实验4免疫组织化学和原位杂交技术一、实验目的：熟悉并掌握免疫组化的基本方法二、实验原理：免疫组化，是应用免疫学基本原理一一抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究.FoshanUniversity
Foshan University 实验4 免疫组织化学和原位杂交技术 一、实验目的：熟悉并掌握免疫组化的基本方法。 二、实验原理： 免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合 的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素） 显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研 究
三、材料与试剂：1.材料：不同处理方法的组织块；载玻片；恒温培养箱；微波炉；免疫组化湿盒；石蜡包埋机：组织切片机：摊片机：量筒：烧杯：染色框。2.试剂：多聚赖氨酸，3%H,O(现配)；DAB显色剂；PBS缓冲液；APES封片剂；中性树胶；苏木素；兔抗人ER多克隆一抗，PV-9000试剂盒。FoshanUniversity
Foshan University 三、材料与试剂： 1. 材料：不同处理方法的组织块；载玻片；恒温培养箱；微波炉；免疫组化湿盒；石蜡 包埋机；组织切片机；摊片机；量筒；烧杯；染色框。 2.试剂： 多聚赖氨酸，3%H2O2 (现配)；DAB显色剂；PBS缓冲液；APES封片剂；中性树胶；苏木 素；兔抗人ER多克隆一抗， PV-9000试剂盒
四、实验方法：1.洗载玻片2.包埋组织3.切片：4.捞组织：5.脱蜡6.抗原修复7.血清封闭Foshan University
Foshan University 四、实验方法 ： 1. 洗载玻片 2. 包埋组织 3. 切片 ： 4. 捞组织 ： 5. 脱蜡 6. 抗原修复 7. 血清封闭
8.加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦于载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗加完一抗后37℃2h，然后于4℃冰箱中保存过夜。9.加二抗：将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上二抗，然后置于37°C温箱中半小时。FoshanUniversity
Foshan University 8. 加一抗： 将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，加一抗， 加完一抗后37°C 2h，然后于4°C冰箱中保存过夜。 9. 加二抗： 将载玻片从冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上二 抗,然后置于37°C温箱中半小时
10.加显色剂：将片子从温箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦于组织周围的PBS后加上显色剂。（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀）A：DABB：H,O,C：磷酸缓冲液。FoshanUniversity
Foshan University 10. 加显色剂： 将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显 色剂。（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇 匀，再加1滴显色剂C，摇匀） A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液
11.复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，3s左右即可。12.脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。13.封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。FoshanUniversity
Foshan University 11. 复染： 将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，3s左右即可。 12. 脱水： 将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95% 酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯 中，搬到通风柜中。 13. 封片： 用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧， 以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干
实验分3组1.怀孕母鼠组：取材：子宫，子宫颈（胞质阳性、胞核阳性）、卵巢、乳腺、下丘脑、脑垂体、肾上腺2.犬肿瘤组：乳腺（阳性对照）3.豚鼠组：取材：子宫，子宫颈（胞质阳性、胞核阳性）、卵巢、乳腺、下丘脑、脑垂体、肾上腺FoshanUniversity
Foshan University 实验分3组 1.怀孕母鼠组： 取材：子宫，子宫颈（胞质阳性、胞核阳性）、卵巢、乳腺、下丘脑、脑 垂体、肾上腺 2.犬肿瘤组：乳腺（阳性对照） 3.豚鼠组： 取材：子宫，子宫颈（胞质阳性、胞核阳性）、卵巢、乳腺、下丘脑、脑垂体、肾上腺
荧光原位杂交(Fluorescence in situhybridization,FISH)
（Fluorescence in situ hybridization,FISH）
原位杂交（ISH)将标记的原位杂交(in situ hybridization,ISH)核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交。原位杂交技术(ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。·使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置FoshanUniversity
Foshan University 原位杂交（ISH） • 原位杂交 (in situ hybridization, ISH) 将标记的 核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交。 • 原位杂交技术(ISH)是分子生物学、组织化学 及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于 20世纪60年代。 • 使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另 一条链在细菌或其他真核细胞中的位置
基本原理·根据碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA两条单链在一定条件下能结合成双链。用放射性或非放射性物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补的cDNA作探针，与组织切片或细胞内待测核酸(RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DAN的存在与定位。FoshanUniversity
Foshan University 基本原理 • 根据碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA 、DNA-RNA和RNA-RNA两条单链在一定 条件下能结合成双链。用放射性或非放射 性物质标记的DNA、RNA或与mRNA互补 的cDNA作探针，与组织切片或细胞内待测 核酸(RNA或DNA）片段进行杂交，然后可 用放射自显影等方法予以显示，在光镜或 电镜下观察目的 mRNA或DAN 的存在与定 位