第十一章 基因诊断与基因治疗 刘智敏 基础医学院生物化学与分子生物学教研室
第十一章 基因诊断与基因治疗 基础医学院生物化学与分子生物学教研室 刘智敏
第一节基因诊断 一、基因诊断的概念 基因诊断(gene diagnosis.)是以DNA和RNA为诊断材料， 通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和 疾病作出诊断的方法和过程。其基本原理是检测DNA或 RNA的结构变化与否，量的多少及表达功能是否正常， 以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作 为疾病确诊的依据
第一节 基因诊断 基因诊断(gene diagnosis)是以DNA和RNA为诊断材料， 通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和 疾病作出诊断的方法和过程。其基本原理是检测DNA或 RNA的结构变化与否，量的多少及表达功能是否正常， 以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以此作 为疾病确诊的依据。 一、基因诊断的概念
临床意义：在于不仅能对疾病作出早期、确切诊断，而 且也能确定个体对疾病的易感性及疾病的分期分型、疗 效监测、预后判断等。近年来，随着基因诊断技术的发 展和应用，基因诊断的原理和方法不仅适用于遗传性疾 病，而且已广泛应用于感染性疾病和肿瘤的诊断以及法 医学等领域
临床意义: 在于不仅能对疾病作出早期、确切诊断，而 且也能确定个体对疾病的易感性及疾病的分期分型、疗 效监测、预后判断等。近年来，随着基因诊断技术的发 展和应用，基因诊断的原理和方法不仅适用于遗传性疾 病，而且已广泛应用于感染性疾病和肿瘤的诊断以及法 医学等领域
二、基因诊断的技术方法 (一)基因诊断中常用的分子生物学技术 1、核酸分子杂交关于核酸分子杂交的基本原理和基 本类型前面已讲。在这些方法中： (1)Southern!印迹法 是最经典的基因分析方法，不 但能检出特异的DNA片段，而且能进行定位和测定分子量， 可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。 (2)Northern印迹法 可用于组织细胞中总RNA或 mRNA的定性和定量分析
1、核酸分子杂交 关于核酸分子杂交的基本原理和基 本类型前面已讲。在这些方法中： （1）Southern印迹法 是最经典的基因分析方法，不 但能检出特异的DNA片段，而且能进行定位和测定分子量， 可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。 （2）Northern印迹法 可用于组织细胞中总RNA或 mRNA的定性和定量分析。 二、基因诊断的技术方法 （一）基因诊断中常用的分子生物学技术
(3)斑点杂交 可用于基因组中特定基因及其表达的定性 及定量分析。优点：方法简单、快速、灵敏、样品用量少； 缺点：是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一 定比例的假阳性。 (4)原位杂交可查明染色体中特定基因的位置，用于 染色体疾病的诊断。原位杂交的结果是显示有关核酸序列 的空间位置状况，因此可检出含核酸序列的具体细胞，细 胞具体定位、数目及类型，可检出基因和基因产物的亚细 胞定位
（3）斑点杂交 可用于基因组中特定基因及其表达的定性 及定量分析。优点：方法简单、快速、灵敏、样品用量少； 缺点：是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一 定比例的假阳性。 （4）原位杂交 可查明染色体中特定基因的位置，用于 染色体疾病的诊断。原位杂交的结果是显示有关核酸序列 的空间位置状况，因此可检出含核酸序列的具体细胞，细 胞具体定位、数目及类型，可检出基因和基因产物的亚细 胞定位
2、聚合酶链式反应(PCR) PCR技术在基因诊断中已得到广泛应用。在应用中，PCR 常与其它技术如分子杂交、限制酶酶谱分析、单链构象多 态性检测、限制性片段长度多态性分析、DNA序列测定等 联合应用。 3、单链构象多态性检测 单链构象多态性(single strand conformation pol ymorph i sm,SSCP)检测是一种基于单链DNA构象差别来 检测点突变的方法
PCR技术在基因诊断中已得到广泛应用。在应用中，PCR 常与其它技术如分子杂交、限制酶酶谱分析、单链构象多 态性检测、限制性片段长度多态性分析、DNA序列测定等 联合应用。 2、聚合酶链式反应(PCR) 3、单链构象多态性检测 单链构象多态性(single strand conformation polymorphism，SSCP)检测是一种基于单链DNA构象差别来 检测点突变的方法
原理：DNA经变性形成单链后，在中性条件下单链DNA 会因其分子内碱基之间的相互作用，形成一定的立体 构象。相同长度的单链DNA,如果碱基序列不同，形 成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。长 度相同而构象不同的单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳(PAGE)中表现出不同的迁移率。SSCP常与PCR 联合应用，称为PCR-SSCP技术
原理：DNA经变性形成单链后，在中性条件下单链DNA 会因其分子内碱基之间的相互作用，形成一定的立体 构象。相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形 成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。长 度相同而构象不同的单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳(PAGE)中表现出不同的迁移率。SSCP常与PCR 联合应用，称为PCR-SSCP技术
4、限制酶酶谱分析 基因突变可能导致基因上某一限制酶识别位点的丢 失或其相对位置发生改变，以此酶消化待测DNA和野 生型对照DA,通过比较二者的酶切片段的长度、数 量上的差异就可判断待测DNA的突变情况
基因突变可能导致基因上某一限制酶识别位点的丢 失或其相对位置发生改变，以此酶消化待测DNA和野 生型对照DNA，通过比较二者的酶切片段的长度、数 量上的差异就可判断待测DNA的突变情况。 4、限制酶酶谱分析
5、DNA序列测定 DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法。 不仅可确定突变的部位，而且可确定突变的性质。由于PC技术 的应用，使DNA测序技术从过去的分子克隆后测序进入扩增产物 直接测序的新阶段。 现在发展了一种双链DNA循环测序法(dsDNA cycle sequencing),其特点是直接以PCR产物为模板，在测序体系中 以Taq DNA聚合酶替代测序酶，而引物的5'端带有标记，通过 多次变性、退火、延伸的循环来完成测序反应，因此具有快速、 简便、灵敏、重复性好等优点
DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法。 不仅可确定突变的部位，而且可确定突变的性质。由于PCR技术 的应用，使DNA测序技术从过去的分子克隆后测序进入扩增产物 直接测序的新阶段。 现在发展了一种双链DNA循环测序法(dsDNA cycle sequencing)，其特点是直接以PCR产物为模板，在测序体系中 以Taq DNA聚合酶替代测序酶，而引物的5＇端带有标记，通过 多次变性、退火、延伸的循环来完成测序反应，因此具有快速、 简便、灵敏、重复性好等优点。 5、DNA序列测定
6、DNA芯片技术 DNA芯片技术是近年来兴起的基因分析与检测的新技术， 以其快速、敏感、高效、平行化、自动化等特点，将发 展成为新一代基因诊断技术。应用DNA芯片；不仅可以检 测基因的结构及其突变、多态性，而且可以对基因的表 达情况进行分析，因此在基因诊断中的应用前景非常广 阔
DNA芯片技术是近年来兴起的基因分析与检测的新技术， 以其快速、敏感、高效、平行化、自动化等特点，将发 展成为新一代基因诊断技术。应用DNA芯片；不仅可以检 测基因的结构及其突变、多态性，而且可以对基因的表 达情况进行分析，因此在基因诊断中的应用前景非常广 阔。 6、DNA芯片技术