張星元:發酵原理電子講義附錄1 12 微生物生物工程基本理論的探索 張星元 (無鍚輕工大擊生物工程學院江蘇無鍚214036) 摘要∶工業發酵是微生物群體活動的動態過程。此過程靠如下三 種流動來維繫’即伴隨能量形式的轉換而發生的電子流動丶伴隨 異化和同化作用而發生的物質流動以及伴隨不同水平上的代謝調 節而發生的資訊流動。在分析以上三種流動的運行規律和工業發 酵大量資訊的基礎上’運用歸納邏輯的方法提岀了關於微生物生 物工程的三個基本假說·即生物能支撐假說丶代謝網路假說和細 胞經濟假說。如果這些假說成立’就有可能對工業發酵的微生物 代謝進行導向。從而形成由三個假說和三個推理組成的微生物生 物工程(工業發酵)基本理論 關鍵字∶生物能支撐假說∶代謝網路假說;細胞經濟假說;發酵 原理;代謝工程;微生物生物工程 Explorations of Basic Theory of Microbial Biotechnology Zhang X (School of Biotechnology, Wuxi University of Light Industry, Wuxi 214036, China Abstract Industrial fermentation is the processes in which microbial population functions. Those processes are supported and maintained by the three kinds of flows: o the electron flows which flows which operate along with dissimilation and assimilation, o the information flows which operate along with the metabolic regulations in different levels. On the basis of the analysis of the operation rule of above three kinds of flows and the generalization of a great deal of information of industrial fermentation, the three basic hypothesis of industrial fermentation(microbial biotechnology)are developed as follows: O the hypothesis of bioenergy support, O the hypothesis of metabolic network, o the hypothesis of cell economy. If those hypotheses are true, then the results of metabolic guidance for
張星元：發酵原理電子講義 附錄 1-3 12 微生物生物工程基本理論的探索 張 星 元 （無錫輕工大學生物工程學院 江蘇無錫 214036） 摘要：工業發酵是微生物群體活動的動態過程。此過程靠如下三 種流動來維繫，即伴隨能量形式的轉換而發生的電子流動、伴隨 異化和同化作用而發生的物質流動以及伴隨不同水平上的代謝調 節而發生的資訊流動。在分析以上三種流動的運行規律和工業發 酵大量資訊的基礎上，運用歸納邏輯的方法提出了關於微生物生 物工程的三個基本假說，即生物能支撐假說、代謝網路假說和細 胞經濟假說。如果這些假說成立，就有可能對工業發酵的微生物 代謝進行導向。從而形成由三個假說和三個推理組成的微生物生 物工程（工業發酵）基本理論。 關鍵字：生物能支撐假說；代謝網路假說；細胞經濟假說；發酵 原理；代謝工程；微生物生物工程 Explorations of Basic Theory of Microbial Biotechnology Zhang Xingyuan (School of Biotechnology, Wuxi University of Light Industry, Wuxi 214036, China) Abstract ： Industrial fermentation is the processes in which microbial population functions. Those processes are supported and maintained by the three kinds of flows: ○1 the electron flows which operate along with energy-form transformation, ○2 the metabolite flows which operate along with dissimilation and assimilation, ○3 the information flows which operate along with the metabolic regulations in different levels. On the basis of the analysis of the operation rules of above three kinds of flows and the generalization of a great deal of information of industrial fermentation, the three basic hypothesis of industrial fermentation (microbial biotechnology) are developed as follows: ○1 the hypothesis of bioenergy support, ○2 the hypothesis of metabolic network, ○3 the hypothesis of cell economy. If those hypotheses are true, then the results of metabolic guidance for
張星元:發酵原理電子講義附錄1 13 industrial fermentation should be predicted. The theory of industrial fermentation put forward in this paper consists of the three descriptive hypotheses and three predictions Key words: the hypothesis of bioenergy support; the hypothesis of metabolic network the hypothesis of cell economy biola principles of Industrial fermentation metabolic engineering microbial biotechnology 0引言 隨著生物化學丶細胞生物學丶應用分子生物學丶遺傳工程和 代謝工程的發展’工業發酵正在發生一個從技藝到科學的重大變 化’正在向微生物生物工程過渡。在生物工程受到廣泛重視的今 天,有必要把微生物(菌種選育)丶工業微生物學過程(發酵工 藝)和工業微生物學體系(生物反應器)作爲一個整體’在科學 的水平上對工業發酵進行重新審視。 1工業發酵的基本模式 1·1工業發酵理論研究的起點 認真觀察當今發酵工業的現狀’可知∶①大多數的發酵法工 業生產的生產菌種一般均屬於化能異養型微生物叫,工業發酵 產品大多數是從發酵液中提取的微生物細胞的胞外產物,③工業 發酵的目的產物和主要原料一般是有機仁合物。工業發酵原理的 硏究是從這個基礎水平上開始的。 1·2工業發酵的基本模式 爲了研究的方便,必須對 複雜而多樣的工業發酵進行合 工业发酵的基本模式 理的簡化。假定工業發酵依靠 仁能異養型微生物的代謝來獲 得微生物代謝的胞外產物,把 研究的重點放在含碳架的化合 Basic pattern af industrial fermentation 物的代謝(碳代謝)上’經抽 象思維,則可爲工業發酵建立 以微生物活細胞爲中心的基本 圖1工業發酵的基本模式 模式∶⑩培養基中的有機營養物質跨膜進λ微生物活細胞’◎微 生物紐胞的代謝促成工業發酵的目的產物在細胞內生成’③在細 胞內生成的目的產物跨膜排放到培養介質中也就是說’能源化 合物進入細胞’經過代謝轉換·以一種變仳了的形式輸岀。細胞 結構與維持行使細胞功能的有序狀態則是靠消耗能量來保證的
張星元：發酵原理電子講義 附錄 1-3 13 industrial fermentation should be predicted. The theory of industrial fermentation put forward in this paper consists of the three descriptive hypotheses and three predictions. Key words: the hypothesis of bioenergy support； the hypothesis of metabolic network；the hypothesis of cell economy； biological principles of Industrial fermentation ； metabolic engineering ； microbial biotechnology 0 引言： 隨著生物化學、細胞生物學、應用分子生物學、遺傳工程和 代謝工程的發展，工業發酵正在發生一個從技藝到科學的重大變 化，正在向微生物生物工程過渡。在生物工程受到廣泛重視的今 天，有必要把微生物（菌種選育）、工業微生物學過程（發酵工 藝）和工業微生物學體系（生物反應器）作爲一個整體，在科學 的水平上對工業發酵進行重新審視。 1 工業發酵的基本模式 1．1 工業發酵理論研究的起點 認真觀察當今發酵工業的現狀，可知：○1 大多數的發酵法工 業生産的生産菌種一般均屬於化能異養型微生物 [1]，○2 工業發酵 産品大多數是從發酵液中提取的微生物細胞的胞外産物，○3 工業 發酵的目的産物和主要原料一般是有機化合物。工業發酵原理的 研究是從這個基礎水平上開始的。 1．2 工業發酵的基本模式 爲了研究的方便，必須對 複雜而多樣的工業發酵進行合 理的簡化。假定工業發酵依靠 化能異養型微生物的代謝來獲 得微生物代謝的胞外産物，把 研究的重點放在含碳架的化合 物的代謝（碳代謝）上，經抽 象思維，則可爲工業發酵建立 以微生物活細胞爲中心的基本 模式：○1 培養基中的有機營養物質跨膜進入微生物活細胞，○2 微 生物細胞的代謝促成工業發酵的目的産物在細胞內生成，○3 在細 胞內生成的目的産物跨膜排放到培養介質中。也就是說，能源化 合物進入細胞，經過代謝轉換，以一種變化了的形式輸出。細胞 結構與維持行使細胞功能的有序狀態則是靠消耗能量來保證的。 工业发酵的基本模式 Basic pattern of industrial fermentation 圖 1 工業發酵的基本模式
張星元:發酵原理電子講義附錄1 在此基本模式的基礎上’本文作者于1997年提出關於工業 發酵的三個基本觀點。 2工業發酵的三個基本觀贴21 2·1生物能支撐觀點 微生物細胞是工業發酵的目的產物的生產者·微生物細胞 生長和維持需要由其自身的能量轉換機構從其他形式的能量轉化 而形成的可被其自身直接使用的能量一生物能來支撐。因此工業 發酵顯示生物學屬性。 2·2代謝網路觀點 由細胞內外的生化反應網路和跨膜的輸送系統組成的代謝網 路凹既沒有絕對的赶點’也沒有絕對的終點’代謝網路中仼何 個中間產物(包括可與代謝網路“聯網”的任何一種化合物)都 可能被開發成爲工業發酵的目的產物或原料。 2·3細胞經濟觀點 微生物紐胞的經濟性是在自然選擇的過程中逐漸形成的野 生的(未經人工變異的)微生物紐胞在自然選擇的過程中逐漸形 成競爭型的細胞經濟。而工業發酵往往要以目的產物的生產爲主 導’調整代謝網路中的代謝流·構建一種導冋型細胞經濟。從竸 爭型細胞經濟到導冋型經濟的轉變取決於遺傳和環境因素的資訊 導问’這種導向必須遵循細胞經濟的基本運行規律。 3微生物生物工程基本理論的探索 從以上三個基本觀點岀發探索微生物生物工程(工業發酵) 的基本理論 3·1三個基本假說 運用歸納邏輯的方法提出以下三個假說 1.能量支撐假說∶微生物細胞的生長和維持需要其自身能量 轉換機構從其他形式的能量轉仳而形成的生物能來支撐 2.代謝網路假說∶微生物細胞是個遠離平衡狀態的開放體 系’微生物細胞的代謝和生長依賴於橫跨細胞內外的代謝 網路來實現 3.細胞經濟假說∶野生的(未經人工變異的)微生物細胞在 自然選擇的過程中逐漸形成竸爭型的紐胞經濟。 3·2推理 *這個觀點當初是目的產物觀點·後來發展成代謝綗路觀點
張星元：發酵原理電子講義 附錄 1-3 14 在此基本模式的基礎上，本文作者于 1997 年提出關於工業 發酵的三個基本觀點。 2 工業發酵的三個基本觀點 [2] 2．1 生物能支撐觀點 微生物細胞是工業發酵的目的産物的生産者，微生物細胞的 生長和維持需要由其自身的能量轉換機構從其他形式的能量轉化 而形成的可被其自身直接使用的能量—生物能來支撐。因此工業 發酵顯示生物學屬性[4]。 2．2 代謝網路觀點 由細胞內外的生化反應網路和跨膜的輸送系統組成的代謝網 路[4]既沒有絕對的起點，也沒有絕對的終點，代謝網路中任何一 個中間産物 (包括可與代謝網路“聯網”的任何一種化合物) 都 可能被開發成爲工業發酵的目的産物或原料。 2．3 細胞經濟觀點 微生物細胞的經濟性是在自然選擇的過程中逐漸形成的。野 生的（未經人工變異的）微生物細胞在自然選擇的過程中逐漸形 成競爭型的細胞經濟。而工業發酵往往要以目的産物的生産爲主 導，調整代謝網路中的代謝流，構建一種導向型細胞經濟。從競 爭型細胞經濟到導向型經濟的轉變取決於遺傳和環境因素的資訊 導向，這種導向必須遵循細胞經濟的基本運行規律。 3 微生物生物工程基本理論的探索[3] 從以上三個基本觀點出發探索微生物生物工程（工業發酵） 的基本理論： 3．1 三個基本假說 運用歸納邏輯的方法提出以下三個假說： 1. 能量支撐假說：微生物細胞的生長和維持需要其自身能量 轉換機構從其他形式的能量轉化而形成的生物能來支撐。 2. 代謝網路假說：微生物細胞是個遠離平衡狀態的開放體 系，微生物細胞的代謝和生長依賴於橫跨細胞內外的代謝 網路來實現。 3. 細胞經濟假說：野生的（未經人工變異的）微生物細胞在 自然選擇的過程中逐漸形成競爭型的細胞經濟。 3．2 推理 這個觀點當初是目的産物觀點，後來發展成代謝網路觀點
張星元:發酵原理電子講義附錄1 15 運用演繹邏輯的方法從以上假說做出以下推理 1.如果假說1成立·那麼微生物能量代謝的副產物的形成與 分泌將成爲工業發酵工藝控制的重要依據 2.如果假說2成立·那麼代謝網路中任何一種中間產物(或 者是可借助化學丶生物化學或生物學方法而與代謝網路 聯網”的仼何一種化合物)都有可能被開發成爲工業發 的原料或目的產物 3.如果假說1、2丶3和推理2成立,那麼就有可能以目的產 物的生產爲主導·借助育種和條件優化等的手段’調整代 謝網路中的代謝流’構建_種導向型的細胞經濟’從而使 微生物細胞獲得賴以生存的生物能’並且能在細胞外累積 目的產物。然而微生物的細胞經濟從競爭型到導向型的轉 變取決於遺傳和環境因素的資訊導冋’對竸爭型細胞經濟 的過度偏離將導致細胞經濟的崩潰。 〓 Heterol Ac-P PG-区5 GA=3PPK圆[ Alcohol 6 Bifi dog】D 6四-@回→一四 同 ycerol-F-P-Glyu回ank可四c Active Isopen anol 回c【c3m eer fermentation all laetate-produeint Propionate]ropiest…、圆。 ↓cata 回…@位8画画cm 圖2能量代謝副產物的形成
張星元：發酵原理電子講義 附錄 1-3 15 運用演繹邏輯的方法從以上假說做出以下推理： 1. 如果假說 1 成立，那麽微生物能量代謝的副産物的形成與 分泌將成爲工業發酵工藝控制的重要依據。 2. 如果假說 2 成立，那麽代謝網路中任何一種中間産物(或 者是可借助化學、生物化學或生物學方法而與代謝網路 “聯網”的任何一種化合物) 都有可能被開發成爲工業發 酵的原料或目的産物。 3. 如果假說 1、2、3 和推理 2 成立，那麽就有可能以目的産 物的生産爲主導，借助育種和條件優化等的手段，調整代 謝網路中的代謝流，構建一種導向型的細胞經濟，從而使 微生物細胞獲得賴以生存的生物能，並且能在細胞外累積 目的産物。然而微生物的細胞經濟從競爭型到導向型的轉 變取決於遺傳和環境因素的資訊導向，對競爭型細胞經濟 的過度偏離將導致細胞經濟的崩潰。 圖 2 能量代謝副産物的形成[3]
張星元:發酵原理電子講義附錄1 16 Glycogen 6P叵P5[PP GlcNAc 圆1,62 少c 回r 圆rt四 3-P-GA a 一a RCO-ACP] Isoprenoid卜+cog]As 回回回面四四面 圖2細胞組成物質的合成 4工業發酵的23保基本概念 以上基本假說和預測從化能異養型微生物生物生命活動中 的電子流丶碳架物質流’以及理化和生物資訊流三個不同的側面 審視工業發酵中微生物細胞的生命活動·使七十年代末出現“能 量流”丶“資訊流”和“資訊流”的說法在工業發酵領域的到了 具體化工業發酵的三個基本觀點對應於微生物生物工程的三個 重要學說’即細胞能學丶細胞第二解剖學和細胞經濟學。爲了幫 助讀者正確理解以上理論’下面分別從細胞能學(4.1-4.4)丶 細胞第二解剖學(4.5-4.17)和紐胞經濟學(4.18-4.23)三個 方面構建工業發酵的23條基本概念·從微生物生物工程和代謝 工程的魚度來支撐工業發酵的基本理論 4·1微生物紐胞能爲其自身提供生物能 微生物細胞的生存方式與動物丶植物等高等生物的細胞不 同,微生物紐胞能獨立存在’自主生活η。因此每個微生物細胞 都具有能量轉換機構丶這種機構可把其他形式的能量轉換成能被 其自身直接使用的生物動能(如ATP,GTP)和生物勢能(儲 存在膜上的質子運動勢』P)·暫且把生物動能和生物勢能一起 稱爲生物能φ在生物能的直接支撐下’活細胞才能維持其高度有 序的狀態
張星元：發酵原理電子講義 附錄 1-3 16 圖 2 細胞組成物質的合成[3] 4 工業發酵的 23 條基本概念 以上基本假說和預測從化能異養型微生物生物生命活動中 的電子流、碳架物質流，以及理化和生物資訊流三個不同的側面 審視工業發酵中微生物細胞的生命活動，使七十年代末出現“能 量流”、“資訊流”和“資訊流”的說法在工業發酵領域的到了 具體化。工業發酵的三個基本觀點對應於微生物生物工程的三個 重要學說，即細胞能學、細胞第二解剖學和細胞經濟學。爲了幫 助讀者正確理解以上理論，下面分別從細胞能學（4.1—4.4）、 細胞第二解剖學（4.5—4.17）和細胞經濟學（4.18—4.23）三個 方面構建工業發酵的 23 條基本概念，從微生物生物工程和代謝 工程的角度來支撐工業發酵的基本理論。 4．1 微生物細胞能爲其自身提供生物能 微生物細胞的生存方式與動物、植物等高等生物的細胞不 同，微生物細胞能獨立存在，自主生活[7]。因此每個微生物細胞 都具有能量轉換機構，這種機構可把其他形式的能量轉換成能被 其自身直接使用的生物動能 （ 如 ATP，GTP ）和生物勢能（儲 存在膜上的質子運動勢ΔP），暫且把生物動能和生物勢能一起 稱爲生物能。在生物能的直接支撐下，活細胞才能維持其高度有 序的狀態
張星元:發酵原理電子講義附錄1 4·2細胞能量轉換機構的組成 仁能異養型微生物細胞的能量轉換機構包括∶繻要生物能 來啟動的有關酶和這些酶的輔酶丶細胞質膜(原核微生物)和線 粒體的內膜(真核微生物)’以及這些膜上的電子傳遞鏈和 ATP酶丶涉及底物水平磷酸仁的酶和在能量代謝和主動輸送中 起輔助作用的有關載體系統 4·3微生物代謝中的電子流和電子回路 工業發酵普漏使用的仳能異養型微生物靠生物氧仁把仁學能 轉仁爲可被微生物直接利用的生物能。微生物紐胞的生物氧仳過 程必須借助於輔酶,並且其生物氧仳過程和跨膜的主動輸送過程 伴隨著電子(或質子)的流動’形成跨膜的質子回路 4.4生物氧化和輔酶的再生 在微生物活細胞中’參與生物氧仳反應的脫氫酶的輔酶本身 不能跨過膜’被局限在其所在的細胞空間內。它們必須被再生和 回用·以維持能量代謝。脫氫酶的輔酶在細胞的氧仁還原反應中 接受電子而被還原成還原型輔酶’還原型輔酶又把電子釋放給電 子受體’從而實現脫氫酶的輔酶的再生σ根據最終電子受體的類 型,可把生物氧化分成有氧呼吸丶無氧呼吸和發酵(形成能量代 謝副產物)三個類型。 能源化合物一一一電子傳遞鏈一外源電子受體 電子供體) (NADH) (NAD 4微生物呼吸過程中的電子傳遞和脫氫酶輔酶的回用
張星元：發酵原理電子講義 附錄 1-3 17 4．2 細胞能量轉換機構的組成 化能異養型微生物細胞的能量轉換機構包括：需要生物能 來啟動的有關酶和這些酶的輔酶、細胞質膜（原核微生物）和線 粒體的內膜（真核微生物），以及這些膜上的電子傳遞鏈和 ATP 酶、涉及底物水平磷酸化的酶和在能量代謝和主動輸送中 起輔助作用的有關載體系統。 4．3 微生物代謝中的電子流和電子回路 工業發酵普遍使用的化能異養型微生物靠生物氧化把化學能 轉化爲可被微生物直接利用的生物能。微生物細胞的生物氧化過 程必須借助於輔酶, 並且其生物氧化過程和跨膜的主動輸送過程 伴隨著電子（或質子）的流動，形成跨膜的質子回路。 4．4 生物氧化和輔酶的再生 在微生物活細胞中，參與生物氧化反應的脫氫酶的輔酶本身 不能跨過膜，被局限在其所在的細胞空間內。它們必須被再生和 回用，以維持能量代謝。脫氫酶的輔酶在細胞的氧化還原反應中 接受電子而被還原成還原型輔酶，還原型輔酶又把電子釋放給電 子受體，從而實現脫氫酶的輔酶的再生。根據最終電子受體的類 型，可把生物氧化分成有氧呼吸、無氧呼吸和發酵（形成能量代 謝副産物）三個類型。 e - e - e - e - e - 能源化合物 電子傳遞鏈 外源電子受體 （電子供體） (NADH) (NADH) (NAD+ ) 圖 4 微生物呼吸過程中的電子傳遞和脫氫酶輔酶的回用[3]
張星元:發酵原理電子講義附錄1 8 一 →內源電子受體(生成發酵產物) 圖5微生物發酵過程中的電子傳遞和脫氫酶輔酶的回用3 4·5生化反應途徑和代謝途徑 系列按序進行的生物化學反應構成生仁反應途徑;若這條 途徑在活細胞裏運行’則爲代謝途徑。 4·6生化反應網路和代謝網路 生仁反應途徑按生物仳學規律彙成生仁反應網路·代謝途徑 與跨膜輸送系統按代謝規律彙成(物質)代謝網路 4·7代謝網路的聯網問題 代謝中間化合物都在代謝網路上’有些有機仁合物雖然不在 代謝網路中但仍有可能與代謝網路聯網φ所調“聯網”就是用仁 學丶生物化學反應把指定的化合物連接到代謝網路上去’從而使 它與微生物的代謝建立聯繫。聯網可以用化學、生物化學或生物 學方法(含DNA重組技術)來實現。廣義的聯網包含代謝網路 細節不同的生命有機體之問接力賽式的代謝聯繫。已在網上或者 可以聯網的化合物都可能被開發爲工業發酵的產物或原料。 4·8代謝流和碳架物質流 代謝中間仳合物在代謝途徑或代謝綗路中流動形成代謝流 在代謝分析和代謝工程中·代謝流往往首先是指碳架物質流 4·9代謝主流 微生物細胞在一定的培養倏件下進行新陳代謝時’代謝中間 仁合物在代謝網路中流動·流量相對集中的代謝流叫做這種微生 物在該培養條件下的代謝主流φ代謝主流的流量測定是代謝工程 的内容的重要組成部分之一 4·10載流途徑 從字面上講’有代謝物流通過的代謝途徑均爲載流途徑;其 中·代謝主流流經的代謝途徑爲主要載流途徑。代謝工程沒有必 要硏究宪所有的載流途徑的物流量·因此在硏究物流量時它所調的 載流途徑一般是指主要載流途徑
張星元：發酵原理電子講義 附錄 1-3 18 e - e - e - 能源化合物 內源電子受體（生成發酵産物） （電子供體） (NADH) (NADH) (NAD+ ) 圖 5 微生物發酵過程中的電子傳遞和脫氫酶輔酶的回用[3] 4．5 生化反應途徑和代謝途徑 一系列按序進行的生物化學反應構成生化反應途徑；若這條 途徑在活細胞裏運行，則爲代謝途徑。 4．6 生化反應網路和代謝網路 生化反應途徑按生物化學規律彙成生化反應網路，代謝途徑 與跨膜輸送系統按代謝規律彙成（物質）代謝網路。 4．7 代謝網路的聯網問題 代謝中間化合物都在代謝網路上，有些有機化合物雖然不在 代謝網路中但仍有可能與代謝網路聯網。所謂“聯網”就是用化 學、生物化學反應把指定的化合物連接到代謝網路上去，從而使 它與微生物的代謝建立聯繫。聯網可以用化學、生物化學或生物 學方法（含 DNA 重組技術）來實現。廣義的聯網包含代謝網路 細節不同的生命有機體之間接力賽式的代謝聯繫。已在網上或者 可以聯網的化合物都可能被開發爲工業發酵的産物或原料。 4．8 代謝流和碳架物質流 代謝中間化合物在代謝途徑或代謝網路中流動形成代謝流。 在代謝分析和代謝工程中，代謝流往往首先是指碳架物質流。 4．9 代謝主流 微生物細胞在一定的培養條件下進行新陳代謝時，代謝中間 化合物在代謝網路中流動，流量相對集中的代謝流叫做這種微生 物在該培養條件下的代謝主流。代謝主流的流量測定是代謝工程 的內容的重要組成部分之一。 4．10 載流途徑 從字面上講，有代謝物流通過的代謝途徑均爲載流途徑；其 中，代謝主流流經的代謝途徑爲主要載流途徑。代謝工程沒有必 要研究所有的載流途徑的物流量，因此在研究物流量時它所謂的 載流途徑一般是指主要載流途徑
張星元:發酵原理電子講義附錄1 4·11代謝主流的變動性和選擇性 微生物的代謝主流處於不斷變化之中,其方向丶流量甚至 所流經的途徑都可能發生變仳。這就是微生物代謝主流的變動性 和代謝主流對代謝網路中的途徑的選擇性°這種變動和選擇的根 據在微生物紐胞的遺傳物質’選擇的原因是微生物所處的環境條 件的變化。 4·12理想載流途徑 爲了提高產物對原料的轉化率’就要求代謝主流(根據代 謝分析的結果推定的)經設定的載流途徑流到目的產物。因爲這 樣的載流途徑是帶有主觀導向性的虛擬的載流途徑·所以把它們 叫做理想載流途徑 4·13微生物生物工程的難題 既然代謝主流對網路中的途徑有選擇性’而工業發酵的目標 又是要微生物的代謝主流經理想載流途徑·流到目的產物·因此 就有必要去解決理想載流途徑的設計問題和代謝主流的合理導向 問題。 4·14代謝的“五段式”t 在工業發酵生產中,培養器中的微生物細胞的代謝是分步進 行的。胞外營養物質(一般要經胞外酶降解後)從培養介質跨膜 進人細胞’(一般要)經過“注人途徑”丶“中心途徑”和“發 散途徑”等三段連續的代謝途徑的代謝’才能在胞內生成目的產 物·最後’目的產物跨過細胞質膜排岀細胞·回到培養介質。因 此典型的理想載流途徑應該由以上五段承擔不同代謝分工的依次 銜接的代謝途徑組成。這就是載流途徑的“五段式”在這條載 流途徑上流動的代謝主流對應地也有五段’這就是代謝主流的 五段式”(圖1) 4·15設計育種和發酵工藝控制的五字策略 在“代謝主流”和代謝的“五段式”等概念的基礎上·從 不同的闰度出發’提出能作爲一個整體用於設計育種以及發酵工 藝控制的“進丶通、節丶堵丶出”的“五宇策略”:①進,促進 細胞對碳源等營養物質的吸收;②通,使來自上游和各個注人分 支的碳架物質能暢通地流向目的產物;③節,阻塞與目的產物的 形成無關或關不大的代謝支流’使碳架物質相對集中地流向目 的產物;④堵,消除或削弱目的產物進一步代謝的途徑;⑤出 促進目的產物向胞外空間分泌。 4·16代謝網路的節點及其剛性
張星元：發酵原理電子講義 附錄 1-3 19 4．11 代謝主流的變動性和選擇性 微生物的代謝主流處於不斷變化之中，其方向、流量甚至 所流經的途徑都可能發生變化。這就是微生物代謝主流的變動性 和代謝主流對代謝網路中的途徑的選擇性。這種變動和選擇的根 據在微生物細胞的遺傳物質，選擇的原因是微生物所處的環境條 件的變化。 4．12 理想載流途徑 爲了提高産物對原料的轉化率， 就要求代謝主流（根據代 謝分析的結果推定的）經設定的載流途徑流到目的産物。因爲這 樣的載流途徑是帶有主觀導向性的虛擬的載流途徑，所以把它們 叫做理想載流途徑。 4．13 微生物生物工程的難題 既然代謝主流對網路中的途徑有選擇性，而工業發酵的目標 又是要微生物的代謝主流經理想載流途徑，流到目的産物，因此 就有必要去解決理想載流途徑的設計問題和代謝主流的合理導向 問題。[11] 4．14 代謝的“五段式”[1] 在工業發酵生産中，培養器中的微生物細胞的代謝是分步進 行的。胞外營養物質（一般要經胞外酶降解後）從培養介質跨膜 進入細胞，（一般要）經過“注入途徑”、“中心途徑”和“發 散途徑”等三段連續的代謝途徑的代謝，才能在胞內生成目的産 物，最後，目的産物跨過細胞質膜排出細胞，回到培養介質。因 此典型的理想載流途徑應該由以上五段承擔不同代謝分工的依次 銜接的代謝途徑組成。這就是載流途徑的“五段式”。在這條載 流途徑上流動的代謝主流對應地也有五段，這就是代謝主流的 “五段式”（圖 1）。 4．15 設計育種和發酵工藝控制的五字策略[1] 在“代謝主流” 和代謝的“五段式”等概念的基礎上，從 不同的角度出發，提出能作爲一個整體用於設計育種以及發酵工 藝控制的“進、通、節、堵、出”的“五字策略”：①進，促進 細胞對碳源等營養物質的吸收；②通，使來自上游和各個注入分 支的碳架物質能暢通地流向目的産物；③節，阻塞與目的産物的 形成無關或關係不大的代謝支流，使碳架物質相對集中地流向目 的産物；④堵，消除或削弱目的産物進一步代謝的途徑；⑤出， 促進目的産物向胞外空間分泌。 4．16 代謝網路的節點及其剛性 [5]
張星元:發酵原理電子講義附錄1 微生物代謝網路中的途徑的交叉點(代謝流的集散處)叫做 節點·微生物自動抵制節點處代謝物流量分配比率的改變的特性 叫做節點的剛性σ節點的剛性建築在微生物代謝的自動調節機制 上。因此在應用“五字策略”制訂育種方案時應該設法繞過強剛 泩節點,否則育種計劃將難以兌現。 排 進 留 出 t 圖6設計育種和發酵工藝控制的五字策略 4·17代謝網路的剛性 微生物自動抵制代謝網路中代謝物流量分佈的改變的特性叫 做代謝網路的剛性。代謝網路的剛性與主要剛性節點的剛性大 小丶分佈及數量密切相關 4·18微生物活細胞和細胞的經濟性 微生物活細胞是個遠離平衡狀態的開放體系’是一種靠消耗 能量而維持低熵的穩定的動態的特殊結構—一耗散結構坳。從 微生物細胞對能量和仁學物質的內外交換丶增收節支丶協調自強 等規律的客觀存在岀發’把微生物細胞作爲按特殊的經濟規律運 行的經濟實體來看待’並且把這種按特殊的經濟規律運行的、有 利於生存競爭的新陳代謝特性叫做細胞經濟性。細胞的經濟性可 以以生成細胞的重量與消耗基質的重量之比值一一細胞經濟像數 來衡量。 4·19正常代謝和競爭型細胞經濟 微生物在生存競爭中進仁的方向是發展其自身的適應能力和 提高細胞運行的經濟像數。經生存竸爭而幸存下來的野生型微生
張星元：發酵原理電子講義 附錄 1-3 20 微生物代謝網路中的途徑的交叉點（代謝流的集散處）叫做 節點，微生物自動抵制節點處代謝物流量分配比率的改變的特性 叫做節點的剛性。節點的剛性建築在微生物代謝的自動調節機制 上。因此在應用“五字策略”制訂育種方案時應該設法繞過強剛 性節點，否則育種計劃將難以兌現。 4．17 代謝網路的剛性 [5] 微生物自動抵制代謝網路中代謝物流量分佈的改變的特性叫 做代謝網路的剛性。代謝網路的剛性與主要剛性節點的剛性大 小、分佈及數量密切相關。 4．18 微生物活細胞和細胞的經濟性 微生物活細胞是個遠離平衡狀態的開放體系，是一種靠消耗 能量而維持低熵的穩定的動態的特殊結構——耗散結構[20]。從 微生物細胞對能量和化學物質的內外交換、增收節支、協調自強 等規律的客觀存在出發，把微生物細胞作爲按特殊的經濟規律運 行的經濟實體來看待，並且把這種按特殊的經濟規律運行的、有 利於生存競爭的新陳代謝特性叫做細胞經濟性。細胞的經濟性可 以以生成細胞的重量與消耗基質的重量之比值——細胞經濟係數 來衡量。 4．19 正常代謝和競爭型細胞經濟 微生物在生存競爭中進化的方向是發展其自身的適應能力和 提高細胞運行的經濟係數。經生存競爭而幸存下來的野生型微生 圖 6 設計育種和發酵工藝控制的五字策略 N P P 進 通 節 堵 出
張星元:發酵原理電子講義附錄1 21 物在其所棲身的環境中是富有竸爭能力的·並且它們的代謝中間 物在代謝網路中的分佈及紐胞經濟運行狀況有利於細胞生長丶繁 殖和在競爭中獲勝。在上薤條件下’細胞處於正常代謝狀態,細 胞經濟體系呈現競爭型經濟的特色。 4·20異常代謝和導向型細胞經濟 如果工業生產要求微生物在胞外累積某種代謝中間產物 則須對微生物的代謝流進行導向根據已獲得的代謝分析的資 訊’應用“五字策略”就有可能設計理想載流途徑和配套的發酵 培養工藝條件’進而改造菌種丶調整工藝·將代謝主流導向理想 載流途徑σ在導冋向成功的情況下·細胞處於異常代謝狀態’細胞 經濟體系呈現導向型經濟的特色。 4·21細胞經濟受到嚴格的制約 工業發酵依靠細胞群體的代謝來獲得產品·導冋型細胞經濟 固然有利於特定的代謝產物的生產’但競爭型細胞經濟向導向型 細胞經濟的轉仁受到能量代謝丶還原力的平衡等倏件的嚴格制 約’表現出代謝網路的剛性。若細胞經濟實體的運行狀態過度偏 離競爭型運行狀態’活細胞的高度有序狀態將受到嚴重衝擊’最 終導致細胞經濟的崩潰 4·22資訊流指導下的工業發酵 在工業發酵生產中’可以把微生物細胞看作是生物機器,它 們進行能量代謝和物質代謝;同時又可以把它們看作是資訊處理 器’它們複製和傳遞自己的生物資訊η,接收紐胞內外的物理丶 化學甚至外源生物資訊’並在對內外資訊流進行綜合處理的基礎 上’發出代謝調控的指令’在網路剛性的範圍之內搾制微生物細 胞自身的生命活動。 4.23限制性遺傳資訊之謎 可以推測在每個微生物紐胞的遺傳物質中必有其限制性的生 死攸關的遺傳資訊·它們規定微生物細胞生命活動的基本的代謝 網路及其調節機制φ這些遺傳資訊是微生物紐胞能夠自主生活與 獨立存在的依據’也是微生物對環境的有限的適應性以及設計育 種的計劃往往不能完全兌現的內在原因。 5結語 多年來國內外在代謝控制發酵丶設計育種丶代謝工程方面的 許多研究(包括本文作者自己進行的研究8)和有關文獻12 ],已爲上薤基本觀點和基本理論提供了充足的論據。受篇幅的 限制,本文涉及的基本理論的系統的論證將在專著另行發表。期
張星元：發酵原理電子講義 附錄 1-3 21 物在其所棲身的環境中是富有競爭能力的，並且它們的代謝中間 物在代謝網路中的分佈及細胞經濟運行狀況有利於細胞生長、繁 殖和在競爭中獲勝。在上述條件下，細胞處於正常代謝狀態，細 胞經濟體系呈現競爭型經濟的特色。 4．20 異常代謝和導向型細胞經濟 如果工業生産要求微生物在胞外累積某種代謝中間産物， 則須對微生物的代謝流進行導向。根據已獲得的代謝分析的資 訊，應用“五字策略”就有可能設計理想載流途徑和配套的發酵 培養工藝條件，進而改造菌種、調整工藝，將代謝主流導向理想 載流途徑。在導向成功的情況下，細胞處於異常代謝狀態，細胞 經濟體系呈現導向型經濟的特色。 4．21 細胞經濟受到嚴格的制約 工業發酵依靠細胞群體的代謝來獲得産品，導向型細胞經濟 固然有利於特定的代謝産物的生産，但競爭型細胞經濟向導向型 細胞經濟的轉化受到能量代謝、還原力的平衡等條件的嚴格制 約，表現出代謝網路的剛性。若細胞經濟實體的運行狀態過度偏 離競爭型運行狀態，活細胞的高度有序狀態將受到嚴重衝擊，最 終導致細胞經濟的崩潰。 4．22 資訊流指導下的工業發酵 在工業發酵生産中，可以把微生物細胞看作是生物機器，它 們進行能量代謝和物質代謝；同時又可以把它們看作是資訊處理 器，它們複製和傳遞自己的生物資訊[7]，接收細胞內外的物理、 化學甚至外源生物資訊，並在對內外資訊流進行綜合處理的基礎 上，發出代謝調控的指令，在網路剛性的範圍之內控制微生物細 胞自身的生命活動。 4．23 限制性遺傳資訊之謎 可以推測在每個微生物細胞的遺傳物質中必有其限制性的生 死攸關的遺傳資訊，它們規定微生物細胞生命活動的基本的代謝 網路及其調節機制。這些遺傳資訊是微生物細胞能夠自主生活與 獨立存在的依據，也是微生物對環境的有限的適應性以及設計育 種的計劃往往不能完全兌現的內在原因。 5 結語 多年來國內外在代謝控制發酵、設計育種、代謝工程方面的 許多研究（包括本文作者自己進行的研究[8-11]）和有關文獻[12- 22]，已爲上述基本觀點和基本理論提供了充足的論據。受篇幅的 限制，本文涉及的基本理論的系統的論證將在專著另行發表。期