (二)方法与步骤: 1.明确试验目的,确定试验因素,影响发酵的因素很多,考虑到实验室条件及人力和时间, 我们不能在一次试验中包括所有因素,本实验主要从葡萄糖、硫酸铵、通气量和发酵时间四 个因素,每因素选择三个水平,采用正交表L。(34) 2.列出水平表,根据生产上发酵的现有了解,把葡萄糖、硫酸铵、通气量和发酵时间四个 因素各分成三个水平 3.选择正交表:根据人力、物力、试验任务,确定因素水平后,选出正交表。表头中L表 示正交表,L右下脚9表示有9行,可用来安排9个试验。括号内底数3是因素水平数,指 数4是4个因素。 4.根据因素水平表(表头设计),把正交表的数字代号依次换成该因素和水平的实际数字 5.试验结果分析 从正交试验结果中,我们可以得到本次实验的直观最佳条件,但这不一定是最佳理论值。我 们可以根据实验的最佳条件和理论最佳条件进行比较,在下一步试验中可以在这些水平范围 内,进行改变和加密水平以求得更佳条件。表中R为极差,极差大小反应了因素变化时试验 指标变化的幅度,因素的极差越大,该因素对指标的影响也会越大,也就越重要,就更需要 控制在最佳水平上。 6.验证正交试验结果。 (三)操作: 斜面菌种培养物一环分别接入摇瓶发酵培养基,30℃,300转/分钟摇瓶机上振荡培养 22~26小时,按正交表定时取出
分析方法，获得较好的结果，它的特点是挑选一部分有代表性的试验项目，利用正交表来进 行整体设计。可以同时做一批试验，减少试验次数，缩短试验周期。通过分析，它能告诉我 们，哪些因索是显著因素，哪些是非显著因素，以及哪些因素同有交互作用和交互作用的大 小，还能分析出试验误差的大小。 正交试验包括两部分内容，设计试验方案和分析试验结果。 （一）菌种与材料： ｌ．茵种：同（一） ２．摇瓶发酵培养基：葡萄糖、硫酸铵、KH2PO4 0.3％、ZnSO4 0.1％、FeSO4 0.05％（pH 5.1, 温度30℃） ３．材料：按正交表配制培养基，确定发酵条件。 （二）方法与步骤： １．明确试验目的，确定试验因素，影响发酵的因素很多，考虑到实验室条件及人力和时间， 我们不能在一次试验中包括所有因素，本实验主要从葡萄糖、硫酸铵、通气量和发酵时间四 个因素，每因素选择三个水平，采用正交表Ｌ9（3 4）。 ２．列出水平表，根据生产上发酵的现有了解，把葡萄糖、硫酸铵、通气量和发酵时间四个 因素各分成三个水平。 ３.选择正交表：根据人力、物力、试验任务，确定因素水平后，选出正交表。表头中 L 表 示正交表，L 右下脚 9 表示有 9 行，可用来安排 9 个试验。括号内底数 3 是因素水平数，指 数 4 是 4 个因素。 ４.根据因素水平表（表头设计），把正交表的数字代号依次换成该因素和水平的实际数字。 ５．试验结果分析 从正交试验结果中，我们可以得到本次实验的直观最佳条件，但这不一定是最佳理论值。我 们可以根据实验的最佳条件和理论最佳条件进行比较，在下一步试验中可以在这些水平范围 内，进行改变和加密水平以求得更佳条件。表中R为极差，极差大小反应了因素变化时试验 指标变化的幅度，因素的极差越大，该因素对指标的影响也会越大，也就越重要，就更需要 控制在最佳水平上。 ６．验证正交试验结果。 （三）操作： 斜面菌种培养物－环分别接入摇瓶发酵培养基，30℃，300转／分钟摇瓶机上振荡培养 22～26小时，按正交表定时取出
培养期间要注意培养温度、环境清活和摇瓶机工作状态。 发酵完毕测定酵母及其核酸含量,填人表中进行计算和讨论 三、酵母生物量测量和核酸含量测定 利用血球计数板在显微镜下直接计数,是一种常用的计数法.此法的优点是直观、快速 将经过适当稀释的菌悬液注人血球计数板的计数室中,然后在显微镜下进行计数。 实验器材及具体步骤,参看《微生物学实验》实验三十的有关内容 (二)用于核酸生产的酵母培养10升发酵罐试验 、实验主要内容和要求 (一)本次实验的方案由同学们自己制定,实验应包括下列内容 1.用第一阶段在微生物实验中优选出的菌种,进行液体摇瓶种子扩大培养,供发酵接种用 种量自定。为保证发酵有较好的种子,可培养2~3倍种量的种子,择优接种 2.进行发酵。包括配制发酵培养基,补料准备,空消和实消,发酵过程的分析控制和适时 分批补料。 并要求发酵过程每一小时至少分析一次,分析项目为pH,醇母数、总糖、还原糖、核酸含 量和菌体镜检,并记录结果 发酵过程中应根据发酵状况及时调节控制合适的风量、罐压、罐温和搅拧转速,适时补料, 并且每半小时至少记录一次这些参数值。 3.判定发酵终点,在发酵结束后冰箱保存,以备实验用。 4.测定灭菌前后及工作过程的空气含菌量 5.测定并记录发酵液的溶氧浓度变化 (二)第二阶段实验内容多,综合性强,并且需要同学们独立制定实验的全盘方案和组织实 验,故本次实验有以下几个要求 1.充分做好实验前的预习 在实验前,要求同学们对实验的内容,所涉及的有关理论知识和曾做过的有关实验操作都要 充分预习和复习,做到心中有数。 2.独立制定实验全盘方案 在充分预习的基础上,以实验小组为单位,独立制定实验的全盘实施方案。并在实验前提交 指导教师审阅后,按方案进行实验
培养期间要注意培养温度、环境清活和摇瓶机工作状态。 发酵完毕测定酵母及其核酸含量，填人表中进行计算和讨论。 三、酵母生物量测量和核酸含量测定 利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的计数法．此法的优点是直观、快速。 将经过适当稀释的菌悬液注人血球计数板的计数室中，然后在显微镜下进行计数。 实验器材及具体步骤，参看《微生物学实验》实验三十的有关内容。 （二）用于核酸生产的酵母培养１０升发酵罐试验 －、实验主要内容和要求 （一）本次实验的方案由同学们自己制定，实验应包括下列内容： １．用第一阶段在微生物实验中优选出的菌种，进行液体摇瓶种子扩大培养，供发酵接种用， 种量自定。为保证发酵有较好的种子，可培养２～３倍种量的种子，择优接种。 ２．进行发酵。包括配制发酵培养基，补料准备，空消和实消，发酵过程的分析控制和适时 分批补料。 并要求发酵过程每一小时至少分析一次，分析项目为ｐＨ，醇母数、总糖、还原糖、核酸含 量和菌体镜检，并记录结果。 发酵过程中应根据发酵状况及时调节控制合适的风量、罐压、罐温和搅拧转速，适时补料， 并且每半小时至少记录一次这些参数值。 ３．判定发酵终点，在发酵结束后冰箱保存，以备实验用。 ４．测定灭菌前后及工作过程的空气含菌量。 ５．测定并记录发酵液的溶氧浓度变化。 （二）第二阶段实验内容多，综合性强，并且需要同学们独立制定实验的全盘方案和组织实 验，故本次实验有以下几个要求: １．充分做好实验前的预习 在实验前，要求同学们对实验的内容，所涉及的有关理论知识和曾做过的有关实验操作都要 充分预习和复习，做到心中有数。 ２．独立制定实验全盘方案 在充分预习的基础上，以实验小组为单位，独立制定实验的全盘实施方案。并在实验前提交 指导教师审阅后，按方案进行实验
方案内容大致包括 (1)种子培养基配方、配制量和每个摇瓶的装量,灭菌温度和时间,培养温度和时同。 2)发酵培养基配方和配制量,发酵罐空消、实消温度和时间,发酵过程中温度、通气比 和搅拌转速 (3)补料配方和配制量,灭菌温度和时间,计划补料时间,每次补料量。 (4)发酵终点判定方法。 (5)实验所需的各种器具、试剂 3.认真完成实验准备工作 本实验分菌种培养、发酵二个阶段,并且发酵过程中又有补料、分析和控制,因此操作步骤 和次数均较多。要求每次操作前都要做好准备工作,特别是无菌器具要提前灭菌以备使用 4.认真做好发酵过程的观察分析控制和交接班工作 发酵过程时间较长,操作内容多,故在发酵过程中应认真观察发酵过程中的各种参数,及时 取样分析,根据发酵状况给予调节控制并适时补料.努力把发酵控制在最佳状态。 由于发酵时间长,在发酵过程中同学们将分组轮换值班.故在交接班时,要做好交接工 作, 、各种发酵因素对酵母的影响 下面将各种发酵的影响因素提供给大家在制定方案和发酵控制时参考。 1.发酵温度。各种微生物都有自己最适宜的生长温度,酵母最适宜的生长温度是30℃。如 果发酵温度太高,在发酵时易产生沉淀现象。如果发酵温度太低,酵母发酵生长缓慢,产量 下降 2.发酵pH。发酵液中的pH对酵母发育有很大的影响,因为pH影响到酵母的生理机能, 在酸性培养基中,水份及其中的营养成分,容易渗透到细胞原生质内 3.化学因子的影响。不同的微生物对某些化学因子的稳定性表现不同。各种酵母的RNA 含量因培养条件而定,若提高铵离子、磷酸离子的浓度,RNA的含量就会增加。培养基的 c/h比率低时,RNA的含量较高。在培养基中添加由Fe2、Zu2、Cu2组成的混合 液,对RNA的含量具有明显的促进效果 4.通气量。酵母属兼氧性微生物,在供氧和缺氧的条件下,酵母细胞的生命活动和能量转 换是不同的。在有氧条件下,酵母进行有氧呼吸,糖被分解为水和CO2。在无氧条件下 酵母对糖进行发酵,糖被发酵乙醇和CO2。因此醇母培养需要有适当的含氧量
方案内容大致包括： （１）种子培养基配方、配制量和每个摇瓶的装量，灭菌温度和时间，培养温度和时同。 （２）发酵培养基配方和配制量，发酵罐空消、实消温度和时间，发酵过程中温度、通气比 和搅拌转速。 （３）补料配方和配制量，灭菌温度和时间，计划补料时间，每次补料量。 （４）发酵终点判定方法。 （５）实验所需的各种器具、试剂。 ３．认真完成实验准备工作 本实验分菌种培养、发酵二个阶段，并且发酵过程中又有补料、分析和控制，因此操作步骤 和次数均较多。要求每次操作前都要做好准备工作，特别是无菌器具要提前灭菌以备使用。 ４．认真做好发酵过程的观察分析控制和交接班工作 发酵过程时间较长，操作内容多，故在发酵过程中应认真观察发酵过程中的各种参数，及时 取样分析，根据发酵状况给予调节控制并适时补料．努力把发酵控制在最佳状态。 由于发酵时间长，在发酵过程中同学们将分组轮换值班．故在交接班时，要做好交接工 作。 二、各种发酵因素对酵母的影响 下面将各种发酵的影响因素提供给大家在制定方案和发酵控制时参考。 １．发酵温度。各种微生物都有自己最适宜的生长温度，酵母最适宜的生长温度是30℃。如 果发酵温度太高，在发酵时易产生沉淀现象。如果发酵温度太低，酵母发酵生长缓慢，产量 下降。 ２．发酵ｐＨ。发酵液中的ｐＨ对酵母发育有很大的影响，因为ｐＨ影响到酵母的生理机能， 在酸性培养基中，水份及其中的营养成分，容易渗透到细胞原生质内。 ３．化学因子的影响。不同的微生物对某些化学因子的稳定性表现不同。各种酵母的ＲＮＡ 含量因培养条件而定，若提高铵离子、磷酸离子的浓度，ＲＮＡ的含量就会增加。培养基的 ｃ／ｈ比率低时，ＲＮＡ的含量较高。在培养基中添加由Ｆｅ2+、Ｚｕ2+、Ｃｕ2+组成的混合 液，对ＲＮＡ的含量具有明显的促进效果。 ４．通气量。酵母属兼氧性微生物，在供氧和缺氧的条件下，酵母细胞的生命活动和能量转 换是不同的。在有氧条件下，酵母进行有氧呼吸，糖被分解为水和ＣＯ2。在无氧条件下， 酵母对糖进行发酵，糖被发酵乙醇和ＣＯ2。因此醇母培养需要有适当的含氧量
、实验可供条件说明 实验室有电热锅炉装置一套,主要供发酵罐的空消和实消之用。空消应采用蒸汽直接进 罐方式,可同时打开发酵罐上下二个蒸汽进罐阀门(见发酵罐示意图)二路进汽灭菌。同时 应打开发酵罐与外部连接的所有管道阀门通汽,消灭死角,但应注意为节约用汽,这些管道 阀门应尽量开得小些,以见有汽排出为度。另外对发酵罐无关的阀门都应关死,以免蒸汽旁 泄浪费。在实消时,为避免罐内冷凝水过多,可采用夹套进汽方法间接灭菌,但间接灭菌也 会造成培养液蒸发而减少体积,故可适当直接进汽补充冷凝水。总之既要保证灭菌效果,又 要注意不使培养液体积有较大变化,实消应开动搅拌。 2.实验室有空气净化系统一套,提供发酵无菌空气。无菌空气流量可见空气流量计,调节 进排气阀门可使空气流量及罐压控制在预定值。 3.发酵罐自来水系统用于冷却和洗罐。发酵过程中应注意不能打开进罐水阀,否则会造成 杂菌污染。 4.发酵罐系统控制装置见发酵罐系统和控制柜示意图 5.板框过滤机供过滤发酵液使用 6.发酵分析用的仪器、器皿、试剂基本上与微生物实验相同。 四、实验注意事项 1.发酵罐操作时,柜子内的许多接头都是裸露带电的,故不能触摸,以免触电。 2.发酵罐在空消和实消时,不能随意触摸罐体和管道,以免烫伤。 因发酵时间长,需轮班操作,故每组人员多,应注意实验室的秩序。并且每位同学都应 主动积极参与实验的全部过程。 4.发酵罐的压力不能超过1公斤/厘米,这是在蒸汽灭菌和通入无菌空气时都应特别注 意的。 5.所有阀门开关时,动作应缓慢些,特别是蒸汽和空气进人阀门。 五、实验报告要求 1.实验完毕后,每位同学都应独立作出实验报告,实验报告应类似于小型论文格式 2.实验报告内容包括 (1)目的意义。 (2)实验内容概述。 (3)实验的详细记录。 (4)对实验过程、记录和结果的分析讨论和总结
三、实验可供条件说明 ｌ．实验室有电热锅炉装置一套，主要供发酵罐的空消和实消之用。空消应采用蒸汽直接进 罐方式，可同时打开发酵罐上下二个蒸汽进罐阀门（见发酵罐示意图）二路进汽灭菌。同时 应打开发酵罐与外部连接的所有管道阀门通汽，消灭死角，但应注意为节约用汽，这些管道 阀门应尽量开得小些，以见有汽排出为度。另外对发酵罐无关的阀门都应关死，以免蒸汽旁 泄浪费。在实消时，为避免罐内冷凝水过多，可采用夹套进汽方法间接灭菌，但间接灭菌也 会造成培养液蒸发而减少体积，故可适当直接进汽补充冷凝水。总之既要保证灭菌效果，又 要注意不使培养液体积有较大变化，实消应开动搅拌。 ２．实验室有空气净化系统一套，提供发酵无菌空气。无菌空气流量可见空气流量计，调节 进排气阀门可使空气流量及罐压控制在预定值。 ３．发酵罐自来水系统用于冷却和洗罐。发酵过程中应注意不能打开进罐水阀，否则会造成 杂菌污染。 ４．发酵罐系统控制装置见发酵罐系统和控制柜示意图。 ５．板框过滤机供过滤发酵液使用。 ６．发酵分析用的仪器、器皿、试剂基本上与微生物实验相同。 四、实验注意事项 １．发酵罐操作时，柜子内的许多接头都是裸露带电的，故不能触摸，以免触电。 ２．发酵罐在空消和实消时，不能随意触摸罐体和管道，以免烫伤。 ３．因发酵时间长，需轮班操作，故每组人员多，应注意实验室的秩序。并且每位同学都应 主动积极参与实验的全部过程。 ４．发酵罐的压力不能超过１公斤／厘米2，这是在蒸汽灭菌和通入无菌空气时都应特别注 意的。 ５．所有阀门开关时，动作应缓慢些，特别是蒸汽和空气进人阀门。 五、实验报告要求 ｌ．实验完毕后，每位同学都应独立作出实验报告，实验报告应类似于小型论文格式。 ２．实验报告内容包括： （１）目的意义。 （２）实验内容概述。 （３）实验的详细记录。 （４）对实验过程、记录和结果的分析讨论和总结
(5)实验心得体会,对本实验意见评价 主要参考书 1.武大、复旦合编:微生物学,高教出版杜(二版),1998 2.范秀云等:微生物学实验,高教出版社 3.中科院数学所数理统计组编:正交试验法。人民教育出版社,1975 4.上海市食品工业公司编:酵母生产技术知识,1984 5.[日]氨基酸。核酸集谈会编,嶷克旭等译:核酸发酵。轻工业出版社,1987 6.林绿君·袁惠民:啤酒酵母和微生物管理。轻工业出版社990 第二部分RNA的制备和核苷酸的离子交换层析分离 实验原理 核酸是生物体的重要组成物质,是生物遗传的物质基础。它在生物体的生长、发育、繁 殖、遗传变异等基本生命过程中起着重要的作用。核酸是由许多单核苷酸构成的多聚物。单 核苷酸是由磷酸、核糖和碱基所组成。依据其核糖的结构不同,可将核酸分为核糖核酸(R NA)和脱氧核糖核酸(DNA)。从50年代开始,大量硏究表明,核酸及其降解物、衍 生物具有良好的治疗作用,因而迅速发展成为一大类生物药物一核酸类药物。 核糖核酸(RNA)广泛存在动物、植物和微生物之中。本实验选用稀碱法,从酵母中 制备RNA:即用氢氧化钠溶液,使细胞壁变性,以改变细胞壁通透性,使核酸从细胞内释 放出来,再用酸中和,然后除去菌体,将pH凋至RNA的等电点(P12.5)。使RNA沉 淀下来,干燥,即得RNA成品 核苷酸的分离纯化采用离子交换层析法。离子交换作用一般指在固相和液相之间发生的 可逆的离子交换反应,它可用于分离各种可解离的物质。通常离子交换剂是在一种高分子的 不溶性母体上引人若干大量功能基团。这样人工合成的离子交换剂具有各种各样的性能。作 为不溶性母体的高分子有树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖或无机聚合物等,引人的功能基团 可以是酸性基团,如强酸型的含有磺酸基(一SO3H)、中强酸型的含有磷酸基(-POs H2)、弱酸型的含有羧基(一COOH)或酚羟基(一OH)。也可以是碱性基团,如强 碱型的含季铵[一N’(CH3)3]、弱碱型的含叔胺[一N’(CH3)2]、仲胺(一NHC H3)、伯胺(一NH2)等
（５）实验心得体会，对本实验意见评价。 主要参考书 ｌ．武大、复旦合编：微生物学，高教出版杜（二版），ｌ９９８ ２．范秀云等：微生物学实验，高教出版社 ３．中科院数学所数理统计组编：正交试验法。人民教育出版社，１９７５ ４．上海市食品工业公司编：酵母生产技术知识，ｌ９８４ ５．［日］氨基酸。核酸集谈会编，嶷克旭等译：核酸发酵。轻工业出版社，ｌ９８７ ６．林绿君·袁惠民：啤酒酵母和微生物管理。轻工业出版社ｌ９９０ 第二部分 ＲＮＡ的制备和核苷酸的离子交换层析分离 实验原理 核酸是生物体的重要组成物质，是生物遗传的物质基础。它在生物体的生长、发育、繁 殖、遗传变异等基本生命过程中起着重要的作用。核酸是由许多单核苷酸构成的多聚物。单 核苷酸是由磷酸、核糖和碱基所组成。依据其核糖的结构不同，可将核酸分为核糖核酸（Ｒ ＮＡ）和脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）。从５０年代开始，大量研究表明，核酸及其降解物、衍 生物具有良好的治疗作用，因而迅速发展成为一大类生物药物一核酸类药物。 核糖核酸（ＲＮＡ）广泛存在动物、植物和微生物之中。本实验选用稀碱法，从酵母中 制备ＲＮＡ：即用氢氧化钠溶液，使细胞壁变性，以改变细胞壁通透性，使核酸从细胞内释 放出来，再用酸中和，然后除去菌体，将ｐＨ凋至ＲＮＡ的等电点（Ｐ12.5）。使ＲＮＡ沉 淀下来，干燥，即得ＲＮＡ成品。 核苷酸的分离纯化采用离子交换层析法。离子交换作用一般指在固相和液相之间发生的 可逆的离子交换反应，它可用于分离各种可解离的物质。通常离子交换剂是在一种高分子的 不溶性母体上引人若干大量功能基团。这样人工合成的离子交换剂具有各种各样的性能。作 为不溶性母体的高分子有树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖或无机聚合物等，引人的功能基团 可以是酸性基团，如强酸型的含有磺酸基（－ＳＯ3Ｈ）、中强酸型的含有磷酸基（－ＰＯ３ Ｈ２）、弱酸型的含有羧基（－ＣＯＯＨ）或酚羟基（－ＯＨ）。也可以是碱性基团，如强 碱型的含季铵［－Ｎ+（ＣＨ3）3］、弱碱型的含叔胺［－Ｎ+（ＣＨ3）2］、仲胺（－ＮＨＣ Ｈ3）、伯胺（－ＮＨ2）等
在一定条件下,离子交换树脂吸附的物质数量和在溶液中的物质数量达到平衡时,两者 数量之比叫分配系数(平衡常数)。理想的情况是洗脱曲线和分配系数相配合,且分离的各 种物质的分配系数,应有足够的差别。当有A、B两种溶质进行离子交换柱层析时,吸附 在离子交换树脂上的溶质为高浓度的竞争性离子所交换并被洗脱下来。溶质的迁移速度与分 配系数成反比,因此从原点到A、B两种物质波峰间距离的比值决定于它们分配系数的比值 各波峰的幅度和形状由柱长及其它因素(如交换树脂颗粒的大小、形状、交联度、流速等) 所决定。溶质的分配系数不仅与其电荷有关,也受到它与离子交换树脂的非极性亲和力以及 两者之间的空间关系等因素的影响。 在一定条件下,离子交换树脂对不同单核苷酸的吸附能力是不同的,因此选择适当类型 的离子交换树脂,控制吸附及洗脱的条件便可分离各种单核苷酸。 为了增加核苷酸在离子交换树脂上的吸附能力,需要:(1)控制条件,使单核苷酸带 上大量相应的电荷。这主要是通过调节pH值,使单核苷酸的一些可解离基团(磷酸基、氨 基、烯醇基)解离,四种核苷酸相对分配系数与pH值的关系如附图。(2)减少上柱溶液 中除单核苷酸外的其它离子的强度,洗脱时则相反,使被吸附的核苷酸的相应电荷降低;增 加洗脱液中竞争性的离子的强度,必要时提高温度使离子交换树脂对核苷酸的非极性吸引作 用减弱。 RNA可被碱水解成2’或3’一核苷酸。可利用阳离子交换树脂(聚苯乙烯一二乙 烯苯,磺酸型)或阴离子交换树脂(聚苯乙烯一二乙烯苯,季铵碱型)分离核苷酸。本实验 利用强碱型阴离子交换树脂(强碱型201×8、强碱型201×7、国产717、 Dowel, A leite ir a-400或 Zerolitf f等)将各类核苷酸分开,测定核苷酸的紫外吸收 光谱的比值:0.D230/0.D6,0.D2/0.D2∞,0.D0/0.D对照标准比值(见附表),可以确 其为何种核苷酸,同时也能算出RNA中核苷醛的相对克分子比。 实验步骤 、RNA的制备 取一部分酵母泥(例如10g),置培养皿内,于105℃烘箱内烤干,测定其含水量。 酵母泥一般含干酵母15-25%。 加水将约100克酵母泥调成5-10%干重的菌悬液,再加入浓的(如10%)氢氧 化钠溶液,使氢氧化钠的最终浓度(即提取时的浓度)为1%。在20℃条件下电动搅拌3
在一定条件下，离子交换树脂吸附的物质数量和在溶液中的物质数量达到平衡时，两者 数量之比叫分配系数（平衡常数）。理想的情况是洗脱曲线和分配系数相配合，且分离的各 种物质的分配系数，应有足够的差别。 当有Ａ、Ｂ两种溶质进行离子交换柱层析时，吸附 在离子交换树脂上的溶质为高浓度的竞争性离子所交换并被洗脱下来。溶质的迁移速度与分 配系数成反比，因此从原点到Ａ、Ｂ两种物质波峰间距离的比值决定于它们分配系数的比值， 各波峰的幅度和形状由柱长及其它因素（如交换树脂颗粒的大小、形状、交联度、流速等） 所决定。溶质的分配系数不仅与其电荷有关，也受到它与离子交换树脂的非极性亲和力以及 两者之间的空间关系等因素的影响。 在一定条件下，离子交换树脂对不同单核苷酸的吸附能力是不同的，因此选择适当类型 的离子交换树脂，控制吸附及洗脱的条件便可分离各种单核苷酸。 为了增加核苷酸在离子交换树脂上的吸附能力，需要：（１）控制条件，使单核苷酸带 上大量相应的电荷。这主要是通过调节ｐＨ值，使单核苷酸的一些可解离基团（磷酸基、氨 基、烯醇基）解离，四种核苷酸相对分配系数与ｐＨ值的关系如附图。（２）减少上柱溶液 中除单核苷酸外的其它离子的强度，洗脱时则相反，使被吸附的核苷酸的相应电荷降低；增 加洗脱液中竞争性的离子的强度，必要时提高温度使离子交换树脂对核苷酸的非极性吸引作 用减弱。 ＲＮＡ可被碱水解成２’或３’－核苷酸。可利用阳离子交换树脂（聚苯乙烯－二乙 烯苯，磺酸型）或阴离子交换树脂（聚苯乙烯－二乙烯苯，季铵碱型）分离核苷酸。本实验 利用强碱型阴离子交换树脂（强碱型２０１×８、强碱型２０１×７、国产７ｌ７、Ｄowexl， Ａmleite ＩＲＡ－４００或ＺerolitＦＦ等）将各类核苷酸分开，测定核苷酸的紫外吸收 光谱的比值：O.D250／O.D260，O.D280／O.D260，O.D290／O.D260对照标准比值（见附表），可以确 其为何种核苷酸，同时也能算出ＲＮＡ中核苷醛的相对克分子比。 实验步骤 －、ＲＮＡ的制备 取一部分酵母泥（例如１０ｇ），置培养皿内，于１０５℃烘箱内烤干，测定其含水量。 酵母泥一般含干酵母１５－２５％。 加水将约１００克酵母泥调成５－１０％干重的菌悬液，再加入浓的（如１０％）氢氧 化钠溶液，使氢氧化钠的最终浓度（即提取时的浓度）为１％。在２０℃条件下电动搅拌３
0~45分钟(如室温在20℃以下,可延长时间至1小时)。然后用6N、0.6N和0.0 6N的盐酸(从粗调到细调)中和至pH7.0,再搅拌10分钟,直火或蒸汽迅速加热到 90℃,在该温度下保持10分钟,迅速下降到10℃以下(先用水冲冷至室温,再放到冰 箱)。离心(3000转/分,20分钟)沉出蛋白质和酵母残渣。取出上清液,用6N、 0.6N和0.06N盐酸调至pH2.5(RNA的等电点)。低温放置过夜。 离心(4000rpm,15分钟)收集RNA沉淀,用少量乙醇洗二次,烘箱干燥。所得 的RNA制品,色微黄,产率为2~5%,RNA含量可达60~70%。 、离子交换层析分离单核苷酸 1.离子交换树脂预处理: 用200ml量杯量取约20ml湿717(201*8)树脂置于500ml烧杯中,先用 去离子水洗去色素及杂质,用水浸泡并利用浮选法除去细小颗粒:再用4倍体积的1 n NaOH 浸泡半少时,并不时搅拌,用去离子洗至中性,再用4倍体积的1NN.0H浸泡半小时, 不时搅拌,然后用去离子水洗至中性,抽滤法抽干,备用 2.含水量测定 精确称取事先已处理好并抽千的氢氧根型阴离子交换树脂(即上述树脂)约2克,10 5℃下烤干至恒重,计算其含水量。 3.总交换容量的测定 (1)静态法.精确称取上述抽千湿树脂约2g,放入三角瓶中,用吸管吸取50mHCI 标准溶液(约0.1N)加入树脂中,放置约4一6小时,要求树脂全部浸入溶液中.然后 用吸管分别从中取出均等体积放入两只三角烧瓶中,以酚酞作指示剂,用Na0H标准溶液 (约0.1N)滴定至粉红色出现,且半分钟不退色,即为滴定终点,取两次滴定的平均值 (2)动态法; ①转型.精确称取约10g抽干树脂(0H一型),用小漏斗加到柱中,用去离子水(约2 00m{)洗至中性 ②洗脱.用5%Nacl溶液流过树脂,并收集流出液,直至流出液pH为中性为止 4.单核苷酸的制备及离子交换层析法分离 (1)样品处理取100毫克上述RNA制品,溶解于4m10.3N氢氧化钾溶液中,于37℃水 解20小时,RNA在碱作用下水解成单核菁酸,水解完成后,用2N过氯酸溶液调至pH 2以下,以4000转/分,离心10分钟,取上清液,用2N氢氧化钠溶液调至pH8, 纸电泳法检测四种核苷酸的存在,用紫外分光光度计测定其总OD2o值
０～４５分钟（如室温在２０℃以下，可延长时间至１小时）。然后用６Ｎ、０.６Ｎ和０．０ ６Ｎ的盐酸（从粗调到细调）中和至ｐＨ７．０，再搅拌１０分钟，直火或蒸汽迅速加热到 ９０℃，在该温度下保持１０分钟，迅速下降到１０℃以下（先用水冲冷至室温，再放到冰 箱）。离心（３０００转／分，２０分钟）沉出蛋白质和酵母残渣。取出上清液，用６Ｎ、 ０．６Ｎ和０．０６Ｎ盐酸调至ｐＨ２．５（ＲＮＡ的等电点）。低温放置过夜。 离心（４０００ｒｐｍ，１５分钟）收集ＲＮＡ沉淀，用少量乙醇洗二次，烘箱干燥。所得 的ＲＮＡ制品，色微黄，产率为２～５％，ＲＮＡ含量可达６０～７０％。 二、离子交换层析分离单核苷酸 １．离子交换树脂预处理： 用２００ml量杯量取约２０ml湿７１７（２０１*８）树脂置于５００ml烧杯中，先用 去离子水洗去色素及杂质，用水浸泡并利用浮选法除去细小颗粒；再用４倍体积的１Ｎ NaOH 浸泡半少时，并不时搅拌，用去离子洗至中性，再用４倍体积的１ＮＮ．０Ｈ浸泡半小时， 不时搅拌，然后用去离子水洗至中性，抽滤法抽干，备用． ２．含水量测定： 精确称取事先已处理好并抽千的氢氧根型阴离子交换树脂（即上述树脂）约２克，１０ ５℃下烤干至恒重，计算其含水量。 ３．总交换容量的测定 （１）静态法．精确称取上述抽千湿树脂约２ｇ，放入三角瓶中，用吸管吸取５０mlＨＣＩ 标准溶液（约０．１Ｎ）加入树脂中，放置约４－６小时，要求树脂全部浸入溶液中．然后 用吸管分别从中取出均等体积放入两只三角烧瓶中，以酚酞作指示剂，用Ｎａ０Ｈ标准溶液 （约０．１Ｎ）滴定至粉红色出现，且半分钟不退色，即为滴定终点，取两次滴定的平均值。 （２）动态法； ①转型．精确称取约１０ｇ抽干树脂（０Ｈ－型），用小漏斗加到柱中，用去离子水（约２ ００ｍ｛）洗至中性； ②洗脱．用５％Ｎａｃｌ溶液流过树脂，并收集流出液，直至流出液ｐＨ为中性为止． ４．单核苷酸的制备及离子交换层析法分离 （１）样品处理取１００毫克上述RNA制品，溶解于４ml0.3Ｎ氢氧化钾溶液中，于３７℃水 解２０小时，ＲＮＡ在碱作用下水解成单核菁酸，水解完成后，用２Ｎ过氯酸溶液调至ｐＨ ２以下，以４０００转／分，离心１０分钟，取上清液，用２Ｎ氢氧化钠溶液调至ｐＨ８， 纸电泳法检测四种核苷酸的存在，用紫外分光光度计测定其总OD260值
(2)离子交换树脂的转型 将树脂装入柱内,用1M甲酸钠溶液洗,直至流出液中不含氯离子(用1%硝酸银溶液 检查).最后用100ml1M甲酸洗,直至260nm处光密度值低于0.03并用蒸馏水洗至接近中性, 即可使用。 3)离子交换柱的安装取内径1.1~1.2cm的层析柱,将处理好的强碱型阴离子交换 材脂悬浮液一次倒人玻璃柱内,使树脂自由沉降至柱下部,用一小片圆滤纸盖在村脂面上, 缓慢放出液体,使液面降至滤纸片下树脂面上.(注意在整个操作过翟中防止液面低于村脂, 当液面低于村脂表面时空气将进人,在村脂柱内形成气泡,妨碍层析结果).经沉积后离子 交换树脂柱床高约10cm (4)加样将RNA水解液小心地用滴管加到离子交换树脂柱上,待样品液面降低到滤纸片 内时,用50m1蒸馏水淋洗树脂柱.碱基、核苷及其它不被阴离子交换树脂吸附的杂质均被洗 出 5)核苷酸混合物的冼脱收集蒸馏水洗脱液,在紫外分光上光度计上测260nm处光密度 待洗脱液不含紫外吸收物质(光密度值低于0.02)时,可用甲酸及甲醚钠溶液进行冼脱 依次用下列冼脱液分段洗脱,500m10.02M甲酸:;500m10.15N甲酸:500m10.0M甲酸 0.05M甲酸钠溶液(pH4.44);最后用500m10.1M甲酸+0.1M甲酸钠溶液(pH3.7 4).用部分收集器收集流出液,控制流速8ml/10分,8ml/管 (6)由层析柱所得各部分洗洗脱液的分析 以相应浓度的甲酸或甲酸钠溶液为空白对照,用紫外分光光度计测各管溶液在260m波 长处光密度值,以洗脱液体积(或管数)为横座标,光密度值为纵座标作图,分析各部分波 蜂位置 分析方法 1.核酸样品纯度的测定 Ⅰ)准确称取待测的核酸样品0.5克,加少量蒸馏水(或无离子水)调成糊状,再加适量 的水,用5一6%氨水调至pH7,定容至50m1l 2)取两支离心管,甲管内加入2皿l样品溶液和2皿l蒸馏水:乙管内加人2m样品溶液和 2皿l沉淀剂(沉淀除去大分子核酸,作为对照)。混匀,在冰浴(或冰箱)中放置30分钟 3000转/分,离心10分钟.从甲、乙两管中分别吸取0.5毫升上清液,用蒸馏水定
（２）离子交换树脂的转型 将树脂装入柱内，用１Ｍ甲酸钠溶液洗，直至流出液中不含氯离子（用１％硝酸银溶液 检查）．最后用100ml 1Ｍ甲酸洗，直至260nm处光密度值低于0.03并用蒸馏水洗至接近中性， 即可使用。 （３）离子交换柱的安装取内径１．１～１．２cm的层析柱，将处理好的强碱型阴离子交换 材脂悬浮液一次倒人玻璃柱内，使树脂自由沉降至柱下部，用一小片圆滤纸盖在村脂面上， 缓慢放出液体，使液面降至滤纸片下树脂面上．（注意在整个操作过翟中防止液面低于村脂， 当液面低于村脂表面时空气将进人，在村脂柱内形成气泡，妨碍层析结果）．经沉积后离子 交换树脂柱床高约10cm． （４）加样将ＲＮＡ水解液小心地用滴管加到离子交换树脂柱上，待样品液面降低到滤纸片 内时，用50ml蒸馏水淋洗树脂柱．碱基、核苷及其它不被阴离子交换树脂吸附的杂质均被洗 出． （５）核苷酸混合物的冼脱收集蒸馏水洗脱液，在紫外分光上光度计上测260nm处光密度， 待洗脱液不含紫外吸收物质（光密度值低于0.02）时，可用甲酸及甲醚钠溶液进行冼脱． 依次用下列冼脱液分段洗脱，500ml0.02M甲酸；500ml0.15Ｎ甲酸；500ml0.01Ｍ甲酸＋ 0.05Ｍ甲酸钠溶液（ｐＨ４．４４）；最后用500ml0.1Ｍ甲酸＋0.1Ｍ甲酸钠溶液（ｐＨ３．７ ４）．用部分收集器收集流出液，控制流速8ml/10分，8ml／管． （６）由层析柱所得各部分洗洗脱液的分析 以相应浓度的甲酸或甲酸钠溶液为空白对照，用紫外分光光度计测各管溶液在260nm波 长处光密度值，以洗脱液体积（或管数）为横座标，光密度值为纵座标作图，分析各部分波 蜂位置 分 析 方 法 １．核酸样品纯度的测定 （ｌ）准确称取待测的核酸样品0.5克，加少量蒸馏水（或无离子水）调成糊状，再加适量 的水，用５一６％氨水调至ｐＨ７，定容至５０ml． （２）取两支离心管，甲管内加入2ml样品溶液和２ml蒸馏水；乙管内加人２ml样品溶液和 ２ml沉淀剂（沉淀除去大分子核酸，作为对照）。混匀，在冰浴（或冰箱）中放置３０分钟， ３０００转／分，离心１０分钟．从甲、乙两管中分别吸取０．５毫升上清液，用蒸馏水定