西北大学生命科学学院：《分子生物学》课程实验教案（讲义，共十个实验）

目录实验一：移液器使用.实验二：质粒DNA的限制性内切酶消化..9实验三：琼脂糖凝胶电泳检测DNA.....11实验四、五：目的片段的切胶回收与DNA重组..14.17实验六、七：大肠杆菌感受态细胞的制备及转化.21实验八：（重组）质粒DNA的提取.实验九：PCR基因扩增技术筛选重组子.24实验十：外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测..26

目 录 实验一：移液器使用. 4 实验二：质粒DNA的限制性内切酶消化.9 实验三：琼脂糖凝胶电泳检测DNA.11 实验四、五：目的片段的切胶回收与 DNA 重组.14 实验六、七：大肠杆菌感受态细胞的制备及转化.17 实验八：（重组）质粒 DNA 的提取.21 实验九：PCR 基因扩增技术筛选重组子.24 实验十：外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测.26

《分子生物学》实验课程简介适用专业生物技术、生物科学、生态学学时54学分课程性质必修预修课程生物化学、遗传学、微生物学、细胞生物学一。本课程的性质、地位和作用分子生物学实验是生物科学和生物技术专业的一门专业基础课程，是一门独立的实验课程，同时也是为了配合分子生物学的教学而开设的。实验过程中，首先将有关的基本原理、基本技术和方法给学生做一介绍，然后将分子生物学实验中要用到的仪器以课件的形式展示给学生，在学生掌握了以上基本知识的基础上给定实验内容和目的，让学生自行设计实验方案并完成，得出一定的实验结论。希望通过本实验培养学生主动学习、学以致用、独立思考的能力。二，实验内容选编原则与要求分子生物学实验教学内容选编原则与要求是，根据生物科学和生物技术专业人才的培养目标所需要的基本理论和基本技能的要求，根据本课程的教学性质、条件和教学实践而制定的。既要涵盖分子生物学的基本实验技术，也要体现现代分子生物学发展的新方法、新技术。全书所选实验项目分为两个部分，第一部分为基础性实验，包括感受态细胞的制备与转化、质粒DNA的提取及酶切、琼脂糖凝胶电泳检测DNA、DNA重组、基因组DNA的分离提取、DNA序列测定、PCR基因扩增、真核基因在原核细胞中的表达等内容。要求学生能够掌握基本的实验操作技能。三、教学安排与时数本实验课程在三年级上学期开设，总计54学时。四.考核方法与要求1.平时成绩：包括出勤、实验操作，实验效果、讨论情况等，占30%2．报告成绩：实验报告等，占30%3.考试成绩：占40%4.综合考核成绩：平时成绩+设计成绩+报告成绩+考试成绩实验守则及要求1．穿着要整洁，必须穿实验服

《分子生物学》实验课程简介 适用专业 生物技术、生物科学、生态学 学 时 54 学 分 课程性质 必修 预修课程 生物化学、遗传学、 微生物学、细胞生物学 一． 本课程的性质、地位和作用 分子生物学实验是生物科学和生物技术专业的一门专业基础课程，是一门独立的实验课程， 同时也是为了配合分子生物学的教学而开设的。实验过程中，首先将有关的基本原理、基本 技术和方法给学生做一介绍，然后将分子生物学实验中要用到的仪器以课件的形式展示给学 生，在学生掌握了以上基本知识的基础上给定实验内容和目的，让学生自行设计实验方案并 完成，得出一定的实验结论。希望通过本实验培养学生主动学习、学以致用、独立思考的能 力。 二. 实验内容选编原则与要求 分子生物学实验教学内容选编原则与要求是，根据生物科学和生物技术专业人才的培养目标 所需要的基本理论和基本技能的要求，根据本课程的教学性质、条件和教学实践而制定的。 既要涵盖分子生物学的基本实验技术，也要体现现代分子生物学发展的新方法、新技术。全 书所选实验项目分为两个部分，第一部分为基础性实验, 包括感受态细胞的制备与转化、质 粒 DNA 的提取及酶切、琼脂糖凝胶电泳检测 DNA、DNA 重组、基因组 DNA 的分离提取、 DNA 序列测定、PCR 基因扩增、真核基因在原核细胞中的表达等内容。要求学生能够掌握 基本的实验操作技能。 三. 教学安排与时数 本实验课程在三年级上学期开设，总计 54 学时。 四. 考核方法与要求 1．平时成绩：包括出勤、实验操作，实验效果、讨论情况等，占 30% 2．报告成绩：实验报告等，占 30% 3．考试成绩：占 40% 4．综合考核成绩：平时成绩+设计成绩+报告成绩+考试成绩 实验守则及要求 1. 穿着要整洁，必须穿实验服

2.实验室内禁止吃食物，勿高声谈话及随便走动。3.实验前必须认真预习，熟悉实验的内容，了解所用的仪器用具：实验中应严格按操作规程进行，认真操作、仔细观察，及时记录实验现象及结果：实验结束后，籽细地分析和总结实验结果，认真做好每一次的实验报告。4．实验器具应保持清洁，任何使用过的器具及玻璃器皿必须洗净后放回原处。使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障立即报告，不得擅自拆检。5.实验台面应随时保持整洁、仪器、药品摆放整齐。公用试剂用完后，应立即盖好放回原处。6.值日生制度：每天安排3-4人值日，其职责是负责实验器具的整理、操作台、水槽、地板等实验室卫生工作和一切服务性工作，并注意实验室的水、电、门、窗等方面情况。注意事项1.实验前应做好试剂的配置、用品灭菌等准备工作。配置基因工程客种试剂，必须要使用重蒸水。2．使用后的器皿必须认真清洗干净，洗完后还要用重蒸水冲洗三次。3.凡是可以进行灭菌的试剂与用具都必须要经过高压蒸汽灭菌后进行使用，防止其他杂质或酶对DNA、RNA或蛋白质的降解。4.凡是基因工程操作所用的一切塑料器具（Eppendorf管、吸嘴等），在使用前都应装入盒子和瓶子中灭菌，且装盒或装瓶过程中都应采用镊子，或戴上一次性手套进行操作，不能直接用手去拿，严防手上杂酶污染。5.．对于Eeppendorf管、吸嘴与非玻璃离心管等只能湿热灭菌，然后放置在50°箱中烘干后使用。6．实验中加入任何试剂后应注意样品的混匀，保温等反应后的样品也应离心摔一下后再进行下步的实验。7.限制性内切酶等工具酶保存于50%的甘油中，-20°可以长期保存。应自始至终将酶保持在零度以下，取酶时不能用手指接触储存酶的部分。在需要加酶的时候将酶从冰箱中取出，放在冰盒里，用完后立即放回冰箱。8.微量移液器的使用：微量移液器是连续可调的、计量和转移液体的专用仪器。其装有直接读数容量计，读数由三位拨号数字组成，在移液器容量范围内能连续调节，从上（最大数）到下（最小数）读取。移液器的型号即是其最大容量值。按钮向下压以及放的动作、速度要缓慢平稳。注意事项见实验一

2. 实验室内禁止吃食物，勿高声谈话及随便走动。 3. 实验前必须认真预习，熟悉实验的内容，了解所用的仪器用具：实验中应严格按操作规 程进行，认真操作、仔细观察，及时记录实验现象及结果：实验结束后，籽细地分析和总结 实验结果，认真做好每一次的实验报告。 4. 实验器具应保持清洁，任何使用过的器具及玻璃器皿必须洗净后放回原处。使用贵重精 密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障立即报告，不得擅自拆检。 5. 实验台面应随时保持整洁、仪器、药品摆放整齐。公用试剂用完后，应立即盖好放回原 处。 6. 值日生制度：每天安排 3-4 人值日，其职责是负责实验器具的整理、操作台、水槽、地 板等实验室卫生工作和一切服务性工作，并注意实验室的水、电、门、窗等方面情况。 注意事项 l. 实验前应做好试剂的配置、用品灭菌等准备工作。配置基因工程各种试剂，必须要使用 重蒸水。 2. 使用后的器皿必须认真清洗干净，洗完后还要用重蒸水冲洗三次。 3. 凡是可以进行灭菌的试剂与用具都必须要经过高压蒸汽灭菌后进行使用，防止其他杂质 或酶对 DNA、RNA 或蛋白质的降解。 4. 凡是基因工程操作所用的一切塑料器具(Eppendorf 管、吸嘴等)，在使用前都应装入盒 子和瓶子中灭菌，且装盒或装瓶过程中都应采用镊子，或戴上一次性手套进行操作，不能直 接用手去拿，严防手上杂酶污染。 5. 对于 Eeppendorf 管、吸嘴与非玻璃离心管等只能湿热灭菌，然后放置在 50°箱中烘干 后使用。 6. 实验中加入任何试剂后应注意样品的混匀，保温等反应后的样品也应离心摔一下后再进 行下步的实验。 7. 限制性内切酶等工具酶保存于 50%的甘油中，-20°可以长期保存。应自始至终将酶保持 在零度以下，取酶时不能用手指接触储存酶的部分。在需要加酶的时候将酶从冰箱中 取出，放在冰盒里，用完后立即放回冰箱。 8. 微量移液器的使用：微量移液器是连续可调的、计量和转移液体的专用仪器。其装有直 接读数容量计，读数由三位拨号数字组成，在移液器容量范围内能连续调节，从上(最大数) 到下(最小数)读取。移液器的型号即是其最大容量值。按钮向下压以及放的动作、速度要缓 慢平稳。注意事项见实验一

9.离心机的使用：应注意保持离心管放置位置的对称以及离心管中样品的平衡，并要拧紧盖好其中的离心机内部的盖子，否则会损坏仪器。此外应注意离心管在离心机内的放置方向。10.电子天平使用：1）注意在天平的最大称量范围内使用。2）天平应放在无振动、无空气对流处，使用前须先调节水平泡至中央位置。3）使用后应保持仪器的洁净。11.微波炉内不可使用金属容器以及空载。12.配制药品取试剂时，所用的钥匙不能混用，否则会造成药品污染。13.实验过程中应做好每个样品的标记工作，如样品的名称、保存的时间：且一般在Eeppendorf管上用记号笔作标记时，应在两处重复做好标记

9. 离心机的使用：应注意保持离心管放置位置的对称以及离心管中样品的平衡，并要拧紧 盖好其中的离心机内部的盖子，否则会损坏仪器。此外应注意离心管在离心机内的放置方向。 10. 电子天平使用： 1) 注意在天平的最大称量范围内使用。 2) 天平应放在无振动、无空气对流处，使用前须先调节水平泡至中央位置。 3) 使用后应保持仪器的洁净。 11. 微波炉内不可使用金属容器以及空载。 12. 配制药品取试剂时，所用的钥匙不能混用，否则会造成药品污染。 13. 实验过程中应做好每个样品的标记工作，如样品的名称、保存的时间．且一般在 Eeppendorf 管上用记号笔作标记时，应在两处重复做好标记

实验一：移液器使用一、实验目的在进行分析测试方面的研究时，一般采用移液器（micropipette）量取少量或微量的液体。本次课程学习移液器的正确使用方法及其一些细节操作，以便于后期实验严谨的定量操作。二、实验原理微量的单位定义为微升（microliter，μL）ControlButtonEjectButton1升（liter，L）=1,000毫升(milliliters，mL)，VolumeKnob1毫升（mL））=1,000微升（μ）NumberWind.Tip三、实验材料、仪器和试剂移液器、枪头及离心管四、实验方法及步骤（一）移液器量程认读1.量程：不同型号的微量移液器，各有其吸取体积范围，依取用溶液体积选用适当的微量移液器。量程移液器规格P20.5~2μLP100.5~10μLP202~ 20μLP10011 ~ 100μLP20021~200μLP1000201~1,000μL2.数值窗口的认读

实验一：移液器使用 一 、实验目的 在进行分析测试方面的研究时，一般采用移液器（micropipette）量取少量或微量的液 体。本次课程学习移液器的正确使用方法及其一些细节操作，以便于后期实验严谨的 定量操作。 二 、实验原理 微量的单位定义为微升（microliter，µL） 1 升（liter，L） = 1,000 毫升(milliliters，mL)， 1 毫升（mL） = 1,000 微升（µL） 三 、实验材料、仪器和试剂 移液器、枪头及离心管 四 、实验方法及步骤 （一）移液器量程认读 1. 量程：不同型号的微量移液器，各有其吸取体积范围，依取用溶液体积选用适当的微量移 液器。 移液器规格 量程 P2 0.5 ~ 2µL P10 0.5 ~ 10µL P20 2 ~ 20µL P100 11 ~ 100µL P200 21 ~ 200µL P1000 201 ~ 1,000µL 2. 数值窗口的认读

p1000移液器量程201~1,000μL口500μL窗口读数5Lop200移液器量程21~200μL口150uL窗口读数国Lp20移液器量程2~20μL口E12uL窗口读数Lop2移液器量程0.5~2uL口1μL窗口读数[0（二）移液器的使用1.设定移液体积，根据吸取液体的体积，选择适当的移液器。在调节量程时，如果要从大体积调为小体积，则按照正常的调节方法，逆时针旋转旋钮即可：但如果要从小体积调为大体积时，则可先顺时针旋转刻度旋钮至超过量程的刻度，再回调至设定体积，这样可以保证量取的最高精确度。2.枪头的装配将移液器垂直插入微量移液器枪头（tip)中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合，上紧即可。P1000使用蓝色微量移液器头，P200及P20使用黄色微量移液器头，P2使用白色微量移液器头

p1000 移液器 量程 201 ~ 1,000µL 500µL 窗口读数 p200 移液器 量程 21 ~ 200µL 150µL 窗口读数 p20 移液器 量程 2 ~ 20µL 12µL 窗口读数 p2 移液器 量程 0.5 ~ 2µL 1µL 窗口读数 （二）移液器的使用 1. 设定移液体积， 根据吸取液体的体积，选择适当的移液器。 在调节量程时，如果要从大体积调为小体积，则按照正常的调节方法，逆时针旋 转旋钮即可；但如果要从小体积调为大体积时，则可先顺时针旋转刻度旋钮至超过量 程的刻度，再回调至设定体积，这样可以保证量取的最高精确度。 2. 枪 头的装配 将移液器垂直插入微量移液器枪头 (tip)中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密 结合，上紧即可。 P1000 使用蓝色微量移液器头，P200 及 P20 使用黄色微量移液器头，P2 使用白色微 量移液器头。 0 5 0 1 5 0 1 2 0 1 0 0

严禁移液器撞击枪头，因为这样会导致移液枪的内部配件（如弹簧）因敲击产生的瞬时撞击力而变得松散，甚至会导致刻度调节旋钮卡住，长期这样操作会导致移液器的零件损坏。3.移液的方法吸取液体时，移液器保持竖直状态（角度控制在倾斜20度之内），将枪头插入液面下。在吸液之前，可以先吸放几次液体以润湿吸液嘴（尤其是要吸取粘稠或密度与水不同的液体时）。这时可以采取两种移液方法。一是前进移液法。用大拇指将按钮按下至第一停点，然后慢慢松开按钮回原点。接着将按钮按至第一停点排出液体，稍停片刻继续按按钮至第二停点吹出残余的液体。最后松开按钮。二是反向移液法。此法一般用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液体或极微量的液体，其原理就是先吸入多于设置量程的液体，转移液体的时候不用吹出残余的液体。先按下按钮至第二停点，慢慢松开按钮至原点。接着将按钮按至第一停点排出设置好量程的液体，继续保持按住按钮位于第一停点（千万别再往下按），取下有残留液体的枪头，弃之。吸液速度：移液操作应保持平顺、合适的吸液速度：过快的吸液速度容易造成样品进入套柄，带来活塞和密封圈的损伤以及样品的交叉污染。4.枪头浸入深度建议如下所示：移液器规格吸头浸入深度1 mm2μL和10μL20μL和100μL2-3 mm200μL和1000μL3-6 mm5.移液器的正确放置使用完毕，可以将其竖直挂在移液枪架上，但要小心别掉下来

严禁移液器撞击枪头，因为这样会导致移液枪的内部配件（如弹簧）因敲击产生的 瞬时撞击力而变得松散，甚至会导致刻度调节旋钮卡住，长期这样操作会导致移液器的 零件损坏。 3. 移 液的方法 吸取液体时，移液器保持竖直状态（角度控制在倾斜 20 度之内），将枪头插入液 面下。在吸液之前，可以先吸放几次液体以润湿吸液嘴（尤其是要吸取粘稠或密度与 水不同的液体时）。 这时可以采取两种移液方法。 一 是前进移液法。用大拇指将按钮按下至第一停点，然后慢慢松开按钮回原点。 接着将按钮按至第一停点排出液体，稍停片刻继续按按钮至第二停点吹出残余的液体。 最后松开按钮。 二是反向移液法。此法一般用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液体或极 微量的液体，其原理就是先吸入多于设置量程的液体，转移液体的时候不用吹出残余 的液体。先按下按钮至第二停点，慢慢松开按钮至原点。接着将按钮按至第一停点排 出设置好量程的液体，继续保持按住按钮位于第一停点（千万别再往下按），取下有 残留液体的枪头，弃之。 吸 液速度：移液操作应保持平顺、合适的吸液速度；过快的吸液速度容易造成 样品进入套柄，带来活塞和密封圈的损伤以及样品的交叉污染。 4. 枪头浸入深度建议如下所示： 移液器规格 吸头浸入深度 2µL 和 10 µL 1 mm 20µL 和 100 µL 2-3 mm 200µL 和 1000 µL 3-6 mm 5. 移 液器的正确放置 使用完毕，可以将其竖直挂在移液枪架上，但要小心别掉下来

五、注意事项1.如不使用，要把移液器的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧。2.套有微量移液器头的微量移液器，无论微量移液器头中是否有溶液，均不可平放，需直立架好。3.吸取酸液或具腐蚀性溶液后，请将微量移液器拆解开，各部位零件以蒸馏水冲洗干净，擦干后再正确组合回复原状。4.若不小心使溶液进入吸管柱内时，应予以拆解，将活塞组件、吸管柱等各部位以清水冲洗干净后，再以酒精擦拭，擦干后再正确组合回复原状5.定期自行以天平检查准确度，若有任何问题请送厂维修。六、思考题1、如果移液器移液体积不准确，可能是什么原因，该如何维护？

五 、注意事项 1. 如不使用，要把移液器的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧。 2. 套有微量移液器头的微量移液器，无论微量移液器头中是否有溶液，均不可平放， 需直立架好。 3. 吸取酸液或具腐蚀性溶液后，请将微量移液器拆解开，各部位零件以蒸馏水冲洗干 净，擦干后再正确组合回复原状。 4. 若不小心使溶液进入吸管柱内时，应予以拆解，将活塞组件、吸管柱等各部位以清 水冲洗干净后，再以酒精擦拭，擦干后再正确组合回复原状。 5. 定期自行以天平检查准确度，若有任何问题请送厂维修。 六 、思考题 1、如果移液器移液体积不准确，可能是什么原因，该如何维护？

实验二：质粒DNA的限制性内切酶消化一、实验目的通过本实验学习和掌握DNA的限制性内切酶酶切原理及技术。二、实验原理Ⅱ类限制性内切核酸酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。I类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRI识别六个核苷酸序列:5-GIAATTC-3')，有少数酶识别更长的序列或简并序列，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段：切割双链DNA产生3种不同的切口一一平末端（如SmaI：5'CCCIGGG-3)，有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端，包括5端突出：3端突出。如EcoRI切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。+5'GAATTC3'5'G3'5'AATTC3'?3'CTTAAG53'G5'3'CTTAA51三、实验材料、仪器和试剂（一）仪器恒温培养箱/恒温水浴、台式离心机、高压灭菌锅、移液器。（二）材料含有GFP的克隆载体（质粒）pUC119-GFP、原核表达载体pET-22b（质粒图谱见图2.1）无菌吸头和微量离心管。EcORIHindlllEcoRISac!SallHind i3...GATTCaATG...TAGAAG CTT...5'.CCGAACGTCGACAAGAspErash serserse ValAsrLysLeGFPPT711bpOiacpelB6xHisLeaderAmpAmppUC119-GFPpET-22b(+)(3860 bp)(5493bp)OriOri图2.1pUC119-GFP与pET-22b质粒的图谱

实验二：质粒DNA的限制性内切酶消化 一 、实验目的 通过本实验学习和掌握 DNA 的限制性内切酶酶切原理及技术。 二 、实验原理 Ⅱ类限制性内切核酸酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组 DNA 的基础。Ⅱ类 限制酶识别长度为 4 至 6 个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如 EcoRⅠ识别六个核苷酸 序列:5'- G↓AATTC-3')，有少数酶识别更长的序列或简并序列，并在这个顺序内进行切割， 产生特异的 DNA 片段；切割双链 DNA 产生 3 种不同的切口－－平末端(如 SmaⅠ:5'- CCC↓GGG-3')，有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的 DNA 片段称粘性未 端,包括 5’端突出；3’端突出。 如 EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 三 、实验材料、仪器和试剂 （一）仪器 恒温培养箱/恒温水浴、台式离心机、高压灭菌锅、移液器。 （二） 材料 含有 GFP 的克隆载体（质粒）pUC1l9-GFP、原核表达载体 pET-22b（质粒图谱见图 2.1）； 无菌吸头和微量离心管。 图 2.1 pUC1l9-GFP 与 pET-22b 质粒的图谱

（三）试剂限制性内切酶EcoRI（10units/μL）、HindIII（10units/μL）、10x酶切反应缓冲液。四、实验方法及步骤取质粒DNA1μg，加3μL10x酶切缓冲液，EcoRI和HindIII酶各1μL，无菌水补至总体积30μL，轻缓吹吸混匀，37℃培养箱或恒温水浴保温3h。五、注意事项[注意]1.酶解反应完成后，如不能及时进行下一步操作，酶解液需冷冻保存（-20℃）。2．当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要使用新的吸管头。3.如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/LNaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。4.内切酶的酶解反应最适条件各不相同，各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言，限制性内切酶用量可按标准体系1μgDNA加1单位酶，消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量，反应时间也要适当延长。六、思考题1、通过PCR手段获得目的基因，如何在目的基因上添加酶切位点？

（三） 试剂 限制性内切酶 EcoRI（10 units/µL）、Hind III（10 units/µL）、10x 酶切反应缓冲液。 四 、实验方法及步骤 取质粒 DNA 1µg，加 3µL 10x 酶切缓冲液，EcoRI 和 Hind III 酶各 1 µL, 无菌水补至 总体积 30µL，轻缓吹吸混匀，37℃培养箱或恒温水浴保温 3 h。 五 、注意事项 [注意] 1. 酶解反应完成后，如不能及时进行下一步操作，酶解液需冷冻保存（-200C）。 2. 当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取 限制性内切酶时，每次都要使用新的吸管头。 3. 如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用 同一缓冲液，则可同时水解。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使 用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后， 用等体积酚/氯仿抽提，加 0.1 倍体积 3mol/L NaAc 和 2 倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃ 低温冰箱 30 分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 4. 内切酶的酶解反应最适条件各不相同，各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温 度(大多数为 37℃)。对质粒 DNA 酶切反应而言，限制性内切酶用量可按标准体系 1μg DNA 加 1 单位酶，消化 1-2 小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量，反应时间也要适当延长。 六 、思考题 1、通过 PCR 手段获得目的基因，如何在目的基因上添加酶切位点？