第十二章生物技术在园艺植物上的应用生物技术是指在离体条件下，人为地使植物细胞或组织繁殖增长，产生一些次生代通物质，以及对生物体进行遗传修饰的各项技术的总称。广义的生物技术包括生物技术在园艺植物育种上的应用研究，近年来，取得了较大的进展，显示出巨大的潜力，例如，采用离体培养方法快速繁殖园艺植物苗木；胚培养，胚乳培养，花药与花翰培养，以及原生质体操作，培育果树新品种等等。本章择要介绍生物技术应用于园艺植物品种选育或良种繁育中富有成效或潜力的若干领域。第一节组织及器官培养组织培养是生物技术中的一个基本技术。植物组织培养就是从植物体上取下某一器官或组织，在人工培养基上分化、再分化，最后长成完整植株的过程。近年来，园艺的组织培养研究工作发展较快，在许多方面取得了新研究进展，特别在科学研究和生产实践中显示出重要的作用。例如组织培养产生的新个体能消除营养繁殖类型的病毒病；能够加快繁殖良种苗木；通过胚乳培养能获得三倍体无核果实；花粉培养能获得纯合亲本，有助于控制后代的遗传；单细胞和原生质体的培养，有助于解决嵌合体对突变育种的干扰；通过组织培养与诱变育种相结合，可为果树育种开辟新的育种途径等等。从1902年德国的Haberland开始培养植物的叶肉组织算起，植物组织培养已有90年的历史。当时他提出一个大胆的设想：从一个体细胞可以得到人工培养的胚，即细胞的”全能性“问题。”全能性”是指离体的植物细胞或性细胞（花粉）在一定培养条件下，能被诱导发生器官分化和再生成植株的能力，而且再生植株具有于母体植株相同的全部遗传信息。组织培养的原理就在于细胞的全能性。通过组织培养巧妙的利用这种全能性，使其在各方面取得成效。可以预期，细胞全能性的进一步开发和利用，可望创造更多的新品种，并在改良现有品种的过程中，大大节约时间和空间。一.果树组织培养的研究概况园艺植物特别是果树品种改良过去多采用常规技术，但选择效率低，育种周期太长，已不能满足生产的需要。近年来迅速发展的生物技术为改良果树品种开辟了一条新途径。随着组织培养技术的不断改进和日臻完善，特别是基因工程和细胞工程的兴起，不仅可以克服常规育种历来存在的某些障碍，而且可以获得常规育种难以或无法得到的新基因型，从而可以创造出新的品种或物种。应用生物技术改良植物品种的研究范围较广，这里仅从组织培养和生物技术的实际应用两部分作一介绍。组织培养是生物技术的重要工具，世界各国都很重视，开展了多方面的研究。至今，美国、英国、意大利、法国、原苏联、澳大利亚等国，以及我国的北京、上海、辽宁、山东、山西、河南、河北、江苏、浙江、广东、福建、甘肃、宁夏、新疆等省、市、自治区，都开展了果树和瓜类组织培养研究工作，涉及范围很广，几乎所有主要果树和瓜类都进行过组织培养研究，并且成效显著。例如，茎尖培养用来快速繁殖品种苗木，已在苹果品种、苹果矮化砧木及梨、桃、李、葡萄、扁桃、樱桃、板栗、核桃、猕猴桃、柑桔、草莓和西瓜上得到应用：并且已在苹果、柑桔和草莓上获得无病毒植株，同时利用试管苗的微型嫁接技术消除了柑桔病毒。通过培乳培养以获得三倍体植株的工作，已在苹果、猕猴桃、柑桔、枇杷、柚子、葡萄、桃、枣、梨上开展，其中苹果、柑桔、称猴桃已获得三倍体植株。胚珠培养的目的在于克服种子休眠及缩短育种周期，克服远缘杂交中杂种胚的败育等问题，尤其在桃上应用较多，其它如苹果、梨、柑桔、山楂、李、杏、樱桃和西瓜上均获得了成功。胚珠培养在柑桔上得到了植株。花药培养是为了获得单倍体植株，在苹果、草每、葡萄、梨、桃、否、柑桔、枇杷、西瓜上获得厂成功。器官培养中有叶培养、胚轴培养、果肉培养、汗汁囊培养、子叶培养、茎段培养等都获得了成功。如日本用樱桃叶、葡萄叶培养得到了生根植株，有人用石榴叶培养也得到了成功。原生质体培养，在柑桔、狱称猴桃、苹果上已获得成功，细胞融合杂交，日本国立果树试验场用桃细胞间杂交，已获得融合细胞：日本安艺津果树农场用枸桔和甜橙属间细胞杂交，培育出细胞融合的杂种植株，已移入温室，镜检证明为四倍体。组织培养还用于种质保存和抗盐性育种等方面。二，组织培养的实际应用包括的内容较多，其主要方面有以下几点：1无性系变异的诱导与选择：无性系变异包括体细胞无性系和配子无性系两个方面。通常情况下，要获得无性系变异，关键在于诱导不定芽或无性胚的发生。果树作物诱导不定芽或无性胚比较困难。自从陈维伦（1979）利用苹果砧木M9茎段愈伤组织诱导获得新梢后，这方面逐渐取得了较大进展。一般情况下，利用果树茎尖进行离体繁殖的过程中，可能发生基因的突变，尤其是利用愈伤组织诱导新梢的过程，可以显著提高突变频率。因此，组织培养本身往往就是新的意想不到的遗传变异的丰富来源。除了在组织培养过程中，无性系自然变异外，人们有意识地在培养过程中加入某种诱变条件，大大提高了变异频率。傅润民等（1990）用苹果、葡萄试管苗茎尖进行C060射线处理，找出了适宜的处理方法。张德民等（1990）用山楂茎尖进行射线处理，通过对继代培养的一代和二代材料的酯酶电泳分析，认为同工酶可作用鉴别突变的指标。郑永年等（1988）在草莓上也用类似方法获得了草莓的同质突变体。英国东茂林试验站，在诱导苹果叶片再生新梢前用X射线进行照射处理，将再生新梢形成的植株栽植田间进行观察，但尚未见到有明显变异。日本将秋水仙素加入培养基诱发葡萄变异，已得到生根的变异植株。试验体系。2.原生质体培养和细胞融合：
第十二章 生物技术在园艺植物上的应用 生物技术是指在离体条件下，人为地使植物细胞或组织繁殖增长，产生一些次生代通物质，以及 对生物体进行遗传修饰的各项技术的总称。广义的生物技术包括 生物技术在园艺植物育种上的应用研究，近年来，取得了较大的进展，显示出巨大的潜力，例如， 采用离体培养方法快速繁殖园艺植物苗木；胚培养，胚乳培养，花药与花翰培养，以及原生质体操作，培育果树新 品种等等。 本章择要介绍生物技术应用于园艺植物品种选育或良种繁育中富有成效或潜力的若干领域。 第一节组织及器官培养 组织培养是生物技术中的一个基本技术。植物组织培养就是从植物体上取下某一器官或组织，在人工培 养基上分化、再分化，最后长成完整植株的过程。 近年来，园艺的组织培养研究工作发展较快，在许多方面取得了新研究进展，特别在科学研究和生产实 践中显示出重要的作用。例如组织培养产生的新个体能消除营养繁殖类型的病毒病；能够加快繁殖良种苗木；通过 胚乳培养能获得三倍体无核果实；花粉培养能获得纯合亲本，有助于控制后代的遗传；单细胞和原生质体的培养， 有助于解决嵌合体对突变育种的干扰；通过组织培养与诱变育种相结合，可为果树育种开辟新的育种途径等等。 从1902年德国的Haberland开始培养植物的叶肉组织算起，植物组织培养已有90年的历史。当时他提出一 个大胆的设想：从一个体细胞可以得到人工培养的胚，即细胞的"全能性"问题。 "全能性"是指离体的植物细胞或 性细胞（花粉）在一定培养条件下，能被诱导发生器官分化和再生成植株的能力，而且再生植株具有于母体植株相 同的全部遗传信息。组织培养的原理就在于细胞的全能性。通过组织培养巧妙的利用这种全能性，使其在各方面取 得成效。 可以预期，细胞全能性的进一步开发和利用，可望创造更多的新品种，并在改良现有品种的过程中，大 大节约时间和空间。 一.果树组织培养的研究概况 园艺植物特别是果树品种改良过去多采用常规技术，但选择效率低，育种周期太长，已不能满足生产的 需要。近年来迅速发展的生物技术为改良果树品种开辟了一条新途径。随着组织培养技术的不断改进和日臻完善， 特别是基因工程和细胞工程的兴起，不仅可以克服常规育种历来存在的某些障碍，而且可以获得常规育种难以或无 法得到的新基因型，从而可以创造出新的品种或物种。 应用生物技术改良植物品种的研究范围较广，这里仅从组织培养和生物技术的实际应用两部分作一介绍。 组织培养是生物技术的重要工具，世界各国都很重视，开展了多方面的研究。至今，美国、英国、意大 利、法国、原苏联、澳大利亚等国，以及我国的北京、上海、辽宁、山东、山西、河南、河北、江苏、浙江、广 东、福建、甘肃、宁夏、新疆等省、市、自治区，都开展了果树和瓜类组织培养研究工作，涉及范围很广，几乎所 有主要果树和瓜类都进行过组织培养研究，并且成效显著。例如，茎尖培养用来快速繁殖品种苗木，已在苹果品 种、苹果矮化砧木及梨、桃、李、葡萄、扁桃、樱桃、板栗、核桃、猕猴桃、柑桔、草莓和西瓜上得到应用；并且 已在苹果、柑桔和草莓上获得无病毒植株，同时利用试管苗的微型嫁接技术消除了柑桔病毒。通过培乳培养以获得 三倍体植株的工作，已在苹果、猕猴桃、柑桔、枇杷、柚子、葡萄、桃、枣、梨上开展，其中苹果、柑桔、猕猴桃 已获得三倍体植株。胚珠培养的目的在于克服种子休眠及缩短育种周期，克服远缘杂交中杂种胚的败育等问题，尤 其在桃上应用较多，其它如苹果、梨、柑桔、山楂、李、杏、樱桃和西瓜上均获得了成功。胚珠培养在柑桔上得到 了植株。花药培养是为了获得单倍体植株，在苹果、草莓、葡萄、梨、桃、杏、柑桔、枇杷、西瓜上获得了成功。 器官培养中有叶培养、胚轴培养、果肉培养、汁囊培养、子叶培养、茎段培养等都获得了成功。如日本用樱桃叶、 葡萄叶培养得到了生根植株，有人用石榴叶培养也得到了成功。原生质体培养，在柑桔、猕猴桃、苹果上已获得成 功，细胞融合杂交，日本国立果树试验场用桃细胞间杂交，已获得融合细胞；日本安艺津果树农场用枸桔和甜橙属 间细胞杂交，培育出细胞融合的杂种植株，已移入温室，镜检证明为四倍体。组织培养还用于种质保存和抗盐性育 种等方面。 二.组织培养的实际应用 包括的内容较多，其主要方面有以下几点： 1无性系变异的诱导与选择： 无性系变异包括体细胞无性系和配子无性系两个方面。通常情况下，要获得无性系变异，关键在于诱导不 定芽或无性胚的发生。果树作物诱导不定芽或无性胚比较困难。自从陈维伦（1979）利用苹果砧木M9茎段愈伤组织 诱导获得新梢后，这方面逐渐取得了较大进展。 一般情况下，利用果树茎尖进行离体繁殖的过程中，可能发生基因的突变，尤其是利用愈伤组织诱导新梢 的过程，可以显著提高突变频率。因此，组织培养本身往往就是新的意想不到的遗传变异的丰富来源。 除了在组织培养过程中，无性系自然变异外，人们有意识地在培养过程中加入某种诱变条件，大大提高了 变异频率。傅润民等（1990）用苹果、葡萄试管苗茎尖进行CO60 射线处理，找出了适宜的处理方法。张德民等 （1990）用山楂茎尖进行射线处理，通过对继代培养的一代和二代材料的酯酶电泳分析，认为同工酶可作用鉴别突 变的指标。郑永年等（1988）在草莓上也用类似方法获得了草莓的同质突变体。英国东茂林试验站，在诱导苹果叶 片再生新梢前用X射线进行照射处理，将再生新梢形成的植株栽植田间进行观察，但尚未见到有明显变异。日本将 秋水仙素加入培养基诱发葡萄变异，已得到生根的变异植株。 试验体系。 2.原生质体培养和细胞融合：
植物原生质体由于没有细胞壁的物理障碍，可以摄入大分子和细胞器，对导入外源遗传物质极为有利，而且原生质体可以再生植株，这就为离体筛选突变体、人工诱导避免产生嵌合体、细胞融合及遗传转化等提供了良好的试验体系。果树原生质体培养获得再生植株的落叶果树主要有苹果、梨、李、桃、葡萄、樱桃、扁桃和杏等。常绿果树主要是柑桔类研究较多。AnitaWallin和LarsJonansson（1989）用圆柱形苹果品种A1583XMclntosh的叶片分离原生质体，经诱导分化培养获得苹果再生植株。E.M.Patat-0chatt等（1988）利用苹果砧木M9、MM106和斯巴坦苹果的叶片及实生品种勃来姆的叶片、愈伤组织和细胞悬浮液作原生质体分离培养，均得到了再生植株。S.J.0chatt等（1988）先后利用野生梨和梨的叶片分离原生质体，经分化培养获得了再生植株。他们还成功地用Colt樱桃组培苗叶片原生质体、Colt樱桃组培苗的叶片、根的愈伤组织和悬浮培养的细胞分离的原生质体获得了再生植株。蔡起贵（1991）用美味猕猴桃组培苗的幼叶、叶柄及幼茎段诱导产生的愈伤组织分离原生质体，经培养获得了再生植株。M.M.01iveira等（1991）用海瓦德猕猴桃叶片愈伤组织长期培养的悬浮细胞分离原生质体培养，亦得到了再生植株。Button等（1975)用柑桔的胚性愈伤组织分离出了原生质体。Vardi等(1975)获得了原生质体再生的胚状体，后来得到了再生植株（Vardi，J977；Vardi等，1982)。至今，全世界已从柑桔类20个种与品种中获得了原生质体再生植株。利用原生质体进行细胞融合在柑桔上的研究进展较大。。Ohg一awara等(1985)最先获得柑桔属与其亲缘属积的体细胞杂种。随后Vardi等（1987）和Grosser等（1987：1988b，1988c)均报道获得了柑桔体细胞杂种或胞质杂种。目前，日本、以色列及美国等这方面均获得成功，已得到种间体细胞杂种7个，属问13个。我国华中农业大学采用金柑和粗柠檬叶肉原生质体为亲本，分别与伏令夏橙和哈姆林甜橙胚性愈伤组织原生质体融合，已获得杂种植株，经染色体和同工酶鉴定，证明大多数植株为体细胞杂种。3.染色体工程技术染色体是遗传基因的载体，一直受到研究者们的重视。随着组织培养技术的发展，已在多种果树上获得了单倍体、多倍体和非整倍体植株。我国在果树上通过花药培养获得单倍体的研究已走在了世界前列。目前已获得了苹果、葡萄、子、柑桔、荔枝、龙眼等花粉植株。有了这些纯系，就可准确地选配亲本进行杂交，并提高对杂种后代的预见性。就可进行品种间杂交，或直接利用纯系间的杂种优势。多倍体可以通过组织培养、化学诱变，有性杂交及细胞融合等途径获得。在果树上，黄贞光等（1982)用猕猴桃胚乳培养获得了胚乳植株，经鉴定证明是三倍体，2n=3x=87.毋锡金等（1981)培养金冠、红玉苹果的胚乳获得了植株，经鉴定，根尖细胞染色体数多于35的非整倍体细胞十分普遍，而有三倍染色体的细胞不多见（约2%3%）。赵惠详等用锦丰架胚乳培养得到了植株，经鉴定，细胞染色体倍数性极不稳定，是由多种染色体数目的细胞组成的嵌合体。王大元（1978)用柑桔、孟新法（1981)用桃也得到了胚乳植株。石荫坪等（1986，1987)用秋水仙碱试管诱变苹果7个二倍体品种自然授粉的胚，通过离体分化培养，获得了植株，经鉴定得到24个稳定的四倍体株系，部分植株已移入果园。4.基因工程技术把从细胞中分离出来的基因，经纯化后直接使用，或用化学物质，或用酶人为地使之发生变化，形成新的遗传信息，然后再将其导入到细胞中，得到具有新的遗传信息的细胞，这种基因工程技术是目前生物技术研究的一个热点。据报道，现已提取出抗病毒、抗虫、抗冻、抗除草剂、矮化及固氮等基因。基因导人，通常有两种方法：一种是将外源DNA片断直接引入细胞中，如利用基因枪或利用授粉后花粉管的通道将DNA片断直接注入。另一种是用农杆菌作基因载体，将外源基因导人细胞中。在果树上，已有的研究报道多采用后一种方法。就世界范围来看，果树的基因转移研究，美国、新西兰开展较多，其次是英国、加拿大等国。目前已经在核桃、桃、李、猕猴桃、苹果、草莓、葡萄、番木瓜、扁桃等树种上成功地获得了转基因植株。Ca!eHMcgranah等（1988)用核桃无性胚接种带有PCGN200,594质粒的农杆菌，得到了世界上第一个来自无性胚的转基因植株。AbhayaM.Dadekar等（1988)用几个核桃品种及其杂种一代的微繁无性系，接种带有PTiAb和PTiAb质粒的农杆菌，得到了具有外源基因的瘤状组织。R.Scorza等（1991)用带有复合质粒的农杆菌6044接种桃的叶片和胚愈伤组织，得到了转基因植株。F.A.Hanmerschlag等（1989)报道了用桃原生质体和叶等幼嫩组织作基因转移的情况，随后又用微繁的桃嫩茎接种带有PTiAb质粒的农杆菌，得到了具有外源基因的瘤状组织。S.Mante等（1990)用李的下胚轴切片，接种带有PCGH7001或PCGH7314质粒的农杆菌，得到了转基因植株。新西兰从一种小果实的红肉猕猴桃中分离，提取出控制红肉的基因，然后转移到大果品种中，现已得到了一个果重708以上的红肉猕猴桃，这是世界上第一个有实用价值的转基因果树。除此之外，新西兰还在苹果上从事控制成熟期基因的研究。D.J.James等（1989)在世界上第一个得到了苹果转基因植株，其他学者在苹果砧木，樱桃上还试验了能产生瘤的标记基因转移，均得到了转基因瘤个体。在梨上也得到了同样结果。NarenderS.Nehra等（1990）和G.Jclenkovic等（1990）分别用草莓叶片和茎节切片、胚轴作材料，接种带有P81121和PGV3850：1103质粒的农杆菌，均得到了转基因植株。T.J.Baribault等（1989)用葡萄悬浮细胞与带有PGV3850:1103质粒混合体，或带有双体媒介PGA474-68质粒的农杆菌，进行共培样，均得到了对卡拉霉索具有抗性的组织，并已证实是稳定结合和表达
植物原生质体由于没有细胞壁的物理障碍，可以摄入大分子和细胞器，对导入外源遗传物质极为有利，而且 原生质体可以再生植株，这就为离体筛选突变体、人工诱导避免产生嵌合体、细胞融合及遗传转化等提供了良好的 试验体系。 果树原生质体培养获得再生植株的落叶果树主要有苹果、梨、李、桃、葡萄、樱桃、扁桃和杏等。常绿果树 主要是柑桔类研究较多。 Anita Wallin和Lars Jonansson（1989）用圆柱形苹果品种A1583 X Mclntosh的叶片分离原生质体，经诱导分化培 养获得苹果再生植株。E .M. Patat-Ochatt 等（1988）利用苹果砧木M9、MM106和斯巴坦苹果的叶片及实生品种 勃来姆的叶片、愈伤组织和细胞悬浮液作原生质体分离培养，均得到了再生植株。S.J.Ochatt等（1988）先后利用 野生梨和梨的叶片分离原生质体，经分化培养获得了再生植株。他们还成功地用Colt樱桃组培苗叶片原生质体、 Colt樱桃组培苗的叶片、根的愈伤组织和悬浮培养的细胞分离的原生质体获得了再生植株。 蔡起贵（1991）用美味猕猴桃组培苗的幼叶、叶柄及幼茎段诱导产生的愈伤组织分离原生质体，经培养获得了再生 植株。M.M.Oliveira等（1991）用海瓦德猕猴桃叶片愈伤组织长期培养的悬浮细胞分离原生质体培养，亦得到了再 生植株。 Button等(1975)用柑桔的胚性愈伤组织分离出了原生质体。 Vardi等(1975)获得了原生质体再生的胚状 体，后来得到了再生植株( Vardi，]977； Vardi等，1982)。至今，全世界已从柑桔类20个种与品种中获得了原 生质体再生植株。 利用原生质体进行细胞融合在柑桔上的研究进展较大。 Ohg—awara等(1985)最先获得柑桔属与其亲缘属枳的体细 胞杂种。随后Vardi等(1987)和Grosser等(1987；1988 b，1988 c)均报道获得了柑桔体细胞杂种或胞质杂种。目 前，日本、以色列及美国等这方面均获得成功，已得到种间体细胞杂种7个，属问13个。我国华中农业大学采用金 柑和粗柠檬叶肉原生质体为亲本，分别与伏令夏橙和哈姆林甜橙胚性愈伤组织原生质体融合，已获得杂种植株，经 染色体和同工酶鉴定，证明大多数植株为体细胞杂种。 3．染色体工程技术 染色体是遗传基因的载体，一直受到研究者们的重视。随着组织培养技术的发展，已在多种果树上获得了单倍 体、多倍体和非整倍体植株。 我国在果树上通过花药培养获得单倍体的研究已走在了世界前列。目前已获得了苹果、葡萄、揪子、柑 桔、荔枝、龙眼等花粉植株。有了这些纯系，就可准确地选配亲本进行杂交，并提高对杂种后代的预见性。就可进 行品种间杂交，或直接利用纯系间的杂种优势。 多倍体可以通过组织培养、化学诱变，有性杂交及细胞融合等途径获得。在果树上，黄贞光等(1982)用猕 猴桃胚乳培养获得了胚乳植株，经鉴定证明是三倍体，2 n=3 x=87．毋锡金等(1981)培养金冠、红玉苹果的胚乳获 得了植株，经鉴定，根尖细胞染色体数多于35的非整倍体细胞十分普遍，而有三倍染色体的细胞不多见(约2％一 3％)。赵惠详等用锦丰梨胚乳培养得到了植株，经鉴定，细胞染色体倍数性极不稳定，是由多种染色体数目的细胞 组成的嵌合体。王大元(1978)用柑桔、孟新法(1981)用桃也得到了胚乳植株。石荫坪等(1986，1987)用秋水仙碱试 管诱变苹果7个二倍体品种自然授粉的胚，通过离体分化培养，获得了植株，经鉴定得到24个稳定的四倍体株系， 部分植株已移入果园。 4．基因工程技术 把从细胞中分离出来的基因，经纯化后直接使用，或用化学物质，或用酶人为地使之发生变化，形成新的遗传信 息，然后再将其导入到细胞中，得到具有新的遗传信息的细胞，这种基因工程技术是目前生物技术研究的一个热 点。据报道，现已提取出抗病毒、抗虫、抗冻、抗除草剂、矮化及固氮等基因。基因导人，通常有两种方法：一种 是将外源DNA片断直接引入细胞中，如利用"基因枪"或利用授粉后花粉管的通道将DNA片断直接注入。另一种是用农 杆菌作基因载体，将外源基因导人细胞中。在果树上，已有的研究报道多采用后一种方法。就世界范围来看，果树 的基因转移研究，美国、新西兰开展较多，其次是英国、加拿大等国。目前已经在核桃、桃、李、猕猴桃、苹果、 草莓、葡萄、番木瓜、扁桃等树种上成功地获得了转基因植株。 Ca!e H Mcgranah 等(1988)用核桃无性胚接种带有PCGN200,594质粒的农杆菌，得到了世界上第一个来自无性胚 的转基因植株。 Abhaya M．Dadekar等(1988)用几个核桃品种及其杂种一代的微繁无性系，接种带有PTiAb和 PTiAb质粒的农杆菌，得到了具有外源基因的瘤状组织。 R. Scorza等(1991)用带有复合质粒的农杆菌6044接种桃的叶片和胚愈伤组织，得到了转基因植株。 F. A. Hanmerschlag等(1989)报道了用桃原生质体和叶等幼嫩组织作基因转移的情况，随后又用微繁的桃嫩茎接种带有 PTiAb 质粒的农杆菌，得到了具有外源基因的瘤状组织。 S. Mante等(1990)用李的下胚轴切片，接种带有PCGH7001或PCGH7314质粒的农杆菌，得到了转基因植株。 新西兰从一种小果实的红肉猕猴桃中分离，提取出控制红肉的基因，然后转移到大果品种中，现已得到了 一个果重708以上的红肉猕猴桃，这是世界上第一个有实用价值的转基因果树。除此之外，新西兰还在苹果上从事 控制成熟期基因的研究。 D. J. James等(1989)在世界上第一个得到了苹果转基因植株，其他学者在苹果砧木，樱桃上还试验了能 产生瘤的标记基因转移，均得到了转基因瘤个体。在梨上也得到了同样结果。 Narender S. Nehra等(1990)和G．Jclenkovic等(1990)分别用草莓叶片和茎节切片、胚轴作材料，接种带 有P81121和PGV3850:1103质粒的农杆菌，均得到了转基因植株。 T. J. Baribault等(1989)用葡萄悬浮细胞与带有PGV3850:1103质粒混合体，或带有双体媒介PGA474-68质粒的农杆 菌，进行共培样，均得到了对卡拉霉索具有抗性的组织，并已证实是稳定结合和表达
宠天智和J.C.Sanford（1989）用番木瓜的叶块、茎、叶柄，接种带有PTiB653：PMOH200质粒的农杆菌，均得到了转基因植株，转移率达80%以上。T.M.Grezie（1990)首次将高速粒子轰击机用于扁桃，对活体植株分生细胞实行基因转移成功。在建立基因图谱方面，美国、日本和英国纷纷投入巨资，从事作物抗旱基因结构，水稻、小麦和玉米基因定位图的研究，我国也从事了水稻基因定位图的研究。在果树方面，美国从事了苹果和葡萄基因定位图的研究，新西兰主要研究苹果和猕猴桃的基因定位图，寻找控制主要性状的基因位点，并通过对亲子代性状的分析，找出亲子代性状的连锁关系，为杂种实生苗的预先选择和最佳杂交组合的选配奠定基础。5.在良种快速繁殖方面目前植物组织培养在生产上应用最有成效的领域就是快速繁殖。一年当中，从理论上计算，较常规繁殖速度可快几十万倍。美国用组织培养方法繁殖苹果矮化砧、草莓、梨及樱桃试管苗，一年可繁殖50万株。这方面世界上很多国家都已用于生产实际，效果明显，这里不再赞述。6.在病毒的消除方面目前柑桔、草莓、菠萝、香蕉、苹果、葡萄、桃、番木瓜等果树的茎尖培养均获得了成功。柑桔、苹果、葡萄、桃和草莓的茎尖培养技术已用于生产。柑桔的无病毒苗木最早还是通过实生播种的珠心苗而得到的。对于单胚品种来说，由于没有珠心胚，实生播种长出的苗都是合子苗，后代因重组和分离造成遗传性不稳定，因而无法通过实生播种获得遗传性稳定的无病毒苗木。1969年美国的RanGan等培养授粉后100天左右的单胚品种柚、坦普尔柑、庞德罗萨柠檬的珠心组织，得到了无病毒苗木。然而，1977年美国的Button等又培养了无核品种华盛顿脐橙的珠心组织，获得了无病毒植株，从而解决了各种类型柑桔的无病毒苗木的培养问题。但是由于种子部分的组织都是童期的，因而由它们分化来的植株进入开花结果期晚，影响了生产上的应用。后来有人改用微茎尖嫁接技术获得了度越童期的柑桔无病毒苗木。其具体做法是：在无菌条件下，从度越了童年期的成年相桔幼嫩技上用显微操作法取出仅带1一3片叶原基的茎尖约1mm)，将此茎尖嫁接于试管中萌发的幼嫩积砧上，嫁接成活率达40%。经鉴定此培养物不带衰退病，裂皮病等病毒病，甚至连热处理不能去除的Dweet（甜橙）斑纹病毒（Mottlevirus）也可通过茎尖嫁接得到排除，而且移到王中后的第二年即能开花，此项技术已与热处理结合被纳入美国柑桔品种改良规划中，作为获得无病毒柑桔苗木的一项重要生产措施。此法同样可用于苹果等果树。另外，香蕉的侧芽经热处理和培养诱导生根，没有检查到CMV及其它病毒。草莓的茎尖培养物产生的小植株经鉴定排除了黄边（yeIIowedge)，黄脉（veinchlorosit），叶脉条带（veinbanding）等病毒病。菠萝经组织培养，排除了一些未经专门命名的病毒病。通过组织培养获得无病毒苗木的技术，现在已扩大到获得无病毒苗木（即无细菌或其它病害），在使用上不仅限于增产目的，而且正在扩大到国际品种交换和种质资源保存方面。当然，利用组织培养技术获得无病毒苗木还必须与植物病毒和病害鉴定技术相结合，因为有个别病毒还不能通过茎尖培养予以消除。7.在种质资源保存方面目前果树资源保存已引起了国内外有关科学工作者的注意，许多国家都有专门搜集保存资源的试验站（种质库）。由于大多数果树资源并不处于直接利用的状态，因而需耗费许多财力和土地才能保存这些植株。目前国外正在研究用组织培养技术作为保存资源的一种手段，如需用地1公项（1万平方米）保存葡萄品种，现用茎尖组织培养，仅需2平方采的面积便可保存15年。美国现在用组织培养法保存柑桔种质资源方面颇有成效。除此之外，还有离体受精以及生长发育与激素的调控等。相信随着生物技术的迅速发展，将会为果树品种的改良开辟更多的新途径，促进现代果树育种学的发展。二茎尖培养的技术要点1一、茎尖培养在果树育种上的应用1）速繁殖良种果树业的迅速发展需要大量优质苗木：良种更新换代频繁，特别是新育成品种，良种母树少，短期内要求提供大量良种苗木，按照传统繁殖方法难以达到这个要求。而利用茎尖离体培养育苗法，可有效地应用于快速繁殖推广良种。2)培育无病毒苗木果树病毒病种类多，危害大，严重影响果树业的发展。按病毒在植物体内分布不均的理论，利用茎尖分生组织离体培养，有可能排除果树长期无性繁殖积累于体内的病毒。通过茎尖脱毒途径，目前已获得柑桔、草菇、香蕉、苹果、番木瓜和罗汉果等无病毒果菌。柑桔和草菇的无病毒菌已应用于生产。3）诱发突变体植物组织与细胆离体培养过程经常诱发各种类型的突变。据统计悬浮细胞培养自发突变率为10一5一10一4（王敬驹，1984)，这些广泛的变异为育种提供丰富的选择基础。利用组织培养技术结合诱变处理，可以大大提高变异率，而且有可能避免或减少嵌合体干扰，提高诱变效果。4)种质的保存与交换由于果树体积大，通常采用种植保存，需要占用大量土地与劳力，耗资大；对资源交换不便，检疫手续复杂。利用茎尖培养法，在试管内保存种质资源，大大节省人力，物力和土地，而且方便种质资源交换，避免病虫传播扩散，防止资源丢失，是值得采用的保存方法。2茎尖培养技术要点1）建立无菌株系无菌营养系的建立是快速繁殖良种的重要环节。首先对接种的外植体要严格选择，挑选种性优良，树体健康，无病虫害，生长健壮发育饱满的芽条，进行灭菌消毒处理。对于含酚类物质较多的外植体，可将切取的材料浸入维生索液中处理，或空培养基中加入抗氧化剂，抑制组织切口氧化变褐。接种材料抽芽后，可初步繁殖一些芽窘备用。2外植体的增殖通常外植体的增殖有三种形式c促使萌发腋芽：形成不定芽：产生胚状体。这三种增殖方式中，萌发腋芽的增殖率可能最低，因为每次增殖的芽苗数量受腋芽数目限制。不定芽的形成具有较大的增殖率，因为继代培养的外植体，其许多部位都可能诱发不定芽。而胚状体的繁殖方式具有最大的增殖潜力，并产生完
庞天智和 J. C. Sanford(1989)用番木瓜的叶块、茎、叶柄，接种带有PTiB653：PMOH200质粒的农杆 菌，均得到了转基因植株，转移率达80％以上。 T．M．Grezie(1990)首次将高速粒子轰击机用于扁桃，对活体植株分生细胞实行基因转移成功。 在建立基因图谱方面，美国、日本和英国纷纷投入巨资，从事作物抗旱基因结构，水稻、小麦和玉米基因 定位图的研究，我国也从事了水稻基因定位图的研究。在果树方面，美国从事了苹果和葡萄基因定位图的研究，新 西兰主要研究苹果和猕猴桃的基因定位图，寻找控制主要性状的基因位点，并通过对亲子代性状的分析，、找出亲 子代性状的连锁关系，为杂种实生苗的预先选择和最佳杂交组合的选配奠定基础。 5．在良种快速繁殖方面 目前植物组织培养在生产上应用最有成效的领域就是快速繁殖。一年当中，从理论上计算，较常规繁殖速度可 快几十万倍。美国用组织培养方法繁殖苹果矮化砧、草莓、梨及樱桃试管苗，一年可繁殖50万株。这方面世界上很 多国家都已用于生产实际，效果明显，这里不再赘述。 6．在病毒的消除方面 目前柑桔、草莓、菠萝、香蕉、苹果、葡萄、桃、番木瓜等果树的茎尖培养均获得了成功。柑桔、苹果、葡萄、桃 和草莓的茎尖培养技术已用于生产。 柑桔的无病毒苗木最早还是通过实生播种的珠心苗而得到的。对于单胚品种来说，由于没有珠心胚，实生 播种长出的苗都是合子苗，后代因重组和分离造成遗传性不稳定，因而无法通过实生播种获得遗传性稳定的无病毒 苗木。1969年美国的 RanGan等培养授粉后100天左右的单胚品种柚、坦普尔柑、庞德罗萨柠檬的珠心组织，得到 了无病毒苗木。然而，1977年美国的 Button 等又培养了无核品种华盛顿脐橙的珠心组织，获得了无病毒植株， 从而解决了各种类型柑桔的无病毒苗木的培养问题。但是由于种子部分的组织都是童期的，因而由它们分化来的植 株进入开花结果期晚，影响了生产上的应用。后来有人改用微茎尖嫁接技术获得了度越童期的柑桔无病毒苗木。其 具体做法是：在无菌条件下，从度越了童年期的成年柑桔幼嫩技上用显微操作法取出仅带 l一3片叶原基的茎尖 (约 l m m)，将此茎尖嫁接于试管中萌发的幼嫩枳砧上，嫁接成活率达40％。经鉴定此培养物不带衰退病，裂皮 病等病毒病，甚至连热处理不能去除的Dweet(甜橙)斑纹病毒( Mottle virus)也可通过茎尖嫁接得到排除，而且移 到土中后的第二年即能开花，此项技术已与热处理结合被纳入美国柑桔品种改良规划中，作为获得无病毒柑桔苗木 的一项重要生产措施。此法同样可用于苹果等果树。另外，香蕉的侧芽经热处理和培养诱导生根，没有检查 到 CMV及其它病毒。草莓的茎尖培养物产生的小植株经鉴定排除了黄边( yeIIow edge)，黄脉（vein chlorosit )，叶脉条带( vein banding)等病毒病。菠萝经组织培养，排除了一些未经专门命名的病毒病。 通过组织培养获得无病毒苗木的技术，现在已扩大到获得无病毒苗木(即无细菌或其它病害)，在使用上不仅 限于增产目的，而且正在扩大到国际品种交换和种质资源保存方面。当然，利用组织培养技术获得无病毒苗木还必 须与植物病毒和病害鉴定技术相结合，因为有个别病毒还不能通过茎尖培养予以消除。 7．在种质资源保存方面 目前果树资源保存已引起了国内外有关科学工作者的注意，许多国家都有专门搜集保存资源的试验站(种质库)。由 于大多数果树资源并不处于直接利用的状态，因而需耗费许多财力和土地才能保存这些植株 。目前国外正在研究 用组织培养技术作为保存资源的一种手段，如需用地 l公顷( l万平方米)保存葡萄品种，现用茎尖组织培养，仅 需2平方米的面积便可保存15年。美国现在用组织培养法保存柑桔种质资源方面颇有成效。 除此之外，还有离体受精以及生长发育与激素的调控等。相信随着生物技术的迅速发展，将会为果树品种 的改良开辟更多的新途径，促进现代果树育种学的发展。 二茎尖培养的技术要点 1一、茎尖培养在果树育种上的应用 1)挟速繁殖良种 果树业的迅速发展需要大量优质苗木；良种更新换代频繁，特别是新育成品种，良种 母树少，短期内要求提供大量良种苗木，按照传统繁殖方法难以达到这个要求。而利用茎尖离体培养育苗法，可有 效地应用于快速繁殖推广良种。 2)培育无病毒苗木 果树病毒病种类多，危害大，严重影响果树业的发展。 按病毒在植物体内 分布不均的理论，利用茎尖分生组织离体培养，有可能排除果树长期无性繁殖积累于体内的病毒。通过茎尖脱毒途 径，目前已获得柑桔、草菇、香蕉、苹果、番木瓜和罗汉果等无病毒果菌。柑桔和草菇的无病毒菌已应用于生产。 3)诱发突变体 植物组织与细胆离体培养过程经常诱发各种类型的突变。据统计悬浮细胞培养自发突变 率为10—5一10—4(王敬驹，1984)，这些广泛的变异为育种提供丰富的选择基础。利用组织培养技术结合诱变处 理，可以大大提高变异率，而且有可能避免或减少嵌合体干扰，提高诱变效果。 4)种质的保存与交换 由于果树体积大，通常采用种植保存，需要占用大量土地与劳力，耗资大；对资 源交换不便，检疫手续复杂。利用茎尖培养法，在试管内保存种质资源，大大节省人力，物力和土地，而且方便种 质资源交换，避免病虫传播扩散，防止资源丢失，是值得采用的保存方法。 2茎尖培养技术要点 1) 建立无菌株系 无菌营养系的建立是快速繁殖良种的重要环节。首先对接种的外植体要严格选择，挑选种 性优良，树体健康，无病虫害，生长健壮发育饱满的芽条，进行灭菌消毒处理。对于含酚类物质较多的外植体，可 将切取的材料浸入维生索液中处理，或空培养基中加入抗氧化剂，抑制组织切口氧化变褐。接种材料抽芽后，可初 步繁殖一些芽窘备用。 2) 外植体的增殖 通常外植体的增殖有三种形式 c促使萌发腋芽；形成不定芽；产生胚状体。这三种增殖 方式中，萌发腋芽的增殖率可能最低，因为每次增殖的芽苗数量受腋芽数目限制。不定芽的形成具有较大的增殖 率，因为继代培养的外植体，其许多部位都可能诱发不定芽。而胚状体的繁殖方式具有最大的增殖潜力，并产生完
整的小植株。作为商业化的良种紧殖，座力求避免产生愈伤组织成苗途径。因为愈伤组织再分化的芽苗，往往产生性状变异，可能出现良种种性不稳定的问题.对于成功的工厂化快速繁殖来说，增殖率是一个重要指标。为了实现在每次继代增殖过程中，产生最大数量的有效紧殖体，必须进行培养基及附加物试验，获得最大紧殖系数的植物生长调节剂配比组合。继代培养间隔的时间，一般以3一4周为宜，不同果树应通过系统试验，确定最高增殖率的转代培养时间。同时还要研究不同材料继代培养次数的最适上限，以便及时采用新建立的无菌株系进行生产。因为随着继代培养次数增加，增殖能力随之下降，变异率会急剧提高。3）芽苗生根与移植外植体大量增殖，通常产生的是无根芽苗。无根芽苗需要诱导生根，采用的生根培养基要降低无机盐浓度，减少糖和琼脂用量，添加吸附剂，如活性炭之类物质，对生根培养有一定作用。无根芽苗经壮苗培养直接进行移菌，可以省略生根培养阶段，对商业化苗木生产，节省工本，缩短试管育苗期有实际意义。试管苗的移植是从“异养”到”自养”的转变过程，移植前试管苗要加强光照，让植株生长健壮，这种炼苗”方法可以提高移植成活率。盆栽的土壤一般用泥炭土、珍珠岩、粗粒状篮石等，将它们按一定比例混合使用。移植后的小菌管理，必须注意控制土壤湿度。掌握光照强度，使小菌逐渐适应外界环境条件。3茎尖培养脱毒方法1)茎尖脱毒的依据过去对果树病毒病的防治收效甚微。最早在1936年KunkeI报μ(Ye1lowvirus)的植34一36℃温度下处理两周，可以使病毒失去生活力。据报道，采用热处理方法对葡萄扇叶病毒，苹果花叶病毒即圆形的病毒或线状的病毒有一定效果。但热处理不能排除所有病毒，同时热处理效果不一，且高温处理极易使材料受损伤，或不能发芽甚至枯死。因此在应用上受到很大限制。More1(1952)发现病毒在植物体内分布不均匀，幼嫩的组织器官含病毒量较低，不带叶原基的生长锥几乎不带病毒.因而可以利用微茎尖进行分离培养脱毒，它与种子脱毒相比，除早结果外，更重要的是能保持母本优良性状。2)茎尖脱毒技术(1)材料预处理通常接种材料先用热处理，使病毒钝化，然后切取较大的茎尖接种，以提高成活蛮。又汰列排除病塞的目的。或格材料稳栽在高温条件下，取生长发育好的新梢？的茎尖接种。（2）切取徽茎尖培养茎尖太大往往容易带病毒，茎尖小带毒量低，但培养成活率低。因此，切取微茎尖时尽量少带时原基。日本下村等（1960）用0.3mm的微茎尖培养，可获得100%的无病毒苗。LuisNavarro等（1975)用柑（1990）1mm微茎尖，或预先热处理的2mm微茎尖培养可获得100%无病毒苗。除柑稿，草莓、罗汉果外，还获得了香蕉（黄瓜花叶病毒，Berg等1974)，（褪绿叶斑病毒，Hsnsenμ(1983），（扇叶病毒，Galzy2972，Iri等，1982，黄斑，斑点和夏季斑驳病毒，Barlass，1982），无（Mul1inaI，1976）等的3)脱毒苗的鉴定通常采用指示植物鉴定，检查脱毒处理得到的苗木是否完全脱毒。或用抗血清鉴定法，这在病毒鉴定中是最有用的方法之一。它是用一种高度专化性的试剂，特异性高，测定的速度快，方法简便。此外，还有电子显徽镜检查法，酶联血清免疫吸附反应(EItSA)，%PCR反应检测技术，可以检测出试管苗所含极少量的病毒，从而使鉴定的灵敏度大大提高。由于脱毒过程高温影响，或微茎尖经愈伤组织分化成苗，后代无性系虽然脱除毒，但可能产生遗传性变异。因此必须进行后代农艺性状鉴定工作。脱毒菌通过鉴定之后，必须建立严格的管理制度进行无病良种的保存、繁殖与推广，防止病毒的再度感染。三胚和胚乳的培养1离体胚培养1)胚培养与育种（1）克服种子休眠，缩短育种周期利用离体胚培养技术，打破种子休眠期，使杂种胚提前萌发成苗，从而缩短果树育种年限。如桃、李等落叶果树，其成熟种子有一段休眠期，通常特种子层积贮存后才能发芽，而采用胚培养技术，可以促进杂i胚提前萌发成苗。(2)克服种子发育不良或中途败育在早熟桃育种中，因果实发育期短，种胚不能完全发育，可以利用胚培养方法，使发育不良的种胚发芽。又如龙眼、荔枝、在酿核品种育种中，可以利用败育前的种胚培养技术，作为酸核品种育种的一种手段。(3）克服多胚品种珠心胚的干扰，培育杂种合子胚，柑搞、杖果、蒲桃等果树具有多胚性，利用胚培养技术，早期分离合予胚培养，可以获得杂种，大大提高杂交育种效率。（4)克服远缘杂交困难，促进远缘杂种发育远缘杂交时，由于不亲和性，不能正常授粉受精，可以采用试管受精，或胚培养技术，使远缘杂交获得成功。(5)诱导胚性愈伤组织，利用幼胚或胚轴，殊心组织等外植体的培养，获得胚性愈伤组织，为原生质体分离、融合或遗传转化提供优质材料。(6)快速繁殖良种砧木离体胚在人工培养条件下，可以产生大量次生胚，加速良种砧本的繁殖；而且胚胎发生技术，也是制作人工种予的重要基础。2离体胚的发育途径（1）．胚脱分化形成愈伤组织离体胚尤其是幼胚，在人工培养下脱分化，形成愈伤组织，特别是生长调节剂浓度高时更为常见。将愈伤组织转人降低生长素等生长调节剂的培养基上，又可能分化出大量胚状体，形成小植株。这种胚性愈伤是建立细胞悬浮培养系，或分离原生质体的良好原始材料。(2)早熟萌发产生畸形芽苗未成熟的幼胚离体培养，往往产生畸形苗，或瘦弱不正常的苗而死亡。这类畸形苗有时可以加以利用，培养变异体作为选种材料
整的小植株。作为商业化的良种繁殖，座力求避免产生愈伤组织成苗途径。因为愈伤组织再分化的芽苗，往往产生 性状变异, 可能出现良种种性不稳定的问题.对于成功的工厂化快速繁殖来说,增殖率是一个重要指标。为了实现 在每次继代增殖过程中，产生最大数量的有效繁殖体，必须进行培养基及附加物试验，获得最大繁殖系数的植物生 长调节剂配比组合。继代培养间隔的时间，一般以3—4周为宜，不同果树应通过系统试验，确定最高增殖率的转代 培养时间。同时还要研究不同材料继代培养次数的最适上限，以便及时采用新建立的无菌株系进行生产。因为随着 继代培养次数增加，增殖能力随之下降，变异率会急剧提高。 3)芽苗生根与移植 外植体大量增殖，通常产生的是无根芽苗。无根芽苗需要诱导生根，采用的生根培养基要降 低无机盐浓度，减少糖和琼脂用量，添加吸附剂，如活性炭之类物质，对生根培养有一定作用。 无根芽苗经壮苗培养直接进行移菌，可以省略生根培养阶段，对商业化苗木生产，节省工本，缩短试 管育苗期有实际意义。 试管苗的移植是从"异养"到"自养"的转变过程，移植前试管苗要加强光照，让植株生长健壮，这 种"炼苗"方法可以提高移植成活率。盆栽的土壤一般用泥炭土、珍珠岩、粗粒状篮石等，将它们按一定比例混合使 用。移植后的小菌管理，必须注意控制土壤湿度。掌握光照强度，使小菌逐渐适应外界环境条件。 3茎尖培养脱毒方法 1)茎尖脱毒的依据 过去对果树病毒病的防治收效甚微。最早在1936年 KunkeI报µ(Ye11ow virus)的 植34—36℃温度下处理两周，可以使病毒失去生活力。据报道，采用热处理方法对葡萄扇叶病毒，苹果花叶病毒， 即圆形的病毒或线状的病毒有一定效果。但热处理不能排除所有病毒，同时热处理效果不一，且高温处理极易使材 料受损伤，或不能发芽甚至枯死。因此在应用上受到很大限制。 Morel(1952)发现病毒在植物体内分布不均匀,幼嫩的组织器官含病毒量较低,不带叶原基的生长锥几乎不带病毒.因 而可以利用微茎尖进行分离培养脱毒,它与种子脱毒相比,除早结果外,更重要的是能保持母本优良性状. 2)茎尖脱毒技术 (1)材料预处理 通常接种材料先用热处理，使病毒钝化，然后切取较大的茎尖接种，以提高成活蛮。 又汰列排除病塞的目的。或格材料稳栽在高温条件下，取生长发育好的新梢？的茎尖接种。 (2)切取徽茎尖培养 茎尖太大往往容易带病毒，茎尖小带毒量低，但培养成活率低。因此，切取微茎尖时尽量 少带时原基。日本下村等(1960)用0．3mm的微茎尖培养，可获得100％的无病毒苗。 Luis Navarro等(1975)用柑 (199O) lmm微茎尖，或预先热处理的2mm微茎尖培养可获得100％无病毒苗。除柑稿，草莓、罗汉果外，还获得了香 蕉(黄瓜花叶病毒， Berg等1974)，(褪绿叶斑病毒， Hsnsenµ(1983)，(扇叶病毒， Galzy2972， Iri等， 1982，黄斑，斑点和夏季斑驳病毒， Barlass，1982)，无(Mullin aI，1976)等的 3)脱毒苗的鉴定 通常采用指示植物鉴定，检查脱毒处理得到的苗木是否完全脱毒。或用抗血清鉴定 法，这在病毒鉴定中是最有用的方法之一。它是用一种高度专化性的试剂，特异性高，测定的速度快，方法简便。 此外，还有电子显徽镜检查法，酶联血清免疫吸附反应(EItSA),¼ PCR反应检测技术，可以检测出试管苗所含极少 量的病毒，从而使鉴定的灵敏度大大提高。 由于脱毒过程高温影响，或微茎尖经愈伤组织分化成苗，后代无性系虽然脱除毒，但可能产生遗传 性变异。因此必须进行后代农艺性状鉴定工作。 脱毒菌通过鉴定之后，必须建立严格的管理制度进行无病良种的保存、繁殖与推广，防止病毒的再 度感染。 三 胚和胚乳的培养 1离体胚培养 1)胚培养与育种 ． (1)克服种子休眠，缩短育种周期 利用离体胚培养技术，打破种子休眠期，使杂种胚提前萌发成苗， 从而缩短果树育种年限。如桃、李等落叶果树，其成熟种子有一段休眠期，通常特种子层积贮存后才能发芽，而采 用胚培养技术，可以促进杂iI胚提前萌发成苗。 (2)克服种子发育不良或中途败育 在早熟桃育种中，因果实发育期短，种胚不能完全发育，可以利用 胚培养方法，使发育不良的种胚发芽。又如龙眼、荔枝、在酿核品种育种中，可以利用败育前的种胚培养技术，作 为酸核品种育种的一种手段。 (3)克服多胚品种珠心胚的干扰，培育杂种合子胚，柑搞、杖果、蒲桃等果树具有多胚性，利用胚培养技 术，早期分离合予胚培养，可以获得杂种，大大提高杂交育种效率。 (4)克服远缘杂交困难，促进远缘杂种发育 远缘杂交时，由于不亲和性，不能正常授粉受精，可以采 用试管受精，或胚培养技术，使远缘杂交获得成功。 (5)诱导胚性愈伤组织 利用幼胚或胚轴，殊心组织等外植体的培养，获得胚性愈伤组织，为原生质体 分离、融合或遗传转化提供优质材料。 (6)快速繁殖良种砧木 离体胚在人工培养条件下，可以产生大量次生胚，加速良种砧本的繁殖；而且 胚胎发生技术，也是制作人工种予的重要基础。 2离体胚的发育途径 (1)．胚脱分化形成愈伤组织 离体胚尤其是幼胚，在人工培养下脱分化，形成愈伤组织，特别是生长 调节剂浓度高时更为常见。将愈伤组织转人降低生长素等生长调节剂的培养基上，又可能分化出大量胚状体，形成 小植株。这种胚性愈伤是建立细胞悬浮培养系，或分离原生质体的良好原始材料。 (2)早熟萌发产生畸形芽苗 未成熟的幼胚离体培养，往往产生畸形苗，或瘦弱不正常的苗而死亡。这 类畸形苗有时可以加以利用，培养变异体作为选种材料
(3）正常胚胎发育途径通常成熟胚在离体培养下，可以正常发育形成小苗。未成熟的幼胚在合适的培养条件下，也可以维持胚性生长，继而进行正常的胚胎发育，完成胚胎发育全过程。从球形胚，心脏形胚，鱼雷形胚，子叶形胚，直至形成小植株。3离体胚培养的方法（1）：种胚培养指成熟胚的培养。由于成熟胚已有胚根和胚芽，一般在含有大量元素的无视盐和蔗糖的培养基上，即可萌发成苗。培养材料的选择，根据胚培养的目的而异，有些早熟品种果实成熟时，胚的发育还不完善，播种不会发芽，通过离体培养方法，可以发育成苗。有些种子中途败育，可在种子败育之前进行培养获得种苗。或有些种子成熟时即休眠，胚培可以缩短休眠期，提早萌发。成熟胚的培养基，一般仅需要提供简单的营养培养基。但对于促进休眠种子萌发，或远缘杂种胚培养，或次生胚的增殖，则需要增加一些有机物，或生长调节剂。一般采用低浓度的生长素，便会促进胚的发育。如赤霉素较广泛应用于促进具有后熟作用的种子萌发，有打破休眠期的作用。胚培的外界条件对胚的生长发育有密切关系。树种不同要求不一，如落叶果树种子有休眠期，因此接种后均需要低温处理，然后转入正常温度培养效果更好。2。原胚培养原胚是指发育阶段处于子叶形成以前的未成熟幼胚，其离体培养技术难度较大，越早期的球形胚，培养越困难，据报道仅柑插已获得成功（图10一1）。原胚培养的主要技术关键：胚的一般成熟胚生长所需条件要求不高。但未成熟的胚，其发育进程不同，要求条件比较复杂，离体培养下则必须提供继续发育相适应的营养条件。根据柑搞胚培研究表明，球形胚的培养与子叶形胚的培养，需要的营养条件和外界环境备不相同，这是原胚培养的技术关键之一。球形胚离体后，为使胚性生长得以继续进行，必须提供与原体相似的环境条件。其中营养培养基的要求，一般除无机盐之外，还需要有微量元素，维生素，氨基酸等。对多数植物来说，改良White，MS培养基都比较适合，另外植物生长情况与pH值都有密切关系。尤其是煎糖浓度，它不仅提供幼胚发育最好的碳源，而且对调整渗透压关系很大。通常在原体内的小球胚，它是生存在较高渗透压的胚乳液里、离体后突然移植于低渗透压的营养培养基中，往往会造成幼胚生长停顿，甚至死亡，必须加以注意。当球形胚离体培养胚器官分化明显时，营养培养基中的蔗糖浓度必须下降，便于胚的继续生长发育。注意对植物生长调节剂使用，促进胚芽或根的生长，并逐步加强光照条件绝2胚乳培养1)胚乳培养与育种胚乳是双受精的产物之一。由于它是一个精核和两个极核融合而成的，，因此，通常是三倍体组织。胚乳培养在果树遗传育种上具有重要意义。通过胚乳培养获得三倍体植株，可能产生无籽果实，在果树生产上有重要的实用价值。胚乳培养再生植株，其染色体有两套来自母体，一套来自父本。因此在杂交育种中，胚乳再生植株的性状与杂种胚发育的植株性状有很大不同，如果树育种和性状遗传规律的研究，提供丰富的材料。近年来，胚乳培养已获得再生植株的果树，有柑桔、批把、枣、苹果、梨、桃和猛猴桃等，为果树无籽果实育种，开辟了一条新的途径。2)培养材料的选择对于未成熟胚乳的培养，选用合适发育期的胚乳进行培养是成功的关键。通常初生胚乳核形成胚乳的方式：有核型胚乳（如苹果、枣、梨、桃、柑描、批把等多数果树），细胞型胚乳（如弥猴桃等）和沼生目型胚乳（菠萝，如核型和细胞型胚乳的中间型）。核型胚乳的发育特点是初生胚乳核，经多次分裂后形成游离核状态，不立刻形成细胞壁。当胚乳核发育到一定阶段，才陆续形成胚乳细胞。对于胚乳的培养，必须在细胞型期进行，而且在细胞型期的某个阶段，分离培养易于成功。不同果树胚乳培养的合适时期，必须进行观测才能确定。为了保证选取合适的材料进行培养，同时义要提高工作效率，必须观测胚乳发育期与幼果外观形态特征的相关性。然后根据外观特征，判断其内部胚乳发育期，便于选择合适的胚乳分离培养。例如，批把幼果外表的黄色绒毛开始脱落，果实表面由黄白色转为绿色时，其内部的胚乳恰好处于旺盛的细胞形状态，可以进行胚乳分离培养。3)胚乳愈伤组织的诱导选取胚乳发育期适宜的幼果或种子，经表面消毒即可切取胚乳培养多数先形成愈伤组织，再诱导分化器官或胚状体，通常使用的基本培养基，有MS，MT，White°Bs等BAO。25mgL与NAAO。5mg/L，KTI。0mg从024—DO.5mgL均可诱导愈伤组织。柑稿胚乳培养用BA0.5—5.0mg从，2，4—D2.Omg儿与CH1000mg从BA0.5mg/L与2，4—D1.Omg/L，或KT0.5m8/L与2，4—D1.Omg儿。批把胚乳培养用BA2.Omg从，2，睡唾—DO。5mg/L，猕猴桃胚乳培养用ZT3.Omg/L，2，4—DO.5一1.Omg/工与CH500mg几2，4一DO.5mg/L，均可诱导愈伤组织。4)器官分化再生植橡胚乳愈伤组织转入分化培养基，从形态发生到再生植株有两条途径。一是产生胚状体发育成苗。另一途径是产生不定芽苗，诱导根形成植株。柑桔和枣等胚乳培养再生植株是通过胚状体途径，将柑桔胚乳愈伤组织，转入MT培养基附加GA2一4mg/L，便诱导出绿色胚状体，并在高浓度的GA（如15mg）下形成植株。苹果和批把等胚乳培养是通过分化不定芽形成植株的途径。此外，在掷猴桃胚乳培养中，采用不同生长索种类可导致不同的分化途径。采用ZT3.Omg/L+NAA0.1mg/L+CH500mg/L的MS培养ZT3.Omg/L与2，4—D1.Omg/L诱导的愈伤组织，转移到ZT1.Omg儿，与CH500mg儿5)胚乳再生植秩的染色体倍性胚乳培养再生植株的染色体，有二倍体、三倍体、多倍体或非整倍体。如苹果胚乳愈伤组织，绝大部分细胞染色体为多倍体和非整倍体，而三倍体细胞仅占2.5%一3.9%。胚乳培养的植株
(3)正常胚胎发育途径 通常成熟胚在离体培养下，可以正常发育形成小苗。未成熟的幼胚在合适的培 养条件下，也可以维持胚性生长，继而进行正常的胚胎发育，完成胚胎发育全过程。从球形胚，心脏形胚，鱼雷形 胚，子叶形胚，直至形成小植株。 3离体胚培养的方法 (1)．种胚培养 指成熟胚的培养。由于成熟胚已有胚根和胚芽，一般在含有大量元素的无视盐和蔗糖 的培养基上，即可萌发成苗。 培养材料的选择，根据胚培养的目的而异，有些早熟品种果实成熟时，胚的发育还不完善，播种不会发 芽，通过离体培养方法，可以发育成苗。有些种子中途败育，可在种子败育之前进行培养获得种苗。或有些种子成 熟时即休眠，胚培可以缩短休眠期，提早萌发。 成熟胚的培养基，一般仅需要提供简单的营养培养基。但对于促进休眠种子萌发，或远缘杂种胚培养，或 次生胚的增殖，则需要增加一些有机物，或生长调节剂。一般采用低浓度的生长素，便会促进胚的发育。如赤霉素 较广泛应用于促进具有后熟作用的种子萌发，有打破休眠期的作用。 胚培的外界条件对胚的生长发育有密切关系。树种不同要求不一，如落叶果树种子有休眠期，因此接 种后均需要低温处理，然后转入正常温度培养效果更好。 2。原胚培养 原胚是指发育阶段处于子叶形成以前的未成熟幼胚，其离体培养技术难度较大，越早期 的球形胚，培养越困难，据报道仅柑插已获得成功(图10—l)。原胚培养的主要技术关键： 胚的 一般成熟胚生长所需条件要求不高。但未成熟的胚，其发育进程不同，要求条件比较复杂， 离体培养下则必须提供继续发育相适应的营养条件。根据柑搞胚培研究表明，球形胚的培养与子叶形胚的培养，需 要的营养条件和外界环境备不相同，这是原胚培养的技术关键之一。 球形胚离体后，为使胚性生长得以继续进行，必须提供与原体相似的环境条件。其中营养培养基的要 求，一般除无机盐之外，还需要有微量元素，维生素，氨基酸等。对多数植物来说，改良 White, MS培养基都比 较适合,另外植物生长情况与 pH值都有密切关系。尤其是蔗糖浓度，它不仅提供幼胚发育最好的碳源，而且对调 整渗透压关系很大。通常在原体内的小球胚，它是生存在较高渗透压的胚乳液里、离体后突然移植于低渗透压的营 养培养基中，往往会造成幼胚生长停顿，甚至死亡，必须加以注意。 当球形胚离体培养胚器官分化明显时，营养培养基中的蔗糖浓度必须下降，便于胚的继续生长发 育。注意对植物生长调节剂使用，促进胚芽或根的生长，并逐步加强光照条件绝 2胚乳培养 1)胚乳培养与育种 胚乳是双受精的产物之一。由于它是一个精核和两个极核融合而成的，’因此，通常是 三倍体组织。 胚乳培养在果树遗传育种上具有重要意义。通过胚乳培养获得三倍体植株，可能产生无籽果实， 在果树生产上有重要的实用价值。胚乳培养再生植株，其染色体有两套来自母体，一套来自父本。因此在杂交育种 中，胚乳再生植株的性状与杂种胚发育的植株性状有很大不同，如果树育种和性状遗传规律的研究，提供丰富的材 料。 近年来，胚乳培养已获得再生植株的果树，有柑桔、批把、枣、苹果、梨、桃和猛猴桃等，为果树 无籽果实育种，开辟了一条新的途径。 2)培养材料的选择 对于未成熟胚乳的培养，选用合适发育期的胚乳进行培养是成功的关键。通常初生 胚乳核形成胚乳的方式：有核型胚乳(如苹果、枣、梨、桃、柑描、批把等多数果树)，细胞型胚乳(如弥猴桃等)和 沼生目型胚乳(菠萝，如核型和细胞型胚乳的中间型)。核型胚乳的发育特点是初生胚乳核，经多次分裂后形成游离 核状态，不立刻形成细胞壁。当胚乳核发育到一定阶段，才陆续形成胚乳细胞。对于胚乳的培养，必须在细胞型期 进行，而且在细胞型期的某个阶段，分离培养易于成功。不同果树胚乳培养的合适时期，必须进行观测才能确定。 为了保证选取合适的材料进行培养，同时又要提高工作效率，必须观测胚乳发育期与幼果外观形态特 征的相关性。然后根据外观特征，判断其内部胚乳发育期，便于选择合适的胚乳分离培养。例如，批把幼果外表的 黄色绒毛开始脱落，果实表面由黄白色转为绿色时，其内部的胚乳恰好处于旺盛的细胞形状态，可以进行胚乳分离 培养。 3)胚乳愈伤组织的诱导 选取胚乳发育期适宜的幼果或种子，经表面消毒即可切取胚乳培养多数先形成愈伤组 织，再诱导分化器官或胚状体，通常使用的基本培养基，有MS， MT， Whiteº Bs等 BA0。25mgL与 NAA0。5mg ／L， KTI。0mg从Ó24—D0．5mgL均可诱导愈伤组织。柑稿胚乳培养用 BA0．5—5．0mg从，2，4—D2．0mg儿 与 CH1000mg从 BA0．5mg／L与2，4—D1．0mg／L，或 KT0．5m8／L与2，4—D1．0mg儿。批把胚乳培养 用 BA2．0mg从，2，唾—D0。5mg／L，猕猴桃胚乳培养用 ZT3．0mg／L，2，4—D0．5一1．0mg／工与 CH500mg 几2，4—D0．5mg／L，均可诱导愈伤组织。 4)器官分化再生植橡 胚乳愈伤组织转入分化培养基，从形态发生到再生植株有两条途径。一是产生胚状 体发育成苗。另一途径是产生不定芽苗，诱导根形成植株。柑桔和枣等胚乳培养再生植株是通过胚状体途径，将柑 桔胚乳愈伤组织，转入 MT培养基附加GA2—4mg／L，便诱导出绿色胚状体，并在高浓度的 GA(如15mg )下形成植株。苹果和批把等胚乳培养是通过分化不定芽形成植株的途径。 此外，在掷猴桃胚乳培养中，采用不同生长索种类可导致不同的分化途径。采用ZT3．0mg／L+NAA0.1mg／L+ CH500mg／L的 MS培养ZT3．0mg／L与2，4—Dl.0mg／L诱导的愈伤组织，转移到 ZT1．0mg儿，与 CH500mg儿 5)胚乳再生植秩的染色体倍性 胚乳培养再生植株的染色体，有二倍体、三倍体、多倍体或非整倍体。如苹果 胚乳愈伤组织，绝大部分细胞染色体为多倍体和非整倍体，而三倍体细胞仅占2．5％一3．9％。胚乳培养的植株
其染色体的不稳定性，可能在培养过程，因游离核的增殖，或细胞分裂的异常行为造成，这种染色体数目的变化对于无性紧殖的果树的育种，具有较大的利用价值三花药培养1花药培养的意义花药培养的目的是诱导花粉发育形成单倍体植株，当染色体加倍后可以迅速而简便地获得纯系，对解决果树杂交育种中，多代分离选择周期长的问题具有重要意义。它可以提高选择效果，缩短育种世代。花粉单倍体植株，只具有一套染色体组，不存在相对应的显性和隐性的基因位点，一旦发生基因突变，就会在植株的性状上表现出来，有利于隐性突变体的筛选。同时利用花粉原生质体作为转基因受体，诱导成株易于使目的基因在个体水平上表达，又不会有嵌合体的干扰，而花粉原生质体与体细胞融合，形成体一一配杂种，在果树育种上则更具有利用价值。此外，利用花粉培养技术还可以进行果树各种性状遗传研究。正由于这些特点，花粉培养技术，成为果树遗传育种家们十分感兴趣的研究课题之一。1953年Tuleck用银Guha和Mabeshwari(1964)阐述1966年证实了这种胚状体的单倍体特性，以及它的起源是来自未成熟的花粉，从此开创了利用花粉？培育单倍体的新途径。近30年来已有二百余种植物，利用花药与花粉培养出单倍体植株。果树方面有柑稿、苹果、葡萄、草葱、荔枝和龙眼花药培养单倍体获得成功。2花药培养的方法1)花药离体手术在花药接种之前，预先要检测确定花粉发育期，并找出花粉发育期和花蕾大小的相应关系，便于接种。接种时必须把花药平放于培养基上，使其与培养基直接接触，这样培养基中营养物质，通过渗透作用被花药吸收，诱导花粉发育。如果花丝将花药撑起而离开培养基，花粉便不会发育。实验表明生长调节剂不能通过花丝而传递。花药接种后即移入20一30C的培养室中培养。2)离体培养下花粉发育的途径(1)(2)这两种方式之间并不存在绝对的界限，如苹果花药培养中，有的是形成愈伤组织成苗，也有直接发育胚状体成苗。这可能与培养基中的生长索浓度等有关，如生长索浓度高，则趋向于形成愈伤组织。3培养基及其作用花药培养中所用的基本培养基因果树种类不同而异：通常以MS基本培养基最为普遍。一般花药培养基本培养基的要求不是那么严格，但有些成分显得特别重要。如蔗糖不仅为外植体提供生长发育所必需的碳源，而且可以调整培养基的渗透压，有利于花粉的发育。根据柑桔花药培养基试验认为，高浓度蔗糖对花药壁的愈伤组织产生有一定的抑制作用，并有利于花粉的发育。诱导花粉发育之后应转移到低浓度的蔗糖培养基上才有利于小抱子继续生长。铁盐以蜜合物形式最为有效，它对花粉植株的诱导是不可缺少的。如在烟草花药培养中，去掉H培养基中的铁盐，则不产生小植株。Nitsch°White培养MS和H培养基低，在烟草花药培养中诱导效果较差，但把铁盐浓度提高到MS的水平，用NitschWhite培养MS或H培养基相同水平。植物生长调节剂，特别是生长索和细胞分裂索已成功地应用于雄核发育的诱导，培养基中生长索的存在，有利手细胞迅速增殖和愈伤组织的形成。苹果等木本果树花药培养的成功例子表明，高浓度的细胞激动索和低浓度的生长索或两者均为低浓度，有利于器官的分化。植物花药培养中对外源生长索和细胞分裂素的要求不一，这与花药组织内源激素水平有关。4)花药壁的作用目前在花粉植株诱导中，直接利用花粉粒诱导再生植株的植物还不多，在许多情况下，仍利用花药培养诱导花粉植株发育，表明花药壁在小袍子发育早期起一定作用。Shorp(1972)用番3诱导花粉植株的影响因素1)不同材料的效应柑桔花药培养实验表明，不同柑桔品种诱导效果不一。在相同的条件下有的品种诱导成功，有的则未能被启动。不同花期的花药诱导花粉胚状体的效应也有差别。在苏柑花药培养中，早期花蕾，诱导成功花粉植株；晚期花蕾，用相同的条件培养未形成胚状体。四季桔从青壮年树上取花蕾，其花药培养诱导的花粉植株比老树上的花蕾诱导率高。花药培养中，小抱子的发育期不是任何时候都可以诱导。葡萄、积壳花粉发育在四分体时期，花药培养诱导率最高。而柑桔、苹果、草蓉等花粉植株则是单核中、晚期诱导成功的。2)花蕾冷处理的效应许多实验表明花药离体培养之前，将花蕾置于3一4℃温度条件一F处理一段时间，对花粉胚状体的诱导有促进作用。柑桔花蕾用3℃处理5一10天，可提高花粉胚状体的诱导率。K·拉杰塞卡芝等（1979）认为（4℃，72小时）可以提高胚状体形成的频率；而形成的胚需经过4C低温处理2周，才能正常发育成小植株。目前冷处理在花药培养中已被广泛地采用。一般认为，花药培养之前冷处理的作用可以改变花粉的发育方式，增加非典型的有丝分裂的小抱予数量。3)生长调节剂的影响生长调节剂的组合和浓度对花粉胚胎发育是关键因素。柑桔花药培养中，用BA与2，4一D的不同浓度配比表明，在BA1、2、4mg儿的浓度下，随2，4一D的用量的增加，对花粉胚的分化有明显
其染色体的不稳定性，可能在培养过程，因游离核的增殖，或细胞分裂的异常行为造成，这种染色体数目的变化， 对于无性繁殖的果树的育种，具有较大的利用价值。 三花药培养 1花药培养的意义 花药培养的目的是诱导花粉发育形成单倍体植株，当染色体加倍后可以迅速而简便地获得纯 系，对解决果树杂交育种中，多代分离选择周期长的问题具有重要意义。它可以提高选择效果，缩短育种世代。花 粉单倍体植株，只具有一套染色体组，不存在相对应的显性和隐性的基因位点，一旦发生基因突变，就会在植株的 性状上表现出来，有利于隐性突变体的筛选。同时利用花粉原生质体作为转基因受体，诱导成株易于使目的基因在 个体水平上表达，又不会有嵌合体的干扰，而花粉原生质体与体细胞融合，形成体——配杂种，在果树育种上则更 具有利用价值。此外，利用花粉培养技术还可以进行果树各种性状遗传研究。正由于这些特点，花粉培养技术，成 为果树遗传育种家们十分感兴趣的研究课题之一。 1953年 Tuleck用银 Guha和 Mabeshwari(1964)阐述 1966年证实了这种胚状体的单倍体特性，以及它的起源是来自未成熟的花粉，从此开创了利用花粉？培育单倍体的 新途径。近30年来已有二百余种植物，利用花药与花粉培养出单倍体植株。果树方面有柑稿、苹果、葡萄、草葱、 荔枝和龙眼花药培养单倍体获得成功。 2花药培养的方法 1)花药离体手术 在花药接种之前，预先要检测确定花粉发育期，并找出花粉发育期和花蕾大小的相应 关系，便于接种。接种时必须把花药平放于培养基上，使其与培养基直接接触，这样培养基中营养物质，通过渗透 作用被花药吸收，诱导花粉发育。如果花丝将花药撑起而离开培养基，花粉便不会发育。实验表明生长调节剂不能 通过花丝而传递。花药接种后即移入20—30 C的培养室中培养。 2)离体培养下花粉发育的途径 ‘ (1) (2) 这两种方式之间并不存在绝对的界限，如苹果花药培养中，有的是形成愈伤组织成苗，也有直接 发育胚状体成苗。这可能与培养基中的生长索浓度等有关，如生长索浓度高，则趋向于形成愈伤组织。 3)培养基及其作用 花药培养中所用的基本培养基因果树种类不同而异；通常以MS基本培养基最为普遍。一般花 药培养基本培养基的要求不是那么严格，但有些成分显得特别重要。如蔗糖不仅为外植体提供生长发育所必需的碳 源，而且可以调整培养基的渗透压，有利于花粉的发育。根据柑桔花药培养基试验认为，高浓度蔗糖对花药壁的愈 伤组织产生有一定的抑制作用，并有利于花粉的发育。诱导花粉发育之后应转移到低浓度的蔗糖培养基上才有利于 小抱子继续生长。 铁盐以蜜合物形式最为有效，它对花粉植株的诱导是不可缺少的。如在烟草花药培养中，去 掉 H培养基中的铁盐，则不产生小植株。 Nitschº White培养 MS和 H培养基低，在烟草花药培养中诱导效果较差，但把铁盐浓度提高到 MS的水平，用 Nitschº White培养 MS或 H培养基相同水平。 植物生长调节剂，特别是生长索和细胞分裂索已成功地应用于雄核发育的诱导，培养基中生长索 的存在，有利于细胞迅速增殖和愈伤组织的形成。苹果等木本果树花药培养的成功例子表明，高浓度的细胞激动索 和低浓度的生长索或两者均为低浓度，有利于器官的分化。植物花药培养中对外源生长索和细胞分裂素的要求不 一，这与花药组织内源激素水平有关。 4)花药壁的作用 目前在花粉植株诱导中，直接利用花粉粒诱导再生植株的植物还不多，在许多情况 下，仍利用花药培养诱导花粉植株发育，表明花药壁在小袍子发育早期起一定作用。 Shorp (1972)用番 3诱导花粉植株的影响因素 1)不同材料的效应 柑桔花药培养实验表明，不同柑桔品种诱导效果不一。在相同的条件下有的品种诱 导成功，有的则未能被启动。 不同花期的花药诱导花粉胚状体的效应也有差别。在苏柑花药培养中，早期花蕾，诱导成功花粉植株；晚 期花蕾，用相同的条件培养未形成胚状体。四季桔从青壮年树上取花蕾，其花药培养诱导的花粉植株比老树上的花 蕾诱导率高。 花药培养中，小抱子的发育期不是任何时候都可以诱导。葡萄、积壳花粉发育在四分体时期，花药培养诱 导率最高。而柑桔、苹果、草蓉等花粉植株则是单核中、晚期诱导成功的。 2)花蕾冷处理的效应 许多实验表明花药离体培养之前，将花蕾置于3—4℃温度条件—F处理一段时 间，对花粉胚状体的诱导有促进作用。柑桔花蕾用3℃处理5一10天，可提高花粉胚状体的诱导率。 K·拉杰塞卡 芝等(1979)认为(4℃，72小时)可以提高胚状体形成的频率；而形成的胚需经过4 C低温处理2周，才能正常发育成 小植株。目前冷处理在花药培养中已被广泛地采用。一般认为，花药培养之前冷处理的作用可以改变花粉的发育方 式，增加非典型的有丝分裂的小抱予数量。 3)生长调节剂的影响 生长调节剂的组合和浓度对花粉胚胎发育是关键因素。柑桔花药培养中，用 BA 与2，4—D的不同浓度配比表明，在 BAl、2、4mg儿的浓度下，随2，4—D的用量的增加，对花粉胚的分化有明显
影响，特别是与2，4一D的绝对量有关。以0.05一0.1mg从的2，4一D适于花粉胚状体的诱导，超过1.0mg从浓度则形成愈伤组织，而无胚状体的发生。4)培养条件的影响，花药培养与外界环境条件关系密切，尤其是温度条件。在四季摘花药离体培养中，当温度为26一30℃时，无论光照或黑暗，均无胚状体发生。在20“25℃时则出现胚状体，并且在黑暗条件下花粉胚状体的诱导率高。光照条件对花药壁体细胞愈伤组织的产生也有明显的抑制作用。4花药培养在苹果品种改良上的应用中国农业科学院果树研究所自1980年获得苹果元帅品种的花粉植株后，又相继获得了国光、赤阳、金冠、红玉、祝光、富士、新红星共8个主栽品种的花粉植株。经染色体观察和同工酶分析证明其植株起源于花粉。通过生根植株移栽和试管苗嫩枝嫁接，在由间先后成活的有7个品种的花粉植株，仅金冠未移栽成活（薛光荣等，1990）。这些花培植株的繁育过程中，对田间栽培较多的幼龄期元帅花培株系进行了某些植物学性状的观察。结果表明：幼龄期元帅花培植株的植物学性状与原品种元帅之间有显著差异，表现分校多，有针刺，叶片小而薄，茸毛少，有缺刻等野生性状。花培植株不同株系之间也各有所异，说明苹果花培植株当代产生了性状分离。这与某些一年生作物一样，花培植株当代具有多样型表现。这种现象既极大地丰富了苹果种质资源基因库，又有利于从中选优进行苹果品种改良。花培植株经高接后，随树龄增长逐渐向栽培性状转化，进入成龄期后不再分生针刺，叶片变厚，茸毛增多，无缺刻。至1993年元帅花培植株元80一3已自然加倍；并已开花结果，该株系已基本转为栽培性状。与元帅品种相比，表现树体矮小，树冠较开张。其突出的特点：是在韧果期，Bp以短果校结果为主。表现出明显的短枝型性状，明显区别于元帅品种（牛健哲等，1994）。这说明通过花药培养，可以在较短时间内培育出新品种的原始材料。因此，花药培养是果树品种改良的一条新途径。第二节细胞工程一原生质体培养的意义植物原生质体是去掉细胞壁而由质膜包裹着的具有生活力的裸细胞。由于原生质体没有细胞壁包裹，可以进行异源原生质体融合，产生双亲细胞核与质同时结合的体细胞杂种，扩大有性杂交范围：克服远缘杂交中某些障碍，特别是一些不能进行有性杂交的果树，可以进行体细胞杂交获得无性杂种。利用四分体小抱子原生质体与体细胞融合，形成体配结合的三倍体或多倍体杂种，以及“不对称”融合而产生的各种类型的胞质杂种。原生质体还是一个理想的遗传转化的受体。由于它没有细胞壁包裹，可以导入各种外源遗传物质，目的基因，生物大分子或细胞器，产生各种遗传上修饰的细胞，为遗传工程研究和育种开辟新途径。因此，原生质体技术不仅是果树细胞工程的重要组成部分，也是基因工程研究的重要基础。近年来，果树原生质体培养和融合的研究取得了可喜的进展。如柑桔、梨、苹果、楼桃、猛猴桃和批把的原生质体培养已获得再生植株。原生质体融合也已取得突破性进展，柑桔类细胞杂种已有几十种之多，包括种属间的胞质杂种。除柑桔外，其他果树原生质体融合研究则较少报道，仅有野生梨砧木与樱桃杂种砧木的原生质体融合。但毫无疑问，今后果树原生质体的融合研究，必将得到进一步的发展。果树原生质体培养获得再生植株的落叶果树主要有苹果、梨、李、桃、葡萄、樱桃、扁桃和否等。常绿果树主要是柑桔类研究较多。AnitaWallin和LarsJonansson（1989）用圆柱形苹果品种A1583xMclntosh的叶片分离原生质体，经诱导分化培养获得苹果再生植株。E.M.Patat-0chatt等（1988）利用苹果砧木M9、MM106和斯巴坦苹果的叶片及实生品种勃来姆的叶片、愈伤组织和细胞悬浮液作原生质体分离培养，均得到了再生植株。S.J.0Ochatt等（1988）先后利用野生梨和梨的叶片分离原生质体，经分化培养获得了再生植株。他们还成功地用Co1t樱桃组培苗叶片原生质体、Colt樱桃组培苗的叶片、根的愈伤组织和悬浮培养的细胞分离的原生质体获得了再生植株。蔡起贵（1991）用美味猕猴桃组培苗的幼叶、叶柄及幼茎段诱导产生的愈伤组织分离原生质体，经培养获得了再生植株。M.M.01liveira等（1991）用海瓦德猕猴桃叶片愈伤组织长期培养的悬浮细胞分离原生质体培养，亦得到了再生植株。Button等（1975)用柑桔的胚性愈伤组织分离出了原生质体。Vardi等(1975)获得了原生质体再生的胚状体，后来得到了再生植株（Vardi，977；Vardi等，1982)。至今，全世界已从柑桔类20个种与品种中获得了原生质体再生植株。利用原生质体进行细胞融合在柑桔上的研究进展较大。、Ohg一awara等(1985)最先获得柑桔属与其亲缘属积的体细胞杂种。随后Vardi等（1987)和Grosser等（1987；1988b，1988c）均报道获得了柑桔体细胞杂种或胞质杂种。自前，日本、以色列及美国等这方面均获得成功，已得到种间体细胞杂种7个，属问13个。我国华中农业大学采用金柑和粗柠檬叶肉原生质体为亲本，分别与伏令夏橙和哈姆林甜橙胚性愈伤组织原生质体融合，已（Vardi，J977：Vardi等，1982)。至今，全世界已从柑桔类20个种与品种中获得了原生质体再生植株。利用原生质体进行细胞融合在柑桔上的研究进展较大。，Ohg一awara等（1985)最先获得柑桔属与其亲缘属积的体细胞杂种。随后Vardi等（1987）和Grosser等（1987；1988b，1988c）均报道获得了柑桔体细胞杂种或胞质杂种。目前，日本、以色列及美国等这方面均获得成功，已得到种间体细胞杂种7个，属问13个。我国华中农业大学采用金柑和粗柠檬叶肉原生质体为亲本，分别与伏令夏橙和哈姆林甜橙胚性愈伤组织原生质体融合，已获得杂种植株，经染色体和同工酶鉴定，证明大多数植株为体细胞杂种。二、原生质体的制备(一)材料来源原生质体分离材料来源多样，最常用的是叶内细胞和愈伤组织。叶片中的叶肉组织是分离原生质体的经典材料，由于方法简便，并有可能获得大量较一致的原生质体，因此，被广泛地应用于各种植物的原生质体分离研究。但果树叶肉细胞分离原生质体，其分化力较差，因而采用叶肉细胞为分离材料的研究相对较少
影响，特别是与2，4—D的绝对量有关。以0．05—0．1mg从的2，4—D适于花粉胚状体的诱导，超过1．0mg从浓度 则形成愈伤组织，而无胚状体的发生。 4)培养条件的影响 花药培养与外界环境条件关系密切，尤其是温度条件。在四季摘花药离体培养中， 当温度为26—30℃时，无论光照或黑暗，均无胚状体发生。在20‘25℃时则出现胚状体，并且在黑暗条件下花粉胚 状体的诱导率高。光照条件对花药壁体细胞愈伤组织的产生也有明显的抑制作用。 4花药培养在苹果品种改良上的应用 中国农业科学院果树研究所自1980年获得苹果元帅品种的花粉植株后，又相继获得了国光、赤 阳、金冠、红玉、祝光、富士、新红星共8个主栽品种的花粉植株。经染色体观察和同工酶分析证明其植株起源于 花粉。通过生根植株移栽和试管苗嫩枝嫁接，在田间先后成活的有7个品种的花粉植株，仅金冠未移栽成活(薛光荣 等，1990)。这些花培植株的繁育过程中，对田间栽培较多的幼龄期元帅花培株系进行了某些植物学性状的观察。 结果表明：幼龄期元帅花培植株的植物学性状与原品种元帅之间有显著差异，表现分校多，有针刺，叶片小而薄， 茸毛少，有缺刻等野生性状。花培植株不同株系之间也各有所异，说明苹果花培植株当代产生了性状分离。这与某 些一年生作物一样，花培植株当代具有多样型表现。这种现象既极大地丰富了苹果种质资源基因库，又有利于从中 选优进行苹果品种改良。花培植株经高接后，随树龄增长逐渐向栽培性状转化，进入成龄期后不再分生针刺，叶片 变厚，茸毛增多，无缺刻。至1993年元帅花培植株元80—3已自然加倍；并已开花结果，该株系已基本转为栽培性 状。与元帅品种相比，表现树体矮小，树冠较开张。其突出的特点：是在韧果期， Bp以短果校结果为主。表现出 明显的短枝型性状，明显区别于元帅品种(牛健哲等，1994)。这说明通过花药培养，可以在较短时间内培育出新品 种的原始材料。因此，花药培养是果树品种改良的一条新途径。 第二节细胞工程 一原生质体培养的意义 植物原生质体是去掉细胞壁而由质膜包裹着的具有生活力的裸细胞。由于原生质体没有细胞壁包裹，可以 进行异源原生质体融合，产生双亲细胞核与质同时结合的体细胞杂种，扩大有性杂交范围；克服远缘杂交中某些障 碍，特别是一些不能进行有性杂交的果树，可以进行体细胞杂交获得无性杂种。利用四分体小抱子原生质体与体细 胞融合，形成体配结合的三倍体或多倍体杂种，以及"不对称"融合而产生的各种类型的胞质杂种。 原生质体还是一个理想的遗传转化的受体。由于它没有细胞壁包裹，可以导入各种外源遗传物质，目的 基因，生物大分子或细胞器，产生各种遗传上修饰的细胞，为遗传工程研究和育种开辟新途径。因此，原生质体技 术不仅是果树细胞工程的重要组成部分，也是基因工程研究的重要基础。 近年来，果树原生质体培养和融合的研究取得了可喜的进展。如柑桔、梨、苹果、樱桃、猛猴桃和批把的 原生质体培养已获得再生植株。原生质体融合也已取得突破性进展，柑桔类细胞杂种已有几十种之多，包括种属间 的胞质杂种。除柑桔外，其他果树原生质体融合研究则较少报道，仅有野生梨砧木与樱桃杂种砧木的原生质体融 合。但毫无疑问，今后果树原生质体的融合研究，必将得到进一步的发展。果树原生质体培养获得再生植株的落叶 果树主要有苹果、梨、李、桃、葡萄、樱桃、扁桃和杏等。常绿果树主要是柑桔类研究较多。 Anita Wallin和Lars Jonansson（1989）用圆柱形苹果品种A1583 X Mclntosh的叶片分离原生质体，经诱导分化培 养获得苹果再生植株。E .M. Patat-Ochatt 等（1988）利用苹果砧木M9、MM106和斯巴坦苹果的叶片及实生品种 勃来姆的叶片、愈伤组织和细胞悬浮液作原生质体分离培养，均得到了再生植株。S.J.Ochatt等（1988）先后利用 野生梨和梨的叶片分离原生质体，经分化培养获得了再生植株。他们还成功地用Colt樱桃组培苗叶片原生质体、 Colt樱桃组培苗的叶片、根的愈伤组织和悬浮培养的细胞分离的原生质体获得了再生植株。 蔡起贵（1991）用美味猕猴桃组培苗的幼叶、叶柄及幼茎段诱导产生的愈伤组织分离原生质体，经培养获得了再生 植株。M.M.Oliveira等（1991）用海瓦德猕猴桃叶片愈伤组织长期培养的悬浮细胞分离原生质体培养，亦得到了再 生植株。 Button等(1975)用柑桔的胚性愈伤组织分离出了原生质体。 Vardi等(1975)获得了原生质体再生的胚状 体，后来得到了再生植株( Vardi，]977； Vardi等，1982)。至今，全世界已从柑桔类20个种与品种中获得了原 生质体再生植株。 利用原生质体进行细胞融合在柑桔上的研究进展较大。 Ohg—awara等(1985)最先获得柑桔属与其亲缘属枳的 体细胞杂种。随后Vardi等(1987)和Grosser等(1987；1988 b，1988 c)均报道获得了柑桔体细胞杂种或胞质杂种。 目前，日本、以色列及美国等这方面均获得成功，已得到种间体细胞杂种7个，属问13个。我国华中农业大学采用 金柑和粗柠檬叶肉原生质体为亲本，分别与伏令夏橙和哈姆林甜橙胚性愈伤组织原生质体融合，已 ( Vardi，]977； Vardi等，1982)。至今，全世界已从柑桔类20个种与品种中获得了原生质体再生植株。 利用原生质体进行细胞融合在柑桔上的研究进展较大。 Ohg—awara等(1985)最先获得柑桔属与其亲缘属 枳的体细胞杂种。随后Vardi等(1987)和Grosser等(1987；1988 b，1988 c)均报道获得了柑桔体细胞杂种或胞质杂 种。目前，日本、以色列及美国等这方面均获得成功，已得到种间体细胞杂种7个，属问13个。我国华中农业大学 采用金柑和粗柠檬叶肉原生质体为亲本，分别与伏令夏橙和哈姆林甜橙胚性愈伤组织原生质体融合，已获得杂种植 株，经染色体和同工酶鉴定，证明大多数植株为体细胞杂种。 二、原生质体的制备 (一)材料来源 原生质体分离材料来源多样，最常用的是叶内细胞和愈伤组织。叶片中的叶肉组织是分 离原生质体的经典材料，由于方法简便，并有可能获得大量较一致的原生质体，因此，被广泛地应用于各种植物的 原生质体分离研究。但果树叶肉细胞分离原生质体，其分化力较差，因而采用叶肉细胞为分离材料的研究相对较 少
愈伤组织及其悬浮细胞具有易承受酶的作用、无菌，无其是通过人工筛选的胚性愈伤组织，增殖性强，胚胎发生率高，分离出的原生质体的再生能力也强，所以，目前应用得更普遍。花粉作为游离原生质体的材料，对果树育种上具有特殊意义。所以直接利用花粉原生质体与体细胞融合培育三倍体，也是分离原生质体的重要研究材料之一。但分离果树花粉原生质体十分困难，而用四分体分离小袍子原生质体则较容易。不同果树种类可能有不同相对适宜的材料，柑桔最适宜材料是珠心产生的胚性愈伤组织，但苹果是叶肉及其愈伤组织悬浮培养物。（二）酶酶混合液中最基本的成分是各种酶类，如果胶酶有PectalyaseY一23活性PectinaseMacerozyme（离析)。其主要成分是果胶酶，作用于细胞间隙的果胶质，使细胞相互分离开来。纤维素酶有OnozukaR一10，R一S，OnozukaR一S的10倍。我国生产的EA：一867的酶活性也较高。纤维素酶主要作用于细胞壁，使细胞壁分解，从而释放出原生质体。此外，还有崩溃酶Driselase是RhozymeHp一150,酶混合液中除各种酶类外，还应有适量的渗透压稳定剂。因为细胞壁一旦去除，裸露的原生质体若处于内外渗透压不同的情况下，就可能立即破裂，必须加入渗透压稳定剂，对原生质体起保护作用。糖、糖醇、盐类或有机物均可作为稳压剂。糖醇是理想的稳定剂，因为它们不易被原生质体所吸收，能保持渗透压的稳定。常用的糖醇有甘露醇和山梨醇。糖类易被原生质体吸收，而使原生质体内外的渗透压产生反差，有可能出现原生质体破坏：不过它对原生质体的培养却有好处。因此，有些研究者采用稍降低醇的浓度，而附加一定的糖，盐类以及pH值稳定剂MES等，如CaC121KHzPO或（三）原生质体的分离方法原生质体分离方法有一步法和两步法之分。一步法即把一定数量的纤维索酶、果胶酶和半纤维素酶等组成混合酶液，将材料放入混合液作一次性处理。两步法则把材料先在果胶酶中处理一定时间，使材料分离成单个细胞，然后在纤维索酶液中去壁。在果树中，只有苹果子叶等少数几个例子应用两步法，多数均采用一步法。不过，有人认为两步法获得的原生质体质量好。取一定量的无菌培养物或灭过菌的植物材料，加入过滤灭菌的酶混合液，在25一30℃暗条件下振荡或静置保育几小时或过夜。用倒置显微镜检查原生质体游离效果。然后用孔径为45Pm左有的尼龙网过滤，去除消解不完全的组织块或细胞团后，经低速离心收集原生质体。用渗透压稳定液再悬浮，冲洗，反复离心3一4次，以纯化原生质体。最后悬浮于合适稳定剂的培养液中备用。原生质体活性检测有多种方法，如观察细胞质环流，活性染料染色，荧光素双醋酸（FDA染色等。原生质体去壁是否干净的检测，可在光学显微镜下观察是否呈圆球形，较常用荧光增白剂（VBL）染色法。三原生质体培养（一）原生质体培养方法培养方法主要有固体培养和液体培养。固体培养常用琼脂或琼脂糖作凝固齐d。匝选择纯度高，溶点低的琼脂，使用浓度为0.4%一0.6%，把原生质体包理在培养基中，琼脂糖块是悬浮在液体培养基中培养。有些报道认为琼脂糖比琼脂效果更好，琼脂糖的溶点低，可减少原生质体损伤。液体浅层培养或液固体双层培养原生质体，操作方便，易于进行培养基的稀释，以降低渗透压，有利于原生质体培养细胞分裂及形成细胞团。原生质体培养的密度也是重要因素，通常以10“一10‘细胞/ml的密度来培养。通过看护原生质体培养诱导愈伤组织，器官分化的条件与原生质体起源的愈伤组织的培养条件基本相同。一般在25一30℃，黑暗或者弱光条件下培养。原生质体培养几小时便开始细胞壁再生，几天后即可形成完整的细胞壁，3一10天开始初次分裂，1一2个月形成肉眼可见的细胞团或愈伤组织。随后调整分化培养基，诱导植株再生。（二）原生质体培养基成分通常用Ms和多种营养配合的KMBP培养基。在培养基中必须注意添加合适的渗透压隐定剂，渗透压高低对原生质体活力有密切关系，一般为0.3一0.7m1从，因果树种类不同而异。而且随着原生质体培养，细胞壁再生与细胞分裂，渗透压要逐渐降低，有利于细胞的生长。通常原生质体培养需要生长调节齐d，其种类和浓度因果树材料而异。但对柑桔胚性愈伤组织起源的原生质体培养，生长调节剂的要求则是例外，甜橙等多种柑桔类原生质体，都可以在不含激素的培养基中培养成功。基本培养基中一些离于浓度过高对细胞分裂有抑制作用。例如硝酸按会阻碍野生梨、西洋梨、樱桃杂种和酸樱桃叶肉原生质体培养细胞分裂，酪阮水解物，泛酸或维生素的存在，有利细胞分化。此外，糖的种类对果树原生质体培养与器官分化也有关，例如由批把原生质体起源的愈伤组织仅在含山梨醇的培养基上，形成茎原基，进而分化茎器官，在煎糖的培养基上，附加各种生长调节剂均未见器官分化。四、原生质体融合（一）原生质体融合的方法1．化学融合法目前最常用的是聚乙二醇(PEG)法。通常将等体积的双亲原生质体悬浮液滴于培养皿中央，随后加入PEG溶液，放置10一29min。再加入高Can，高pH溶液间隔10min，然后用原生质体培养基洗涤数次，便可进行融合原生质体培养。PEGμ1540，40006000，PEG6000的更10%一50%，无种属特性限制。但影响融合频率的因素很多，除PEG本身的纯度和浓度外，原生质体的生理状态与密度也有关系。另有些报道加入伴刀豆球蛋白A15%的二甲基亚砚(DMSO)2.电融合技术电融合（electricfusion）技术
愈伤组织及其悬浮细胞具有易承受酶的作用、无菌，尤其是通过人工筛选的胚性愈伤组织，增殖性 强，胚胎发生率高，分离出的原生质体的再生能力也强，所以，目前应用得更普遍。 花粉作为游离原生质体的材料，对果树育种上具有特殊意义。所以直接利用花粉原生质体与体细胞融 合培育三倍体，也是分离原生质体的重要研究材料之一。但分离果树花粉原生质体十分困难，而用四分体分离小袍 子原生质体则较容易。 不同果树种类可能有不同相对适宜的材料，柑桔最适宜材料是珠心产生的胚性愈伤组织，但苹果是叶肉及 其愈伤组织悬浮培养物。 (二)酶 酶混合液中最基本的成分是各种酶类，如果胶酶有 Pectalyase Y一23活性 Pectinase Macerozyme(离析 )。其主要成分是果胶酶，作用于细胞间隙的果胶质，使细胞相互分离开来。纤维素酶有 Onozuka R—10， R— S， Onozuka R—S的10倍。我国生产的 EA：一867的酶活性也较高。纤维素酶主要作用于细胞壁，使细胞壁分 解，从而释放出原生质体。此外，还有崩溃酶 Driselase是 Rhozyme Hp一150， 酶混合液中除各 种酶类外，还应有适量的渗透压稳定剂。因为细胞壁一旦去除，裸露的原生质体若处于内外渗透压不同的情况下， 就可能立即破裂，必须加入渗透压稳定剂，对原生质体起保护作用。糖、糖醇、盐类或有机物均可作为稳压剂。糖 醇是理想的稳定剂，因为它们不易被原生质体所吸收，能保持渗透压的稳定。常用的糖醇有甘露醇和山梨醇。糖类 易被原生质体吸收，而使原生质体内外的渗透压产生反差，有可能出现原生质体破坏；不过它对原生质体的培养却 有好处。因此，有些研究者采用稍降低醇的浓度，而附加一定的糖，盐类以及 pH值稳定剂 MES等，如 CaC121 KHzPO‘或 (三)原生质体的分离方法 原生质体分离方法有一步法和两步法之分。一步法即把一定数量的纤维索 酶、果胶酶和半纤维素酶等组成混合酶液，将材料放入混合液作一次性处理。两步法则把材料先在果胶酶中处理一 定时间，使材料分离成单个细胞，然后在纤维索酶液中去壁。在果树中，只有苹果子叶等少数几个例子应用两步 法，多数均采用一步法。不过，有人认为两步法获得的原生质体质量好。 取一定量的无菌培养物或灭过菌的植物材料，加入过滤灭菌的酶混合液，在25—30℃暗条件下振荡或 静置保育几小时或过夜。用倒置显微镜检查原生质体游离效果。然后用孔径为45Pm左有的尼龙网过滤，去除消解不 完全的组织块或细胞团后，经低速离心收集原生质体。用渗透压稳定液再悬浮，冲洗，反复离心3—4次，以纯化原 生质体。最后悬浮于合适稳定剂的培养液中备用。 原生质体活性检测有多种方法，如观察细胞质环流，活性染料染色，荧光素双醋酸(FDA)染色等。 原生质体去壁是否干净的检测，可在光学显微镜下观察是否呈圆球形，较常用荧光增白剂(VBL)染色法。 三原生质体培养 (一)原生质体培养方法 培养方法主要有固体培养和液体培养。固体培养常用琼脂或琼脂糖作凝固齐 d。匝选择纯度高，溶点低的琼脂，使用浓度为0．4％一0．6％，把原生质体包埋在培养基中，琼脂糖块是悬浮在 液体培养基中培养。有些报道认为琼脂糖比琼脂效果更好，琼脂糖的溶点低，可减少原生质体损伤。液体浅层培养 或液固体双层培养原生质体，操作方便，易于进行培养基的稀释，以降低渗透压，有利于原生质体培养细胞分裂及 形成细胞团。 原生质体培养的密度也是重要因素，通常以10‘一10‘细胞／ml的密度来培养。通过看护原生质体培 养诱导愈伤组织，器官分化的条件与原生质体起源的愈伤组织的培养条件基本相同。一般在25—30℃，黑暗或者弱 光条件下培养。原生质体培养几小时便开始细胞壁再生，几天后即可形成完整的细胞壁，3一10天开始初次分 裂， l一2个月形成肉眼可见的细胞团或愈伤组织。随后调整分化培养基，诱导植株再生。 (二)原生质体培养基成分 通常用 Ms和多种营养配合的 KMBP培养基。在培养基中必须注意添加合适 的渗透压隐定剂，渗透压高低对原生质体活力有密切关系，一般为0．3—0．7m1从，因果树种类不同而异。而且随 着原生质体培养，细胞壁再生与细胞分裂，渗透压要逐渐降低，有利于细胞的生长。 通常原生质体培养需要生长调节齐d，其种类和浓度因果树材料而异。但对柑桔胚性愈伤组织起源的 原生质体培养，生长调节剂的要求则是例外，甜橙等多种柑桔类原生质体，都可以在不含激素的培养基中培养成 功。 基本培养基中一些离于浓度过高对细胞分裂有抑制作用。例如硝酸按会阻碍野生梨、西洋梨、樱桃杂 种和酸樱桃叶肉原生质体培养细胞分裂，酪阮水解物，泛酸或维生素的存在，有利细胞分化。此外，糖的种类对果 树原生质体培养与器官分化也有关，例如由批把原生质体起源的愈伤组织仅在含山梨醇的培养基上，形成茎原基， 进而分化茎器官，在蔗糖的培养基上，附加各种生长调节剂均未见器官分化。 四、原生质体融合 (一)原生质体融合的方法 1．化学融合法 目前最常用的是聚乙二醇(PEG)法。通常将等体积的双亲原生质体悬浮液滴于培养皿中 央，随后加入 PEG溶液，放置10—29min。再加入高 Can，高 pH溶液间隔10min，然后用原生质体培养基洗涤数 次，便可进行融合原生质体培养。 PEGµ1540，40006000， PEG6000的更10％一50％，无种属特性限制。但影响融合频率的因素很多， 除 PEG本身的纯度和浓度外，原生质体的生理状态与密度也有关系。另有些报道加入伴刀豆球蛋白 A15％的二甲 基亚砚(DMSO) 2．电融合技术 电融合(electric fusion)技术
802一4V，频率为0.5一1MHz。这时便产生电泳效应，使原生质体沿看电场的方向排列成串珠状。然后再给予瞬间的高强度电脉冲，使原生质体膜局部破损而导致融合i一般用的脉冲强度为500一1000VCm20一50fAs。通常一次融合处理，给予几个脉冲，脉冲间隔为1一2s。交变电流强度，处理时间，电脉冲大小，脉冲期宽与间隔等因素，对融合效果都有明显的影响。而且融合效果也因原生质体材料密度等的不同而异。所以在研究每一种新材料时，必须摸索出诸多融合参数。（二）融合体的培养与选择、原生质体经融合处理形成融合体，在特定培养基上进行培养，再生细胞壁。只有双核的同步分裂才会有核的融合，并继续进行融合细胞的分裂，而I?III？完成原生质体融合全过程，才能获得正常发育杂交细胞。一旦产生杂种细胞，便可进一步进行杂种细胞的培养与增殖，形成愈伤组织，分化再生植株。原生质体融合的产物，可能有异源融合的细胞，同源融合的细胞和未融合的再生细胞。为此，必须从原生质体融合的混合群体中，把杂种细胞分捡出来，培养形成体细胞杂种，这是体细胞杂交的重要环节。杂种细胞的选择方法很多，依据细胞生理及遗传上的差异，有互补选择法，如叶绿素缺失互补选择法，生化突变体互补选择法，激素自养互补选择法，抗性互补选择法等。机械分离法如按细胞形态色泽分选法，荧光索标记分选结果，以及由上述方法派生出来的各种方法。这些方法在一些特定的实验系统中，被证明是有效的：但起没有一种成熟的普遍适用的杂种细胞选择方法。对杂种细胞再生植株，可以从形态学，细胞学，遗传学，生化及分子生物学等方面继续进行鉴定选择（图10一2)。第三节基因工程一基因工程研究进展大家知道，信息技术和生物技术将成为21世纪的两个支柱产业。信息产业无疑是下个世纪全球经济中最具活力，最宏大的产业。生物技术是最近十几年来的迅速发展起来的高技新术，具有十分明显的社会效益和经济效益。在所有生物技术领域中，农业生物技术，特别是有关农业生物技术的研究和发展被认为是最有现实意义的技术之一，将在下个世纪出现的”绿色革命”中发挥巨大的作用。在农业生物技术的发展中，利用植物基因工程技术所获得的一系列成果最引人注目，植物基因工程技术是合成或分离一些编码特有性状的基因，并通过生物、物理和化学的方法，导入到受体植物细胞，通过组织培养培育出转基因植物。自1983年科学家们首次利用土壤根癌农杆菌把外源基因导入植物细胞并获得具有卡那霉素抗性的植株以来，植物的基因工程研究进展较快。今，国际上已经获得的转基因植株的植物达84种，其中包括一些具有重要经济价值的果树。千五年来，农业基因工程能或可能解决的问题有目共睹，综述资料很多，下面我仅列出一些主要领域以帮助大家加深认识。1.抗性：抗除草悸、抗病毒、抗虫、抗细菌、抗真菌的转基因植物已进入大田试验，有的已推广：抗盐、抗碱、抗寒、抗旱、抗涝已初见成效；有的已进入大田试验。2.改变性状：改变蛋白质、淀粉、脂肪酸结构以及组成成份的转基因植物已成功，有的已进入大田试验；抗成熟的蕃茄已商品化；雄性不育的转基因作物为广泛利用杂种优势开拓了远景：变棉纤维为棕色、黑色已成功，蓝、红色正在研制中：改变玫现花色的转基因技术已商品化。3.生物反应器：以山羊为生物反应器生产抗凝血酶，转基因绵羊生产的抗α一胰酶将进入I期临床试验：以植物为反应器生产药物、疫苗的研究方兴未艾。4.动物克隆技术：Do11y羊的成功，轰动一时，尽管成功率还很低，约为1/277，但终究是细胞学的一大跃进。今后不仅有助于经济动物和濒危动物的克隆，对农业生产作贡献，也非常有可能为医药或器官移植作贡献。二园艺植物遗传转化技术1园艺植物遗传转化的意义植物遗传转化（PIantgenetictransformation）技术DNA片段导入植物细胞，使之整合，表达并遗传。目前，植物基因工程研究已开始将某些目的基因应用于农作物的品种改良，并取得可喜进展。如在植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗寒、抗旱、提高蛋白质，延缓果实成熟改变花色等等得到了一些转基因植株。为提高作物产量，改良品质，增强抗疫性育种，展示出诱人前景。由于植物基因工程是在分子水平上进行操作，可以按人们的需要，将目的基因通过各种转化途径导人受体细胞。根据植物细胞全能性，培养再生植株，从而实现定向改造植物性状，培育作物新品种。果树转基因技术研究，已成为果树生物技术的热点研究课题之一。目前在多种果树上，以农杆菌介导或将外源DNA直接导入、建立转化系统获得遗传转化植株。如柑插、苹果、树萄、桃、樱桃、葡萄、核桃、蹦猴桃、番木瓜、草薄、李、杏、批把和撤揽等，为进一步开展果树转基因研究，改良果树品种打下基础。二、园艺植物转基因工程的基础目前已克隆出来的目的基因约有100个左右。从用途来看有抗病基因，抗虫基因，抗除草剂基因，抗逆基因，贮存蛋白基因，雄性不育基因，延缓果实成熟基因，固氮基因等。从来源来看，有微生物、动物或植物上分离的目的基因。如黄瓜花叶病毒（CMV）和烟草花时病毒（TMV）的外壳蛋白基因，豌豆抗低温基因，就豆胰蛋白酶抑制剂基因，桃的成熟基因，巴西坚果的蛋白质基因，番木瓜和菠萝蛋白酶基因，柑稿衰退病毒（CTV)的外壳蛋白基因，番木瓜环斑病毒(PRV)的外壳蛋白基因，樱桃卷叶病毒（CIV)卫星RNA基因，玉米色素合成中的还原酶基因，矮牵牛蓝色基因、苏云金芽抱杆菌毒蛋白基因，鱼类抗冻蛋白基因，细菌分离的抗旱基因，豆科和未本科存蛋白基因，不育系和恢复系基因（核糠核酸酶抑制剂基因）C：和C“叶绿素基因（光反应系统I、E反应中心蛋白质基因）等等。这些都为果树基因工程研究和转化应用目的基因的重要来源。另一方面，果树组织与细胞培养已取得显著成果。如茎尖、叶、花、种胚等组织和细胞培养技术相当成熟。梨、苹果、柑插、龙眼、批把等重要果树，原生质体培养再生植株也已取得成功。这些技术为果树基因转化研究奠定了重要基础。三、园艺植物遗传转化的方法
802—4V，频率为0．5一lMHz。这时便产生电泳效应，使原生质体沿着电场的方向排列成串珠状。然后再给予瞬间 的高强度电脉冲，使原生质体膜局部破损而导致融合i一般用的脉冲强度为500一1000V Cm20—50fAs。通常一次融合处理，给予几个脉冲，脉冲间隔为 l一2s。交变电流强度，处理时间，电脉冲大小， 脉冲期宽与间隔等因素，对融合效果都有明显的影响。而且融合效果也因原生质体材料密度等的不同而异。所以在 研究每一种新材料时，必须摸索出诸多融合参数。 (二)融合体的培养与选择 原生质体经融合处理形成融合体，在特定培养基上进行培养，再生细胞壁。 只有双核的同步分裂才会有核的融合，并继续进行融合细胞的分裂，而I?III？完成原生质体融合全过程，才能获 得正常发育杂交细胞。一旦产生杂种细胞，便可进一步进行杂种细胞的培养与增殖，形成愈伤组织，分化再生植 株。 原生质体融合的产物，可能有异源融合的细胞，同源融合的细胞和未融合的再生细胞。为此，必须从原生 质体融合的混合群体中，把杂种细胞分捡出来，培养形成体细胞杂种，这是体细胞杂交的重要环节。 杂种细胞的选择方法很多，依据细胞生理及遗传上的差异，有互补选择法，如叶绿素缺失互补选择法，生 化突变体互补选择法，激素自养互补选择法，抗性互补选择法等。机械分离法如按细胞形态色泽分选法，荧光索标 记分选结果，以及由上述方法派生出来的各种方法。这些方法在一些特定的实验系统中，被证明是有效的；但起没 有一种成熟的普遍适用的杂种细胞选择方法。对杂种细胞再生植株，可以从形态学，细胞学，遗传学，生化及分子 生物学等方面继续进行鉴定选择(图10—2)。 第三节基因工程 一基因工程研究进展 大家知道，信息技术和生物技术将成为21世纪的两个支柱产业。信息产业无疑是下个世纪全球经济中 最具活力，最宏大的产业。生物技术是最近十几年来的迅速发展起来的高技新术，具有十分明显的社会效益和经济 效益。在所有生物技术领域中，农业生物技术，特别是有关农业生物技术的研究和发展被认为是最有现实意义的技 术之一，将在下个世纪出现的"绿色革命"中发挥巨大的作用。在农业生物技术的发展中，利用植物基因工程技术所 获得的一系列成果最引人注目，植物基因工程技术是合成或分离一些编码特有性状的基因，并通过生物、物理和化 学的方法，导入到受体植物细胞，通过组织培养培育出转基因植物。 自1983年科学家们首次利用土壤根癌农杆菌把外源基因导入植物细胞并获得具有卡那霉素抗性的植株以来， 植物的基因工程研究进展较快。迄今，国际上已经获得的转基因植株的植物达84种，其中包括一些具有重要经济价 值的果树。十五年来，农业基因工程能或可能解决的问题有目共睹，综述资料很多，下面我仅列出一些主要领域以 帮助大家加深认识。1.抗性：抗除草悸、抗病毒、抗虫、抗细菌、抗真菌的转基因植物已进入大田试验，有的已推 广；抗盐、抗碱、抗寒、抗旱、抗涝已初见成效；有的已进入大田试验。2.改变性状：改变蛋白质、淀粉、脂肪酸 结构以及组成成份的转基因植物已成功，有的已进入大田试验；抗成熟的蕃茄已商品化；雄性不育的转基因作物为 广泛利用杂种优势开拓了远景；变棉纤维为棕色、黑色已成功，蓝、红色正在研制中；改变玫瑰花色的转基因技术 已商品化。3.生物反应器：以山羊为生物反应器生产抗凝血酶，转基因绵羊生产的抗α-胰酶将进入I期临床试验； 以植物为反应器生产药物、疫苗的研究方兴未艾。4.动物克隆技术：Dolly羊的成功，轰动一时，尽管成功率还很 低，约为1/277，但终究是细胞学的一大跃进。今后不仅有助于经济动物和濒危动物的克隆，对农业生产作贡献， 也非常有可能为医药或器官移植作贡献。 二园艺植物遗传转化技术 1园艺植物遗传转化的意义 植物遗传转化(PIant genetic transformation)技术 DNA片段导入植物细胞，使之整合，表达并 遗传。目前，植物基因工程研究已开始将某些目的基因应用于农作物的品种改良，并取得可喜进展。如在植物抗 病、抗虫、抗除草剂、抗寒、抗旱、提高蛋白质，延缓果实成熟改变花色等等得到了一些转基因植株。为提高作物 产量，改良品质，增强抗疫性育种，展示出诱人前景。 由于植物基因工程是在分子水平上进行操作，可以按人们的需要，将目的基因通过各种转化途径导人受体 细胞。根据植物细胞全能性，培养再生植株，从而实现定向改造植物性状，培育作物新品种。果树转基因技术研 究，已成为果树生物技术的热点研究课题之一。目前在多种果树上，以农杆菌介导或将外源 DNA直接导入、建立 转化系统获得遗传转化植株。如柑插、苹果、树萄、桃、樱桃、葡萄、核桃、蹦猴桃、番木瓜、草薄、李、杏、批 把和檄揽等，为进一步开展果树转基因研究，改良果树品种打下基础。 二、园艺植物转基因工程的基础 目前已克隆出来的目的基因约有100个左右。从用途来看有抗病基因，抗虫基因，抗除草剂基因，抗 逆基因，贮存蛋白基因，雄性不育基因，延缓果实成熟基因，固氮基因等。从来源来看，有微生物、动物或植物上 分离的目的基因。如黄瓜花叶病毒(CMV)和烟草花时病毒(TMV)的外壳蛋白基因，豌豆抗低温基因，就豆胰蛋白酶抑 制剂基因，桃的成熟基因，巴西坚果的蛋白质基因，番木瓜和菠萝蛋白酶基因，柑稿衰退病毒(CTV)的外壳蛋白基 因，番木瓜环斑病毒(PRV)的外壳蛋白基因，樱桃卷叶病毒(CIV)卫星 RNA基因，玉米色素合成中的还原酶基因， 矮牵牛蓝色基因、苏云金芽抱杆菌毒蛋白基因，鱼类抗冻蛋白基因，细菌分离的抗旱基因，豆科和禾本科贮存蛋白 基因，不育系和恢复系基因(核糠核酸酶抑制剂基因) C：和 C‘叶绿素基因(光反应系统 I、 E反应中心蛋白质 基因)等等。这些都为果树基因工程研究和转化应用目的基因的重要来源。 另一方面，果树组织与细胞培养已取得显著成果。如茎尖、叶、花、种胚等组织和细胞培养技术相当成 熟。梨、苹果、柑插、龙眼、批把等重要果树，原生质体培养再生植株也已取得成功。这些技术为果树基因转化研 究奠定了重要基础。 三、园艺植物遗传转化的方法
植物的遗传转化是指利用生物及物理化学等手段，将外源基因导人植物细胞，获得转基因植株的技术。遗传转化的方法有两种类型。（一)外源基因载体转移通过T一DNA载体转移目的基因，可以完整地使之整合到果树基因组上，并得到表达，传递绪后代。如普遍采用根癌农杆菌的Ti质粒及发根农杆菌的Ri质粒为载体的转化系统。其基本原理是：农杆菌在侵染受伤植物细胞时，能将其质粒上的一段DNA（称T一DNA)C1985年Horsoh建A2天后，转至筛选培养基上筛选转化了的细胞，并培养再生植株。采用叶盘法在双子叶植物上取得一定进展。如苹果、草营、葡萄和掷猴桃就是用叶盘法转化再生植株。由于多数木本果树其叶片再生植株比较困难，因而常使用茎尖、胚或胚轴、细胞和原生质体等，尤其是原生质体是最理想的转化受体系统。（二)外源基因转移方法有直接注射法。激光微束穿刺法，脂质体介导法、电击法、PEG法和基因枪法。现重点介绍几种国际上较成熟的导人方法。1.电击法（electroporation）当电大小随条件不同而变化，电场消失后一般小孔会重新封闭。据有关研究报道，当细胞融合时，以高场强（KV/cm)，短时间(Ps)的瞬间电场，细胞产生可逆性穿孔。此时，将外源DNA与细胞共培养可进行基因转化，并形成融合细胞。电击法不仅可以转移DNA，RNA2.PEG·（directgenetransfer）这种PEG（聚乙二醇）诱导基因转移。PEG最初用于原生质体融合，以及摄取细胞器工作。1983年KrenS等首13.3%的PEG浓度中，让烟草原生质体与外源DNA保温30min，获得基因转化植株。PEGXPEG为媒介的直接基因转移，没有明显的宿主限制。3。基因枪转化技术通过一个动力系统，将包有外源DNA的金属颗粒，射入植物材料，所用的金属颗粒直径，一般介于0.6一04fAm之间。当微弹打人或穿过细胞时，微弹上面所携带的外源基因可能进入细胞，整合到染色体上并得到表达，从而实现对植物细胞的转化。这种方法最大的优点，仅需要简单的组织培养技术，不必经过原生质体的制备和培养。另一个优点是无明显的宿主限制，几乎适用于任何受体材料，为果树基因转化工作提供一套简化手段。四园艺植物基因工程研究前景自从1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋结构的模型之后，40年来生物技术取得了飞跃的发展，研究成果获得了广泛的应用，并不断走向产业化。近年来，植物基因工程研究的进展尤为迅速。但果树基因工程方面的研究，起步较晚，相对地说也较为落后。由于果树多数是生育年龄长，遗传基础复杂，重要性状高度杂合，遗传背景研究甚少，因此给果树基因工程研究带来更大困难。但是，正因为果树是多年生，又是采用无性繁殖，不存在后代基因分离，也不必进行多代选育，外源基因一旦被整合到亲本基因组就易于保持。目前，对植物基因工程或果树基因工程已有一定基础。多种果树已建立较好的转化系统。因此，利用基因工程，改良果树品种具有巨大潜力，前景极其广阔。1基因工程对园艺植物遗传改良的潜力我们知道作为一个优良的果树品种，它不仅需要具备优良的果实性状，如果大、着色好、品质优良、耐贮运等，还需要具备优良的园艺性状，如矮化、丰产以及抗病虫害等。而现实情况却通常是园艺性状优良的材料，对病虫害及逆境的抗性差：再者，单就果实性状而言，也常常是品质好，但耐贮性差。所以，把优良的性状结合在一个果树品种上，不仅需要漫长的时间，而且是非常困难的（因果树遗传背景很复杂，杂交后代产生多样复杂的分离）。就果树现有的优良品种和品系来看，都有不尽人意的缺陷。解决这些问题，仅靠常规杂交育是困难的，而基因工程（具有在不改变固有性状的前提下，引入新的性状的能力）成为解决这一难题的新途径。果树的转化和其它一、二年生的作物相比，有看独特的优点，首先就是：一旦一个果树品种被证实转化，而且目的基因如人们所希望的那样表达，那么它就可以通过组织培养、嫁接、或扦插等无性繁殖方式来大量繁殖。其次是：由于果树不通过有性繁殖，所以后代保持性状一致，而且导入的外源基因不会因遗传重组而流失，能保持其稳定性。就目前来看，果树的基因转化技术已经具备了一定的基础，如：常用于转化植物的农杆菌可以感染多种果树：目前已克隆出的多种目的基因已可直接用于果树；转基因果树的转基因性状可通过无性繁殖保留、增殖，外源基因性状易干保持稳定果树基因转化对果树性状改良具很大的潜力，主要表现在下面儿个方面：1.目前分离、克隆的一些杀虫基因，如苏云金杆菌产生的毒蛋白和豇豆胰蛋白酶抑制剂具有较强的杀虫效果，把这些抗虫基因导入果树，有可能帮助解决果树的虫害问题。2.真菌、细菌和病毒对果树生产造成的危害是很大的。目前，植物抗病毒的基因工程中比较成熟的途径是导入病毒外壳蛋白基因。杀菌肽基因在植物中的表达能够提高植物对病原菌的抗病力，导入此基因，有可能使果树对细菌病害产生抗性。（如苹果和梨的火疫病）而基丁质酶基因的导入则有可能提高果树对真菌病害的抗性。3.植物的生根能力和矮化效应主要受基因控制。目前，果树许多木的生根能力都很差，因此一些矮化砖只能用作中间砧。利用RI质粒上具有的促进生根的ro1基因转化果树，以提高发根能力的研究已有报道。生根基因的导入，有可能提高砧未的紧殖系数和利用价值。4.抗冻基因已被转入番茄并表达。把抗冻基因转入果树，有可能大大降低每年冻害给果树造成的严重的经济损失。SOD能提高植物对多种环境胁迫的抵抗能力。编码SOD的基因已经克隆，而且用烟草的Mn-SOD的cDNA转化首宿，获得的转基因植株不对冻害的抵抗能力增强，而且对除剂的抗性也增强。保鲜番茄的研究成功及其上市，为用基因工程的方法控制其它果实的保鲜在技术上铺平了道路。五基因工程可能产生的副作用
植物的遗传转化是指利用生物及物理化学等手段，将外源基因导人植物细胞，获得转基因植株的技术。遗 传转化的方法有两种类型。 (一)外源基因载体转移 通过 T—DNA载体转移目的基因，可以完整地使之整合到果树基因组上，并得 到表达，传递绪后代。如普遍采用根癌农杆菌的 Ti质粒及发根农杆菌的 Ri质粒为载体的转化系统。其基本原理 是：农杆菌在侵染受伤植物细胞时，能将其质粒上的一段 DNA(称 T—DNA)Ç1985年 Horsoh建Á2天后，转至筛选 培养基上筛选转化了的细胞，并培养再生植株。采用叶盘法在双子叶植物上取得一定进展。如苹果、草营、葡萄和 掷猴桃就是用叶盘法转化再生植株。由于多数木本果树其叶片再生植株比较困难，因而常使用茎尖、胚或胚轴、细 胞和原生质体等，尤其是原生质体是最理想的转化受体系统。 (二)外源基因转移方法 有直接注射法。激光微柬穿刺法，脂质体介导法、电击法、 PEG法和基因枪法。现重点介绍几种国际上较成 熟的导人方法。 1．电击法(electroporation) 当电大小随条件不同而变化，电场消失后一般小孔会重新封闭。据有关 研究报道，当细胞融合时，以高场强(KV／cm)，短时间(Ps)的瞬间电场，细胞产生可逆性穿孔。此时，将外源DNA 与细胞共培养可进行基因转化，并形成融合细胞。电击法不仅可以转移 DNA， RNA 2． PEG·(direct gene transfer) 这种PEG(聚乙二醇)诱导基因转移。 PEG最初用于原生质体 融合，以及摄取细胞器工作。1983年 Krens 等首13．3％的PEG浓度中，让烟草原生质体与外源 DNA保温 30min，获得基因转化植株。 PEG× PEG为媒介的直接基因转移，没有明显的宿主限制。 3。基因枪转化技术 通过一个动力系统，将包有外源 DNA的金属颗粒，射入植物材料，所用的金属颗粒 直径，一般介于0．6—0．4fAm之间。当微弹打人或穿过细胞时，微弹上面所携带的外源基因可能进入细胞，整合 到染色体上并得到表达，从而实现对植物细胞的转化。这种方法最大的优点，仅需要简单的组织培养技术，不必经 过原生质体的制备和培养。另一个优点是无明显的宿主限制，几乎适用于任何受体材料，为果树基因转化工作提供 一套简化手段。 四园艺植物基因工程研究前景 自从1953年 Watson和 Crick提出 DNA双螺旋结构的模型之后，4O年来生物技术取得了飞跃的发展，研究成果获 得了广泛的应用，并不断走向产业化。近年来，植物基因工程研究的进展尤为迅速。但果树基因工程方面的研究， 起步较晚，相对地说也较为落后。由于果树多数是生育年龄长，遗传基础复杂，重要性状高度杂合，遗传背景研究 甚少，因此给果树基因工程研究带来更大困难。但是，正因为果树是多年生，又是采用无性繁殖，不存在后代基因 分离，也不必进行多代选育，外源基因一旦被整合到亲本基因组就易于保持。目前，对植物基因工程或果树基因工 程已有一定基础。多种果树已建立较好的转化系统。因此，利用基因工程，改良果树品种具有巨大潜力，前景极其 广阔。 1基因工程对园艺植物遗传改良的潜力 我们知道作为一个优良的果树品种，它不仅需要具备优良的果实性状，如果大、着色好、品质优良、耐 贮运等，还需要具备优良的园艺性状，如矮化、丰产以及抗病虫害等。而现实情况却通常是园艺性状优良的材料， 对病虫害及逆境的抗性差；再者，单就果实性状而言，也常常是品质好，但耐贮性差。所以，把优良的性状结合在 一个果树品种上，不仅需要漫长的时间，而且是非常困难的（因果树遗传背景很复杂，杂交后代产生多样复杂的分 离）。就果树现有的优良品种和品系来看，都有不尽人意的缺陷。解决这些问题，仅靠常规杂交育是困难的，而基 因工程（具有在不改变固有性状的前提下，引入新的性状的能力）成为解决这一难题的新途径。 果树的转化和其它一、二年生的作物相比，有着独特的优点，首先就是：一旦一个果树品种被证实转化， 而且目的基因如人们所希望的那样表达，那么它就可以通过组织培养、嫁接、或扦插等无性繁殖方式来大量繁殖。 其次是：由于果树不通过有性繁殖，所以后代保持性状一致，而且导入的外源基因不会因遗传重组而流失，能保持 其稳定性。 就目前来看，果树的基因转化技术已经具备了一定的基础，如：常用于转化植物的农杆菌可以感染多种果 树；目前已克隆出的多种目的基因已可直接用于果树；转基因果树的转基因性状可通过无性繁殖保留、增殖，外源 基因性状易于保持稳定。 果树基因转化对果树性状改良具很大的潜力，主要表现在下面几个方面： 1．目前分离、克隆的一些杀虫基因，如苏云金杆菌产生的毒蛋白和豇豆胰蛋白酶抑制剂具有较强的杀虫效果，把 这些抗虫基因导入果树，有可能帮助解决果树的虫害问题。 2．真菌、细菌和病毒对果树生产造成的危害是很大的。目前，植物抗病毒的基因工程中比较成熟的途径是导入病 毒外壳蛋白基因。杀菌肽基因在植物中的表达能够提高植物对病原菌的抗病力，导入此基因，有可能使果树对细菌 病害产生抗性。（如苹果和梨的火疫病）而基丁质酶基因的导入则有可能提高果树对真菌病害的抗性。 3．植物的生根能力和矮化效应主要受基因控制。目前，果树许多砧木的生根能力都很差，因此一些矮化砧只能用 作中间砧。利用RI质粒上具有的促进生根的rol基因转化果树，以提高发根能力的研究已有报道。生根基因的导 入，有可能提高砧木的繁殖系数和利用价值。 4．抗冻基因已被转入番茄并表达。把抗冻基因转入果树，有可能大大降低每年冻害给果树造成的严重的经济损 失。SOD能提高植物对多种环境胁迫的抵抗能力。编码SOD的基因已经克隆，而且用烟草的Mn-SOD的cDNA转化苜蓿， 获得的转基因植株不对冻害的抵抗能力增强，而且对除莠剂的抗性也增强。 保鲜番茄的研究成功及其上市，为用基因工程的方法控制其它果实的保鲜在技术上铺平了道路。 五基因工程可能产生的副作用