实验二有机磷杀虫剂抑制昆虫乙酰胆碱酯酶活性测定 目的要求 通过本试验了解有机磷杀虫剂对昆虫神经系统乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用。由于乙酰 胆碱累积，神经受过度刺激，胆碱能系统破坏（或受阻），而引起昆虫中毒以致死亡。 本试验采用酶化学比色法测定受药处理后中毒昆虫酶被抑制程度。此原理也可应用于对 农产品中有机谈杀中剂残留分析和有机送中毒病人血液中胆城酯酶活性的测定。 原 当有机磷杀虫剂与乙酰胆碱酯酶相互作用时，乙酰胆碱酯藓被抑制，不能水解乙酰胆碱 昆虫体内乙酰胆碱累积，从而致使中毒。 本法以有机磷处理昆虫后，取昆虫头部研磨成匀浆液作酶源，与定量的乙酰胆碱再一定 条件下，经该酶水解后剩余的乙酰胆碱与碱性羟胺作用生成异羟亏酸，再与三氯化铁作用生 酰胆碱多，光密度值大， 实验材料 试剂： ①磷酸盐缓冲液称取纯结品磷酸氢二钠16.72g及磷酸二氢钾2.72g,以重蒸馏水溶 解并注入倒1000m1容量瓶中，PH7.2。 ②0.004M溴化乙酰胆碱溶液准确称取溴化乙酰胆碱0.1809g,以磷酸盐缓冲液溶解并 注入到2001容量瓶中，加磷酸盐缓冲液至刻度。 ③2N盐酸羟胺溶液称取盐酸羟胺13.9g溶于100ml重蒸馏水中。 上述三种试剂配制后均存入冰箱中备用 ④3.5M氢氧化钠溶液称取氢氧化钠14g溶于100l蒸馏水中。 ⑤1：2盐酸溶液用化学纯盐酸1份加蒸馏水2份 ⑥0.37M三氯化铁溶液称化学纯六水三氯化铁100g溶于0.1WHC1溶液中，最后定容 至1000m1 实验用具：玻璃匀浆器、搅拌机、小剪刀、水浴控温摇床（或恒温水浴箱入、玻璃丝、 10m1试管、721分光光度计、0.5、1.0、2.0m1吸液管等。 酶的制备：以5%敌敌畏丙酮液在每头昆虫的胸背板处点滴2微升（供试昆虫可用粘 虫、棉铃虫等)，处理后约经30-0分钟，当昆虫 中毒并接近死亡时， 立即用小剪刀剪下2 头昆虫头部盛于玻璃匀浆器内（预先吸入约3细1冰冷的磷酸缓冲液），在低温条件下进行匀 浆，以少量玻璃丝置于小型漏斗上把虫浆过滤，滤液用磷酸盐缓冲液定容至5l,暂储存于 冷冻室内备用。 另取20头正常（无药处理）昆虫头部，匀浆处理与上述药剂处理组相同 标准曲线的制作 取试管12支分为6组，用吸管分别注入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.21的试剂@ 于各组己作标记试管中，并分别加入试剂①至试管中，使各管的溶液总量为1.5ml。然后将 1-5组试管分别加入21试剂③加入④混合液（按1：1比例临时混合），用力摇动1分钟， 加入1l试剂⑤摇匀，加入1ml试剂©，摇匀后呈现深浅不同颜色。第六组试管在加入试剂 ①至总量达1,5ml后，先加入试剂⑤1l,摇匀后加入2m1试剂③加④混合液（按1：1比例 临时混合)，摇匀后加1ml试剂⑥，摇匀即成空白管。 样本分析 取洁净的试管9支，编号为1(1人1(2)，（指正常虫管）：2(1)2(2)，（指正常虫 对照管)：3(1)、3(2)，（药剂处理管）：4(1)、4(2)，（药剂处理对照管）：5（空白管）
实验二 有机磷杀虫剂抑制昆虫乙酰胆碱酯酶活性测定 目的要求 通过本试验了解有机磷杀虫剂对昆虫神经系统乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用。由于乙酰 胆碱累积，神经受过度刺激，胆碱能系统破坏（或受阻），而引起昆虫中毒以致死亡。 本试验采用酶化学比色法测定受药处理后中毒昆虫酶被抑制程度。此原理也可应用于对 农产品中有机磷杀虫剂残留分析和有机磷中毒病人血液中胆碱酯酶活性的 测定。 原理 当有机磷杀虫剂与乙酰胆碱酯酶相互作用时，乙酰胆碱酯酶被抑制，不能水解乙酰胆碱， 昆虫体内乙酰胆碱累积，从而致使中毒。 本法以有机磷处理昆虫后，取昆虫头部研磨成匀浆液作酶源，与定量的乙酰胆碱再一定 条件下，经该酶水解后剩余的乙酰胆碱与碱性羟胺作用生成异羟亏酸，再与三氯化铁作用生 成羟亏酸铁络化合物（红棕色）。用分光光度计测定其光密度值。如酶被抑制高时，剩余的 乙酰胆碱多，光密度值大，反之，则光密度小。 实验材料 试剂： ①磷酸盐缓冲液 称取纯结晶磷酸氢二钠 16.72g 及磷酸二氢钾 2.72g，以重蒸馏水溶 解并注入倒 1000ml 容量瓶中，PH7.2。 ②0.004M 溴化乙酰胆碱溶液 准确称取溴化乙酰胆碱 0.1809g，以磷酸盐缓冲液溶解并 注入到 200ml 容量瓶中，加磷酸盐缓冲液至刻度。 ③2M 盐酸羟胺溶液 称取盐酸羟胺 13.9g 溶于 100ml 重蒸馏水中。 上述三种试剂配制后均存入冰箱中备用 ④3.5M 氢氧化钠溶液 称取氢氧化钠 14g 溶于 100ml 蒸馏水中。 ⑤1：2 盐酸溶液 用化学纯盐酸 1 份加蒸馏水 2 份 ⑥0.37M 三氯化铁溶液 称化学纯六水三氯化铁 100g 溶于 0.1M HCl 溶液中，最后定容 至 1000ml 实验用具：玻璃匀浆器、搅拌机、小剪刀、水浴控温摇床（或恒温水浴箱）、玻璃丝、 10ml 试管、721 分光光度计、0.5、1.0、2.0ml 吸液管等。 酶的制备：以 5％敌敌畏丙酮液在每头昆虫的 胸背板处点滴 2 微升（供试昆虫可用粘 虫、棉铃虫等），处理后约经 30-0 分钟，当昆虫中毒并接近死亡时，立即用小剪刀剪下 20 头昆虫头部盛于玻璃匀浆器内（预先吸入约 3ml 冰冷的磷酸缓冲液），在低温条件下进行匀 浆，以少量玻璃丝置于小型漏斗上把虫浆过滤，滤液用磷酸盐缓冲液定容至 5ml，暂储存于 冷冻室内备用。 另取 20 头正常（无药处理）昆虫头部，匀浆处理与上述药剂处理组相同。 标准曲线的制作 取试管 12 支分为 6 组，用吸管分别注入 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 和 1.2ml 的试剂② 于各组已作标记试管中，并分别加入试剂①至试管中，使各管的溶液总量为 1.5ml。然后将 1-5 组试管分别加入 2ml 试剂③加入④混合液（按 1：1 比例临时混合），用力摇动 1 分钟， 加入 1ml 试剂⑤摇匀，加入 1ml 试剂⑥，摇匀后呈现深浅不同颜色。第六组试管在加入试剂 ①至总量达 1.5ml 后，先加入试剂⑤1ml，摇匀后加入 2ml 试剂③加④混合液（按 1：1 比例 临时混合），摇匀后加 1ml 试剂⑥，摇匀即成空白管。 样本分析 取洁净的试管 9 支，编号为 1（1）、1（2），（指正常虫管）；2（1）、2（2），（指正常虫 对照管）;3(1) 、3(2),（药剂处理管）；4（1）、4（2），（药剂处理对照管）；5（空白管）
于各试管中加入1m1试剂②，1与3管各加0.5m1正常虫和药剂处理后的虫浆，5号管加入 0.5m1磷酸盐缓冲液，摇匀后置于预先调好为37度的恒温水浴摇床里40分钟。除空白管外 其它各管应立即加 入21试剂③加④混合液（按1：1比例临时混合），用力摇动1分钟以 2对4对照管分别加入正常虫和药剂处理虫的虫浆液各0.5ml。摇匀后加试剂⑤1ml,摇匀 后再加试剂⑥1l,摇匀后用滤纸过滤，空白管的制作同标准曲线中的空白管制作相同。 测定和结果整理 把标准或样本按制作步骤完成后，将滤液分别移至各比色杯中 用分光光度计在波长 540微米下进行测定。以空白管调节光密度为“0”，分别测定标准或样本管并读出它们的光 密度数值。 以不同浓度的乙酰胆碱量（微克分子浓度）数值做横坐标，各管测得的光密度做纵坐 标即可绘制成一标准曲线。把测定样本的光密度值可从标准曲线坐标上求出样本的乙融阳 碱量。从而代入公式，求乙酰胆碱酶被抑制百分率(%) 受药后5龄粘虫（头部）乙酰胆碱酯酶被抑制率(%)： 酶被抑制率(%)=【正常虫酶活性（水解ACh量）-受药虫酶活性（水解Ach量）】/正 常虫酶活性（水解ACh量）×100 习作 采用酶化学法应特别注意哪些条件？
于各试管中加入 1ml 试剂②，1 与 3 管各加 0.5ml 正常虫和药剂处理后的 虫浆，5 号管加入 0.5ml 磷酸盐缓冲液，摇匀后置于预先调好为 37 度的恒温水浴摇床里 40 分钟。除空白管外， 其它各管应立即加入 2ml 试剂③加④混合液（按 1：1 比例临时混合），用力摇动 1 分钟以上， 2 对 4 对照管分别加入正常虫和药剂处理虫的 虫浆液各 0.5ml。摇匀后加试剂⑤1ml，摇匀 后再加试剂⑥1ml，摇匀后用滤纸过滤，空白管的制作同标准曲线中的空白管制作相同。 测定和结果整理 把标准或样本按制作步骤完成后，将滤液分别移至各比色杯中，用分光光度计在波长 540 微米下进行测定。以空白管调节光密度为“0”，分别测定标准或样本管并读出它们的光 密度数值。 以不同浓度的乙酰胆碱量（微克分子浓度）数值做横坐标，各管测得的光密度做纵坐 标即可绘制成一标准曲线。把测定样本的 光密度值可从标准曲线坐标上求出样本的乙酰胆 碱量。从而代入公式，求乙酰胆碱酶被抑制百分率（％）。 受药后 5 龄粘虫（头部）乙酰胆碱酯酶被抑制率（％）： 酶被抑制率（％）＝【正常虫酶活性（水解 ACh 量）-受药虫酶活性（水解 Ach 量）】/正 常虫酶活性（水解 ACh 量）×100 习作 1.采用酶化学法应特别注意哪些条件？