第四章核酸的体外扩增 第一节聚合酶链反应 一、PCR技术简史 PCR的实现 1985年关国PE-Ctus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划 时代意义的聚合酶反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合 成提供一种合适的条件：摸板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合适的缓冲体系，以及 DNA变性 复性及延伸的温度与时间 PCR的改进与完善 MIis最初使用的DNA聚合酶是大畅杆菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90C会变性失活，每次循环都需要重新 添加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产 物特异性较差，合成的DNA片段不均 这种以KI PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于 Klenow薛不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致聚合薛钝化，每加入 一次酶只能完 成一个扩增反应周期，给P℃R技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内 没能引起生物医学界的足够重视。 1988年初，Keohan g改用T4DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA片段很均一，真 实性也较高， 只有所期望的一种DNA片段。但每循环 仍需加入新 1988年Saiki等从 一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合 薛。此醉具有以下特点 ①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残 留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原米的40%。②在热变性时不会被 钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠 杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。 此酶的发现使PCR广泛的被应用。 PCR技术的基本原理 1、 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性-退火一延伸三个基本反应步骤构成： ①变性(denature):模板DNA经加热至95C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链NA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。 ②退火(anm ealing)(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，将温度降至引物的Tm 值左右或以下(55℃左右)，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合，形成杂交链。 ③延伸(extension):DNA模板一引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为 反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互 补的半保留复制链。 以上三步为 一个循环，约需2一4分钟，每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此 循环30次， 大约2-3小时后，新生DNA片段理论上可达到2”-1个分子拷贝 三、PCR反应体系与反应条件 1、标准的PCR反应体系(50~100u1)
第四章 核酸的体外扩增 第一节 聚合酶链反应 一、PCR 技术简史 PCR 的实现 1985 年美国 PE-Cetus 公司人类遗传研究室的 Mullis 等发明了具有划 时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于 DNA 的体内复制，只是在试管中给 DNA 的体外合 成提供一种合适的条件：摸板 DNA 、寡核苷酸引物、DNA 聚合酶、合适的缓冲体系，以及 DNA 变性、复性及延伸的温度与时间。 PCR 的改进与完善 Mullis 最初使用的 DNA 聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的 Klenow 片段，其缺点是：①Klenow 酶不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都需要重新 添加。②引物链延伸反应在 37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其 PCR 产 物特异性较差，合成的 DNA 片段不均一。 这种以 Klenow 酶催化的 PCR 技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于 Klenow 酶不耐热，在 DNA 模板进行热变性时，会导致聚合酶钝化，每加入一次酶只能完 成一个扩增反应周期，给 PCR 技术操作程序添了不少困难。这使得 PCR 技术在一段时间内 没能引起生物医学界的足够重视。 1988 年初，Keohanog 改用 T4 DNA 聚合酶进行 PCR，其扩增的 DNA 片段很均一，真 实性也较高，只有所期望的一种 DNA 片段。但每循环一次，仍需加入新酶。 1988 年 Saiki 等从一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热 DNA 聚合 酶。 此酶具有以下特点： ①耐高温，在 70℃下反应 2h 后其残留活性大于原来的 90%，在 93℃下反应 2h 后其残 留活性是原来的 60%，在 95℃下反应 2h 后其残留活性是原来的 40%。②在热变性时不会被 钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠 杆菌多聚酶 I Klenow 片段区别，将此酶命名为 Taq DNA 多聚酶(Taq DNA Polymerase)。 此酶的发现使 PCR 广泛的被应用。 二、PCR 技术的基本原理 1、基本原理 类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： ①变性（denature）：模板 DNA 经加热至 95℃左右一定时间后，使 模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。 ②退火（annealing）（复性）：模板 DNA 经加热变性成单链后，将温度降至引物的 Tm 值左右或以下（55℃左右），引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合，形成杂交链。 ③延伸(extension)：DNA 模板-引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为 反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互 补的半保留复制链。 以上三步为一个循环，约需 2～4 分钟，每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此 循环 30 次，大约 2-3 小时后，新生 DNA 片段理论上可达到 2 n -1 个分子拷贝。 三、PCR 反应体系与反应条件 1、 标准的 PCR 反应体系 （50～100ul）
10X缓神液 1/10体积 4种dNTP混合物 各200umol/M 引物 各1umol/ 模板DNA 102~105拷贝 Taq DNA聚合酶 1-5u Mg?+ 1.5mmol/几. 双蒸水 至50-100u1 2、PCR引物设计 PCR反应中有两条引物，即5'端引物和3'引物。设计引物时以一条DA单链为基 准（常以信息链为基准），5'端引物与位于待扩增片段5'端上游的一小段DNA序列相同： 3'瑞引物与位于待扩增片段3'端的一小段DA序列互补。 引物设计的基本原则： ①引物长度：15-30br 常用为20 p左右 ②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条 带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嗦吟或嘧啶核苷酸的成串排列。 ③引物内部不应出现互补序列： ④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3·瑞的互补重叠 ⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3末端连续8个碱基在待扩 增区以外不能有 则易导致非特异性扩增 ⑥引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和 C ⑦引物的5·端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、 地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。 3、模板的制备 PCR的模板可以是DNA,也可以是RNA。 模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也 可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。 标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS 和蛋白德处理。难以破碎的细菌 ,可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA,经酚、 氯仿抽提纯化 再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板， 4、PCR反应条件的控制 (一)PCR反应的缓冲液 提供合话的酸战度与某些离子 (二)镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol (三)底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20~200umol/L (四)TaqDNA聚合酶 2.50(100u1) (五)引物 浓度一般为0.1一0.5umol/1 (六)反应温度和循环次数 ①变性温度和时间 95C.30s ②退火温度和时间 低于引物Tm值5C左右，一般在45-55G ③延伸温度和时间 72C,1min/b(10kb内) ④循环次数 25~30次 Tm值=4(G+C)+2(A+T) 四、PCR反应特点
10×缓冲液 1/10 体积 4 种 dNTP 混合物 各 200umol/L 引物 各 1u mol/L 模板 DNA 102 ～105 拷贝 Taq DNA 聚合酶 1～ 5u Mg2+ 1.5mmol/L 双蒸水 至 50～100ul 2、PCR 引物设计 PCR 反应中有两条引物，即 5′端引物和 3′引物。设计引物时以一条 DNA 单链为基 准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段 5′端上游的一小段 DNA 序列相同； 3′端引物与位于待扩增片段 3′端的一小段 DNA 序列互补。 引物设计的基本原则： ①引物长度：15-30bp，常用为 20bp 左右。 ②引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条 带。ATGC 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ③引物内部不应出现互补序列： ④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免 3 ′端的互补重叠。 ⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过 70%，引物 3′末端连续 8 个碱基在待扩 增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。 ⑥引物 3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是 G 和 C。 ⑦引物的 5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、 地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。 3、模板的制备 PCR 的模板可以是 DNA，也可以是 RNA。 模板的取材主要依据 PCR 的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也 可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。 标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过 SDS 和蛋白酶 K 处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加 EDTA 处理。所得到的粗制 DNA，经酚、 氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作 PCR 反应模板。 4、PCR 反应条件的控制 （一）PCR 反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子 （二）镁离子浓度 总量应比 dNTPs 的浓度高，常用 1.5mmol/L （三）底物浓度 dNTP 以等摩尔浓度配制，20～200umol/L （四）TaqDNA 聚合酶 2.5U（100ul） （五）引物 浓度一般为 0.1 ～ 0.5umol/L （六）反应温度和循环次数 ①变性温度和时间 950 C，30s ②退火温度和时间 低于引物 Tm 值 5 0 C 左右，一般在 45～550 C ③延伸温度和时间 720 C，1min/kb（10kb 内） ④循环次数 25 ～ 30 次 Tm 值=4(G+C) ＋2(A+T) 四、PCR 反应特点
1、特异性强 PCR反应的特异性决定因素为： ①引物与模板DNA特异正确的结合：（关键 ②碱基配对原则： ③Taq DNA聚合薛合成反应的忠实性： ④靶基因的特异性与保守性。 2、灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数级增加的 ,能将皮克(g=10量级的起始特测模板扩增到 微克(ug=10)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞：在细菌学中最小检出率为3个细 图。 度要求低 五、PCR扩增产物的分析 1、凝胶电泳分 装聘聚电皮用聚测教冰分考效果球脂糖好，条行比较集中。 可用于科研及检测分析。 2、酶切分析 3、分子杂交 4、核酸序列分析 六、PCR技术应用进展(P189-192 第二节连接酶链反应 (Ligase chain reaction,LCR) 连接酶链反应的最大优势在于能准确地分析基因序列中单个碱基突变。LCR的引物是两 对分别互补的引物，引物长度为20~26个。LCR识别点突变的特异性高于PCR,其特异性首 先取决于引物与模板的特异性结合，其次是耐热连接酶的特异性。 LCR的基本原理：利用DN连接酶特异地将双链DM片段连接，经变性-退火-连接三步 骤反复循环。若引物对与模板完全互补，则在DA连接酶作用下，使得相邻两个引物A和B、 A'和B'连接、扩增。若引物所对应的模板发生了碱基突变，引物间就不能连接和扩增。 第三节逆转录PCR(RT一PCR) 一、逆转录 所谓逆转录，是指以NA为模板，利用宿主细胞中4种dNTP为原料在引物的3'端以 5→3 方向合成与RNA互补的DNA链的过程，此过程与中心法则相反，故称为逆转录
1、特异性强 PCR 反应的特异性决定因素为： ①引物与模板 DNA 特异正确的结合；（关键） ②碱基配对原则； ③Taq DNA 聚合酶合成反应的忠实性； ④靶基因的特异性与保守性。 2、灵敏度高 PCR 产物的生成量是以指数级增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到 微克(ug=10-6 )水平。能从 100 万个细胞中检出一个靶细胞；在细菌学中最小检出率为 3 个细 菌。 3、简便、快速 4、对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总 RNA 均可作为扩增模板。可直接用 临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的 DNA 扩增检测。 五、PCR 扩增产物的分析 1、凝胶电泳分析 琼脂糖凝胶电泳：通常应用 1～2%的琼脂糖凝胶， 供检测用。 聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中， 可用于科研及检测分析。 2、酶切分析 3、分子杂交 4、核酸序列分析 六、PCR 技术应用进展 （P189-192） 第二节 连接酶链反应 （Ligase chain reaction，LCR） 连接酶链反应的最大优势在于能准确地分析基因序列中单个碱基突变。LCR 的引物是两 对分别互补的引物，引物长度为 20～26 个。LCR 识别点突变的特异性高于 PCR，其特异性首 先取决于引物与模板的特异性结合，其次是耐热连接酶的特异性。 LCR 的基本原理：利用 DNA 连接酶特异地将双链 DNA 片段连接，经变性-退火-连接三步 骤反复循环。若引物对与模板完全互补，则在 DNA 连接酶作用下，使得相邻两个引物 A 和 B、 A ′和 B ′连接、扩增。若引物所对应的模板发生了碱基突变，引物间就不能连接和扩增。 第三节 逆转录 PCR（RT—PCR） 一、逆转录 所谓逆转录，是指以 RNA 为模板，利用宿主细胞中 4 种 dNTP 为原料在引物的 3′端以 5′→3′ 方向合成与 RNA 互补的 DNA 链的过程，此过程与中心法则相反，故称为逆转录
(reverse transcription)。在逆转录过程中以RNM指导的DNA聚合酶称为逆转录座(reverse transcripinase)。实际上，逆转录并非转录，而是一种复制形式，必须有引物存在才能完成， 二、逆转录酶 1970年Temin在Rous肉瘤病毒、Baltimor心在白血病病毒中各自发现了逆转录酶，以 后发现所有RNA肿瘤病毒中都含有逆转录酶。逆转录酶是逆转录病毒RNM编码的，是多功 ①具有RNA指导的DNA聚合酶活性，能和其它DNM聚合酶一样，沿5'一3'方向合成DNA 并需婴引物提供 -OH ②具有RNA酶H(RNaseH)活性，能特异性水解RNA-DNM杂交体上的RNA: ③具有DNA指导的DNA聚合酶活性，以逆转录合成的单链DNA为模板合成互补DNA链。 逆转录酶对DA没有3'5'外切酶活性，因此它没有校对功能，错误率相对较高。 三、RT-PCR的原理(P62-63 四、RT-PCR的反应体系 逆转录体系 MgCl2 4μ1(5mmol/L) Buffe 2u1(1×) dNTP混合物 8μ1(1μmol/L RNase抑制剂 0.5u1(1u/u1) 反转录酶 1u1(0.25/u1) 随机引物混合物 1u1(2.5μmol/L) 总RNA 逆转录反应在42C进行1h后，加热至95C5min,灭活逆转录酶。取2u1反应产物. 按DNA为模板的PCR反应步骤，进行扩增反应。 第四节RNA的体外扩增
（reverse transcription）。在逆转录过程中以 RNA 指导的 DNA 聚合酶称为逆转录酶（reverse transcriptnase）。实际上，逆转录并非转录，而是一种复制形式，必须有引物存在才能完成。 二、逆转录酶 1970 年 Temin 在 Rous 肉瘤病毒、Baltimore 在白血病病毒中各自发现了逆转录酶，以 后发现所有 RNA 肿瘤病毒中都含有逆转录酶。逆转录酶是逆转录病毒 RNA 编码的，是多功 能酶： ①具有RNA指导的DNA聚合酶活性，能和其它DNA聚合酶一样，沿5′→3′方向合成DNA， 并需要引物提供 3′—OH ； ②具有 RNA 酶 H（RNaseH）活性，能特异性水解 RNA-DNA 杂交体上的 RNA； ③具有 DNA 指导的 DNA 聚合酶活性，以逆转录合成的单链 DNA 为模板合成互补 DNA 链。 逆转录酶对 DNA 没有 3′ 5′外切酶活性，因此它没有校对功能，错误率相对较高。 三、RT-PCR 的原理（P62-63） 四、RT-PCR 的反应体系 逆转录体系 MgCl2 4μl（5m mol/L） Buffer 2 μl（1×） dNTP 混合物 8 μl（1 μmol/L ） RNase 抑制剂 0.5 μl（1u/ μl ） 反转录酶 1 μl（0.25u/ μl） 随机引物混合物 1 μl（2.5 μmol/L ） 总 RNA 1 μl（1 μg） 无 RNase 的 dH2O 至总体积 20 μl 逆转录反应在 420 C 进行 1h 后，加热至 950C5min，灭活逆转录酶。取 2 μl 反应产物， 按 DNA 为模板的 PCR 反应步骤，进行扩增反应。 第四节 RNA 的体外扩增