实验三血清谷丙、谷草转氨酶活力测定-赖氏法一、原理血清中谷丙转氨酶(GPT)或称丙氨酸氨基转移酶(ALT)作用于丙氨酸及a-酮戊二酸组成的基质，产生丙酮酸和谷氨酸。血清谷草转氨酶(GOT)或称天门冬氨酸氨基转移酶(AST)作用于天门冬氨酸及α-酮戊二酸组成的基质，产生草酰乙酸和谷氨酸。草酰乙酸可在反应中自行脱羧成为丙酮酸。丙酮酸与2，4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸2，4-二硝基苯腺，在碱性溶液中显棕红色，在与同样处理的丙酮酸进行比色，计算出酶的单位数。二、 试剂1.磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.4)(1)0.1mol/L磷酸二氢钾：称取无水KH2PO413.61g，加蒸馏水溶解后稀释至1000mL。(2)0.1mol/L磷酸二氢钠：称取Na2HPO4.12H2035.82g，加蒸馏水溶解后稀释至1000mL。取(1)液80mL、(2)液420mL，混匀，即为pH7.4的磷酸缓冲液，贮于冰箱备用。2.1mol/LNaOH：称取NaOH40g，用蒸馏水溶解后稀释至1000mL。3.0.4mol/LNaOH：以lmol/LNaOH稀释。4.谷丙转氨酶基质液(pH7.4）精确称取DL-丙氨酸1.79g和α-酮戊二酸29.2mg，放于小烧杯内，加入少量(约15mL)磷酸盐缓冲液及少量(约0.5~0.8mL)lmol/LNaOH液使其溶解，并调至pH7.4，放人100mL容量
实验三 血清谷丙、谷草转氨酶活力测定——赖氏法 一、原理 血清中谷丙转氨酶(GPT)或称丙氨酸氨基转移酶(ALT)作用于丙 氨酸及a-酮戊二酸组成的基质，产生丙酮酸和谷氨酸。 血清谷草转氨酶(GOT)或称天门冬氨酸氨基转移酶(AST)作用于 天门冬氨酸及α-酮戊二酸组成的基质，产生草酰乙酸和谷氨酸。 草酰乙酸可在反应中自行脱羧成为丙酮酸。 丙酮酸与2，4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙，在碱 性溶液中显棕红色，在与同样处理的丙酮酸进行比色，计算出酶的单位 数。 二、试剂 1.磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.4) (1)0.1mol/L 磷酸二氢钾：称取无水KH2PO4 13.61g，加蒸馏水溶解 后稀释至1000mL。 (2)0.1mol/L 磷酸二氢钠：称取Na2HPO4·12H20 35.82g，加蒸馏水 溶解后稀释至1 000mL。 取(1)液80mL、(2)液420mL，混匀，即为pH7.4 的磷酸缓冲液，贮 于冰箱备用。 2.1mol/L NaOH：称取NaOH 40g，用蒸馏水溶解后稀释至1000mL。 3.0.4mol/L NaOH：以lmol/L NaOH 稀释。 4.谷丙转氨酶基质液(pH7.4) 精确称取DL-丙氨酸1.79g 和α-酮戊二 酸29.2mg，放于小烧杯内，加入少量(约15mL)磷酸盐缓冲液及少量(约 0.5～0.8mL)lmol/L NaOH 液使其溶解，并调至pH7.4，放人100mL 容量
瓶内，用磷酸盐缓冲液定容，4℃冰箱保存。此液每mL含α-酮戊二酸2μmol，丙氨酸200μmol。5.谷草转氨酶基质液(pH7.4)精确称取DL-天门冬氨酸2.66g和α-酮戊二酸29.2mg放于小烧杯内，加1mol/LNaOH溶液约20mL，使完全溶解，并调至pH7.4，放入100mL容量瓶内，用磷酸盐缓冲液定容。4℃冰箱保存。此液每mL含α-酮戊二酸2μmol，天门冬氨酸200μmol。6.24-二硝基苯肼液称取2，4-二硝基苯肼200mg，溶于4mol/LHCL250mL内，待溶解后加蒸馏水到1000mL刻度，盛于棕色瓶内，置冰箱中可用半年以上。7.丙酮酸标准液(1mL>2.0μmol）精确称取纯丙酮酸钠22.0mg，溶于少许pH7.4的磷酸盐缓冲液内，移人100mL容量瓶中，加磷酸盐缓冲液至刻度。临用前新鲜配制。三、操作1.标准曲线的制作GPT和GOT不能共用一个标准曲线，在作标准曲线时，应分别加入基质液。取大试管6支，按表1操作
瓶内，用磷酸盐缓冲液定容，4℃冰箱保存。此液每mL 含α-酮戊二酸 2μmol，丙氨酸200μmol。 5.谷草转氨酶基质液(pH7.4) 精确称取DL-天门冬氨酸2.66g 和α-酮 戊二酸29.2mg 放于小烧杯内，加1mol/L NaOH 溶液约20mL，使完全溶 解，并调至pH7.4，放入100mL 容量瓶内，用磷酸盐缓冲液定容。4℃ 冰箱保存。此液每mL 含α-酮戊二酸2μmol，天门冬氨酸200μmol。 6.2，4-二硝基苯肼液 称取2，4-二硝基苯肼200mg，溶于4mol/L HCL 250mL 内，待溶解后加蒸馏水到1000mL 刻度，盛于棕色瓶内，置冰箱 中可用半年以上。 7.丙酮酸标准液(1mL≈2.0μmol) 精确称取纯丙酮酸钠22.0mg，溶于 少许pH7.4的磷酸盐缓冲液内，移人100mL 容量瓶中，加磷酸盐缓冲液 至刻度。临用前新鲜配制。 三、操作 1.标准曲线的制作 GPT 和GOT 不能共用一个标准曲线，在作标准曲线时，应分别加 入基质液。取大试管6支，按表1操作
表1GOT和GPT标准曲线制作步骤（单位：mL)试剂空白0.1mo1/L磷酸盐缓冲液0. 100. 100. 100. 100. 100. 10丙酮酸钠标准液(2umo1/mL)0. 050. 100.150.200. 25GPT或GOT 基质液0.400. 500. 450. 350. 300.25相当于丙酮酸实际含量（μmo1）0.100.200.300.400. 5020O150相当于GPT活力（单位）O97200相当于GOT活力（单位）246190置37℃水浴中保温20分钟4-二硝基苯肼液0.500.500.500.500.500. 50置37℃水浴中保温20分钟0.4mo1/LNaOH5.05.5. 05.05.0混匀，37℃保温10分钟后取出，冷却至室温，用520mm进行比色，以蒸馏水调“0”读取各管光密度。将各管光密度减去“空白"管的光密度，所得差值与其对应的酶活力单位数作图。标准曲线应作2～4套，求其均值较为理想。每次制备标准曲线时，应将空白管读数的均值记在标准曲线图上，供常规测定中校验空白管用。2.血清GPT、GOT活力测定血清GPT和GOT活力测定如表2。试剂空白管的光密度读数与在制备标准曲线时测得的试剂空白管光密度比较，若差值在光密度+0.015范围内，说明此次实验试剂正常。将测定管光密度减去试剂空白管光密度后查标准曲线，即得血清标本的酶单位。如果试剂空白管光密度超出了制备标准曲线时测得的试剂空白管光密度±0.015的范围，则须查试剂及其它方面的原因，找出问题(般是2，4-二硝基苯肼由于结晶析出，浓度减低，或基质中α-酮戊二酸称量不准确引起），纠正以后重新测定。表2血清GPT、GOT活力测定操作步骤(单位：mL)
将各管光密度减去“空白”管的光密度，所得差值与其对应的酶活力 单位数作图。标准曲线应作2～4套，求其均值较为理想。每次制备标准 曲线时，应将空白管读数的均值记在标准曲线图上，供常规测定中校验 空白管用。 2.血清GPT、GOT 活力测定 血清GPT 和GOT 活力测定如表2。 试剂空白管的光密度读数与在制备标准曲线时测得的试剂空白管 光密度比较，若差值在光密度±0.015范围内，说明此次实验试剂正常。 将测定管光密度减去试剂空白管光密度后查标准曲线，即得血清标本的 酶单位。如果试剂空白管光密度超出了制备标准曲线时测得的试剂空白 管光密度±0.015 的范围，则须查试剂及其它方面的原因，找出问题(一 般是2，4-二硝基苯肼由于结晶析出，浓度减低，或基质中α-酮戊二酸称 量不准确引起)，纠正以后重新测定。 表2 血清GPT、GOT 活力测定操作步骤(单位：mL)
试剂GPTGOT测定空白空白测定0. 100.10清0.100.1mo1/L磷酸盐缓冲液0.10置37℃水浴中预热5分钟已预温GPT基质0. 500. 500.500.50已预温GOT基质置37℃水浴中保温30分钟置37℃水浴中保温60分钟2，4-二硝基苯肼0.500.500.500. 50混勺，置37℃水浴中保温20分钟0.4mo1/LNaOH5.05.05.05.0混匀，37℃保温10分钟后将试管从水浴箱中取出，冷却至室温，用520mm比色，以蒸僧水校正光密度“0”点，读取试剂空白管及测定管光密度。四、注意事项1.一般情况下不作血清空白。当遇有黄疽、脂血、溶血标本时，应加作一个血清空白，由测定管读数减去血清空白读数，再查出血清真正的酶单位。2.赖氏标准曲线数值的准确性大致可分为三部分：第一部分20单位以下，由于光密度读数较小，数值不一定准确；第二部分20～100单位，当严格按照规定操作时，单位数值是比较可靠的；第三部分100～200单位，准确度较差，只能大致反映酶活力的大小。超过200单位时，需将标本用pH7.4磷酸盐缓冲液稀释后，再行测定。3.基质液中加入麝香草酚0.1g/100mL防腐，比用氯仿防腐效果好。4.血清不应溶血，必须新鲜，即使冰箱保存，时间也不能过久。5.测定结果与时间温度PH值有密切关系，操作时应严格准确掌握这些条件。6.丙酮酸钠吸水性很强，配制标准溶液时，事先应将其放人硫酸干燥器内，待干燥至恒重后方可称取，标准液应新鲜配制。丙酮酸钠外观
四、注意事项 1.一般情况下不作血清空白。当遇有黄疸、脂血、溶血标本时，应 加作一个血清空白，由测定管读数减去血清空白读数，再查出血清真正 的酶单位。 2.赖氏标准曲线数值的准确性大致可分为三部分：第一部分20单位 以下，由于光密度读数较小，数值不一定准确；第二部分20～l00单位， 当严格按照规定操作时，单位数值是比较可靠的；第三部分100～200单 位，准确度较差，只能大致反映酶活力的大小。超过200单位时，需将 标本用pH 7.4 磷酸盐缓冲液稀释后，再行测定。 3.基质液中加入麝香草酚0.1g/100mL防腐，比用氯仿防腐效果好。 4.血清不应溶血，必须新鲜，即使冰箱保存，时间也不能过久。 5.测定结果与时间温度PH 值有密切关系，操作时应严格准确掌握 这些条件。 6.丙酮酸钠吸水性很强，配制标准溶液时，事先应将其放人硫酸干 燥器内，待干燥至恒重后方可称取，标准液应新鲜配制。丙酮酸钠外观
纯白均匀，若色发黄，证明已变质不可使用。7.样本除用血清外，也可用肝素或EDTA抗凝血浆。五、正常参考值(赖氏单位)蛋鸡GPT：19.27±4.29；GOT：119.87±25.58。秦川牛GPT：28.13±16.11；GOT：64.59±14.51。中国奶牛GPT：67.27±17.12；GOT：125.32±24.16。六、临床意义血清中谷草转氨酶活力的升高对以尿素为最终产物的家畜(马、牛、羊、猪等)都是有诊断意义的。但由于这种酶不仅在肝细胞内有较高的浓度，在骨骼肌、心肌中的含量也较高，因此血清中这种酶活力升高，除能反映肝细胞的损害(肝炎、黄曲霉毒素、砷等引起)以外，对肌肉的疾患(如家禽的肌肉营养不良、牛羊的白肌病等)、心肌的损害也都有一定诊断和预后价值。谷丙转氨酶在组织中以肝脏的含量最高。其次为肾脏和心脏。当这种酶在血清中活力升高时，首先应考虑肝脏的损害。此外也有报道，鸡发生脂肪肝和肾综合症时，谷丙转氨酶也明显升高
纯白均匀，若色发黄，证明已变质不可使用。 7.样本除用血清外，也可用肝素或EDTA抗凝血浆。 五、正常参考值(赖氏单位) 蛋鸡GPT：19.27±4.29；GOT：119.87±25.58。 秦川牛GPT：28.13±16.11；GOT：64.59±14.51。 中国奶牛GPT：67.27±17.12；GOT：125.32±24.16。 六、临床意义 血清中谷草转氨酶活力的升高对以尿素为最终产物的家畜(马、牛、 羊、猪等)都是有诊断意义的。但由于这种酶不仅在肝细胞内有较高的浓 度，在骨骼肌、心肌中的含量也较高，因此血清中这种酶活力升高，除 能反映肝细胞的损害(肝炎、黄曲霉毒素、砷等引起)以外，对肌肉的疾 患(如家禽的肌肉营养不良、牛羊的白肌病等)、心肌的损害也都有一定 诊断和预后价值。 谷丙转氨酶在组织中以肝脏的含量最高。其次为肾脏和心脏。当这 种酶在血清中活力升高时，首先应考虑肝脏的损害。此外也有报道，鸡 发生脂肪肝和肾综合症时，谷丙转氨酶也明显升高