啦叫、蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝G250法,紫外吸收法
实验四、蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝G250法，紫外吸收法
基本原理 利用某些物质的分子吸收紫外光、可见光、 红外光和激光200800mm光谱区的辐射來进行 欠性定量分析和物质结构分析测定的方法。称为 分光光度法或分光光度技术,使用的仪器称为分 光光度计。 这种分光光度计灵敏度高,测定速度快, 应用范围广,其中的紫外/可见分光光度技术更是 生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一
一、基本原理 • 利用某些物质的分子吸收紫外光、可见光、 红外光和激光200 ~ 800 nm光谱区的辐射来进行 定性定量分析和物质结构分析测定的方法。称为 分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分 光光度计。 • 这种分光光度计灵敏度高，测定速度快， 应用范围广，其中的紫外/可见分光光度技术更是 生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一
紫外区可分为紫外(近紫外)和真空紫外 (远素外)。由于吸收池(又称样品池、 比色杯芍)和光学元件以及氧气能吸收小 于190m波长的光,因此常规紫外测定集 中在近紫外区,即200nm-400m。可见光 区为400nm800nm
• 紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外 （远紫外）。由于吸收池（又称样品池、 比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小 于190nm波长的光，因此常规紫外测定集 中在近紫外区，即 200nm-400nm。可见光 区为400nm -800nm
测定某物质的紫外吸收光谱的曲线,·可与己 知标准的紫外光谱囹相对照,对照时须注意测定的 条件,如溶剂、浓度等。 常用标准的紫处吸收光谱是萨德勒研究实验 司编制的“ Sadtler紫外标准图谱集,到七十年 代末为止巴收集28585个化合物紫外光谱图。此外 还有药物和非极性溶剂紫外光谱图2000多幅。 由于化合物紫外吸收峰较少,而且峰形都很 宽,不象红外光谱是许多指纹峰,所以在用萦外吸 收光谱进行化合物定性鉴定时,应注意:化合物相 同,其紫外光谱应完全相同:但是紫外光谱相同不 定化合物就相同可能仅是存在某些相同的发色 团或基团,因此在鉴定时应与红外光谱相结合
• 测定某物质的紫外吸收光谱的曲线，可与已 知标准的紫外光谱图相对照，对照时须注意测定的 条件，如溶剂、浓度等。 常用标准的紫处吸收光谱是萨德勒研究实验 公司编制的“Sadtler”紫外标准图谱集，到七十年 代末为止已收集28585个化合物紫外光谱图，此外 还有药物和非极性溶剂紫外光谱图2000多幅。 由于化合物紫外吸收峰较少，而且峰形都很 宽，不象红外光谱是许多指纹峰，所以在用紫外吸 收光谱进行化合物定性鉴定时，应注意：化合物相 同，其紫外光谱应完全相同；但是紫外光谱相同不 一定化合物就相同，可能仅是存在某些相同的发色 团或基团，因此在鉴定时应与红外光谱相结合
1, Beer-Lambert定律 明伯一比尔光吸收定律 A=-lgT=ab C A:吸光度,又称光密度“O.D。 丁:透光度,T=I/ I。为照射到吸收池上的光强, 为透过吸收池的光强) E:摩尔吸光系数或克分子吸光系数(Lmol-1cm-1)。 b:样品光程(cm),通常使用1.0cm的吸收地, b=1cm。 C:样品浓度(mo/L)。 由上式可以看出:吸光度A与物质的吸光系数“E”和 物质的浓度“C”成正比
1. Beer-Lambert 定律 朗伯-比尔光吸收定律： A＝－lgT＝εb c A：吸光度，又称光密度“O.D”。 T：透光度， T＝I / I。（ I。为照射到吸收池上的光强， I为透过吸收池的光强） ε：摩尔吸光系数或克分子吸光系数（L·mol－1·cm－1）。 b：样品光程（cm），通常使用1. 0cm 的吸收地， b=1cm。 c：样品浓度（mol/L）。 由上式可以看出：吸光度A与物质的吸光系数“ε”和 物质的浓度“C”成正比
摩尔吸光系数:A bC,是物质对某波长的光的吸收能 勿的量度。ε越大,吸收光的能力越强,相应的分光度法 测的灵敏度就越高。E值越大,说明电子跃迁的几率大, 通劳E=10-105:一般认为E>10为强吸收:E=103 104为较强吸收:E<102为弱吸收,此时分光光度法不 灵教。 )因为通常使用分光光度计可检测出的最小吸光度A= 0.001,所以,当b=1cm,E=10时,可检测的溶液最小 浓度是C=108mo/l
• 摩尔吸光系数： ， 是物质对某波长的光的吸收能 力的量度。ε越大，吸收光的能力越强，相应的分光度法 测定的灵敏度就越高。ε值越大，说明电子跃迁的几率大， 通常 ε＝10-105：一般认为ε＞ 104为强吸收；ε＝103 - 104 为较强吸收；ε＜ 102 为弱吸收，此时分光光度法不 灵敏。 • 因为通常使用分光光度计可检测出的最小吸光度A＝ 0.001, 所以，当b＝1cm, ε＝105时，可检测的溶液最小 浓度是C＝10-8 mol/L
吸光度“A”有一个重要性质是其具有加和性: 即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光 度的身术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。 若溶液中各溶质的吸光系数相同,则各溶质吸光度的大小 与溶质浓度成比例。 例一:尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定260nm处的吸 光度为0.650,用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070 身尿嘧啶溶液的摩尔浓度,已知其摩尔吸光系数 82×103M-1cm-1(M=mo/L)。 A=EbC∴A=(溶剂加样品的吸光度)-(溶剂的吸光度) A=0.650-0.070=0.580 ∵b=1cm ∵C==7.1×10-5mol/L
吸光度“A”有一个重要性质是其具有加和性： 即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光 度的算术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。 若溶液中各溶质的吸光系数ε相同，则各溶质吸光度的大小 与溶质浓度成比例。 例一：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定 260nm处的吸 光度为0.650，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070， 计算尿嘧啶溶液的摩尔浓度，已知其摩尔吸光系数 = 8.2×103 M－1cm－1（M＝mol / L）。 ∵A＝εbC ∵A＝（溶剂加样品的吸光度）－（溶剂的吸光度） ∴A＝0.650－0.070＝0.580 ∵b＝1cm ∴C==7.1×10－5 mol / L
3,影响吸光系数的因素 E的大小取决于物质的本性和光的波长 化学因素 容液中溶质可因浓度改变而有离解、缔合与溶 剂间的作用等等原因而发生偏离Bee定律的现 象 化学因素引起的偏离,有时可控制溶液浓度设 法减免。比如在强酸性溶液中滴定铬酸溶液就 可以避免偏离现象。 光学因素 非单色光、条散光、散射光、反射光以及非平 行光等都会造成偏高现象
3. 影响吸光系数的因素 ε的大小取决于物质的本性和光的波长 化学因素： 溶液中溶质可因浓度改变而有离解、缔合与溶 剂间的作用等等原因而发生偏离Beer定律的现 象。 化学因素引起的偏离，有时可控制溶液浓度设 法减免。比如在强酸性溶液中滴定铬酸溶液就 可以避免偏离现象。 光学因素： 非单色光、杂散光、散射光、反射光以及非平 行光等都会造成偏离现象
斯亮蓝G250法 原理:考马斯亮蓝G250与蛋白质结合后,其最大 吸收波长从465nm改变为595mm,该蛋白一染料复合 物吸光系数很高,所以检测灵敏度很高,可以测 定1的蛋白质,染料和蛋白结合只需要2分 珅,颜色在1小时内稳定。操作便,快速,是常 用的蛋白含量测定方法之一。 °去污剂,粘多糖等严重干扰该方法的测定 °试剂:标准蛋白质溶液(0.5mg/m1) 考马斯亮蓝G250蛋白染色剂
考马斯亮蓝G250法 • 原理：考马斯亮蓝G250与蛋白质结合后，其最大 吸收波长从465nm改变为595nm,该蛋白－染料复合 物吸光系数很高，所以检测灵敏度很高，可以测 定1μg /mL的蛋白质，染料和蛋白结合只需要2分 钟，颜色在1小时内稳定。操作简便，快速，是常 用的蛋白含量测定方法之一。 • 去污剂，粘多糖等严重干扰该方法的测定 • 试剂:标准蛋白质溶液（0.5 mg/ml） 考马斯亮蓝G250蛋白染色剂
操作步骤 标准曲线的绘制:取8只试管,分别加入0,0.4, 0.6,0.8,1.0,1.,2,1.4,1.6n标准蛋白质溶液, 用水补是体积至3mL然后加入5m考马斯亮蓝试剂 震荡混匀,2分钟后于595nm测定吸光值,以蛋白质 浓度为横坐标,光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。 样晶测定:样品液1mL,用水补足体积至3mL,然后 加入5m考马斯亮蓝试剂,595nm测定吸光值。从 标准曲线中查出相应的浓度 ●计算样品中蛋白质的含量
操作步骤 • 标准曲线的绘制： 取8只试管，分别加入0，0.4， 0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6mL标准蛋白质溶液， 用水补足体积至3mL,然后加入5ml考马斯亮蓝试剂， 震荡混匀，2分钟后于595nm测定吸光值，以蛋白质 浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。 • 样品测定： 样品液1mL ,用水补足体积至3mL,然后 加入5ml考马斯亮蓝试剂， 595nm测定吸光值。从 标准曲线中查出相应的浓度。 • 计算 样品中蛋白质的含量