第六章 基因文库构建与筛选 卜友泉 基础医学院生物化学与分子生物学教研室
第 六 章 基因文库构建与筛选 基础医学院生物化学与分子生物学教研室 卜友泉
1、cDNA文库、噬菌体文库、酵母人工染色体文库 的概念及其特点 2、基因文库概念及其意义 3、构建cDNA文库的流程及其筛选
1、 cDNA文库、噬菌体文库、酵母人工染色体文库 的概念及其特点 3、构建cDNA文库的流程及其筛选 2、基因文库概念及其意义
第一节工具酶、克隆载体 一、工具酶 分子克隆工具酶是一类用于DNA重组过程中不同DNA分子的制备、切 割、修饰、扩增、核酸分子的标记以及它们的核苷酸序列测定的酶。大多 数分子克隆工具酶都是来自不同的微生物和噬菌体，有少数酶则是来自动 物和动物病毒。 限制性内切酶限制性内切酶是一类主要分离于原核生物，能够识别双链 DNA(s-DNA)分子中特定核苷酸序列并将其切断的酶，常常简称为限制酶 (restriction enzymes). T4DNA连接酶T4DNA连接酶(T4 DNA Ligase)是分子克隆实验中最常用 的工具酶之一，该酶催化双链DNA分子中相邻的3'羟基和5'磷酸基间磷 酸二酯键的形成，它既可以连接两个具有粘性末端的DNA片段，也可以 连接两个具有平末端的DNA片段
分子克隆工具酶是一类用于DNA重组过程中不同DNA分子的制备、切 割、修饰、扩增、核酸分子的标记以及它们的核苷酸序列测定的酶。大多 数分子克隆工具酶都是来自不同的微生物和噬菌体, 有少数酶则是来自动 物和动物病毒。 限制性内切酶 限制性内切酶是一类主要分离于原核生物, 能够识别双链 DNA(ds-DNA)分子中特定核苷酸序列并将其切断的酶, 常常简称为限制酶 (restriction enzymes)。 T4 DNA连接酶 T4 DNA连接酶(T4 DNA Ligase)是分子克隆实验中最常用 的工具酶之一，该酶催化双链DNA 分子中相邻的3'-羟基和5'-磷酸基间磷 酸二酯键的形成，它既可以连接两个具有粘性末端的DNA片段，也可以 连接两个具有平末端的DNA片段。 第一节 工具酶、克隆载体 一、工具酶
DNA聚合酶 在基因工程操作中，常常需要以DNA或RNA作为模板合成 新的DNA链，这些新合成的链或是用于DNA标记，或是用于DNA序列分析， 或是用于DNA重组，或是用于某些感兴趣的DNA片段的扩增。因此，不 同的DNA聚合酶或反转录酶可用于上述的不同目的。 磷酸酶将DNA末端中的5端磷酸基除去，使其5？端变成0H基。该酶有2 个主要的用途：一是将载体末端的磷酸基除掉，避免在DNA重组时载体 分子的自我连接；另外和T4多聚核苷酸激酶连用，用于DNA的末端标记。 T4核苷酸激酶 广泛用于DNA和RNA的5'末端标记，标记时以[r-3P] ATP作为底物。采用转移反应可获得高水平的末端标记，但反应前必 须除去5'端未标记磷酸基
DNA聚合酶 在基因工程操作中，常常需要以DNA或RNA作为模板合成 新的DNA链，这些新合成的链或是用于DNA标记，或是用于DNA序列分析， 或是用于DNA重组，或是用于某些感兴趣的DNA片段的扩增。 因此，不 同的DNA聚合酶或反转录酶可用于上述的不同目的。 磷酸酶 将DNA末端中的5‘端磷酸基除去，使其5’端变成OH基。该酶有2 个主要的用途：一是将载体末端的磷酸基除掉，避免在DNA重组时载体 分子的自我连接；另外和T4多聚核苷酸激酶连用，用于DNA的末端标记。 T4核苷酸激酶 广泛用于DNA和RNA的5'末端标记，标记时以[r- 32P] ATP 作为底物。采用转移反应可获得高水平的末端标记，但反应前必 须除去5'端未标记磷酸基
末端脱氧核苷酸转移酶主要用于建立体外重组DNA分子时在DNA片段末 端加上一个同聚物尾巴，两种不同的DNA分子加上不同的但可以互补 (即A和T,C和G)的尾巴后，经过退火或复性，两种尾巴便可以借助互 补作用连接在一起。这种加尾方法在cDNA文库建立时是使cDNA插入载 体中的常用方法之一。 脱氧核糖核酸酶I一种非特异性的DNA内切酶，能降解双链DNA为5'磷 酸低聚核苷酸。DNaseI的酶活性需要二价阳离子作为辅助因子。其中 ,Ca艹和Mg艹或Ca艹和Mn艹使该酶达到最大活性。 核酸酶在基因工程中，有较多的核酸酶被用于作用RNA分子，最常用 的RNA酶有以下两种：RNaseA作用于RNA的专一性内切酶，它特异性 地作用于嘧啶核苷酸，该酶主要用于除去DNA制备物中的RNA
末端脱氧核苷酸转移酶 主要用于建立体外重组DNA分子时在DNA片段末 端加上一个同聚物尾巴，两种不同的DNA分子加上不同的但可以互补 (即A和T，C和G)的尾巴后， 经过退火或复性，两种尾巴便可以借助互 补作用连接在一起。这种加尾方法在cDNA文库建立时是使cDNA插入载 体中的常用方法之一。 脱氧核糖核酸酶I 一种非特异性的DNA内切酶，能降解双链DNA为5'磷 酸低聚核苷酸。DNaseI的酶活性需要二价阳离子作为辅助因子。其中 ， Ca++和Mg++或Ca++和Mn++使该酶达到最大活性。 核酸酶 在基因工程中，有较多的核酸酶被用于作用RNA分子，最常用 的RNA酶有以下两种：RNaseA 作用于RNA的专一性内切酶，它特异性 地作用于嘧啶核苷酸，该酶主要用于除去DNA制备物中的RNA
RNase H 该酶不象其它RNA酶那样会降解游离的RNA分子，它只能专一 性地分解DNA/RNA杂交分子中的RNA分子。该酶主要用于cDNA合成过程 中除去cDNA-RNA中的RNA链。 在分子克隆过程中，除了使用一些可直接作用于DNA的酶类外，还常常 要使用一些其他酶以便DNA,RNA的提取和纯化，或是用于基因的筛选， 下面仅列举几种常用酶的主要特性和用途。 细胞壁裂解酶该酶主要用于消化细菌的细胞壁，以便于染色体和质粒DNA 的提取。又如用于植物细胞壁裂解的纤维素酶、半纤维素酶和几丁酶等。 蛋白酶K该酶是一种具高活性的蛋白水解酶，它能使许多微生物和哺乳动 物细胞中的核酸酶失活。此酶在很宽的pH范围内（最适pH7.5-12)均具活性， 对热稳定，在高浓度的SDS,EDTA和尿素环境中仍具酶活性，所以它对于 RNA和高分子量DNA的提取纯化非常有用
RNase H 该酶不象其它RNA酶那样会降解游离的RNA分子，它只能专一 性地分解DNA/RNA杂交分子中的RNA分子。该酶主要用于cDNA合成过程 中除去cDNA-RNA中的RNA链。 在分子克隆过程中，除了使用一些可直接作用于DNA的酶类外，还常常 要使用一些其他酶以便DNA，RNA的提取和纯化，或是用于基因的筛选， 下面仅列举几种常用酶的主要特性和用途。 细胞壁裂解酶 该酶主要用于消化细菌的细胞壁，以便于染色体和质粒DNA 的提取。又如用于植物细胞壁裂解的纤维素酶、半纤维素酶和几丁酶等。 蛋白酶K 该酶是一种具高活性的蛋白水解酶，它能使许多微生物和哺乳动 物细胞中的核酸酶失活。此酶在很宽的pH范围内(最适pH7.5-12)均具活性， 对热稳定，在高浓度的SDS，EDTA和尿素环境中仍具酶活性，所以它对于 RNA和高分子量DNA 的提取纯化非常有用
二、克隆载体的基本结构和功能 所有的分子克隆载体都具备以下3个最基本的结构： 1)至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制； 2)至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入； 3)至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主 细胞。 由于DNA的复制是始于复制起点的，因此只要一个DNA分子有了复制起点 ，那么这个DNA分子就可以自主复制。如果一个分子克隆载体有了复制起点 ，那么该载体就可以在某种生物的细胞中自主复制，因此这个载体就可以多 拷贝地存在于某种细胞内
所有的分子克隆载体都具备以下3个最基本的结构： 1）至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制； 2）至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入； 3）至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主 细胞。 由于DNA的复制是始于复制起点的，因此只要一个DNA分子有了复制起点 ，那么这个DNA分子就可以自主复制。如果一个分子克隆载体有了复制起点 ，那么该载体就可以在某种生物的细胞中自主复制，因此这个载体就可以多 拷贝地存在于某种细胞内。 二、克隆载体的基本结构和功能
如果一个载体有两个或两个以上的复制起点，有两种情况：一是两个复 制起点适用的宿主细胞不一样，比如说，一个复制起点适合于大肠杆菌， 因为大肠杆菌是基因工程中使用频率最高的宿主菌，另一个复制起点适合 于另一种细菌或真核生物细胞，那么这种克隆载体常称之为穿梭载体 (shuttle vector),换言之，穿梭载体可在两种生物内进行来回的穿梭； 另一种情况是同一个载体中的两个复制起点都是适合于一种细胞的，只不 过这两个复制起点分别是在一定遗传背景条件下起作用，这种类型的载体 多数是属于大肠杆菌的载体
如果一个载体有两个或两个以上的复制起点，有两种情况：一是两个复 制起点适用的宿主细胞不一样，比如说，一个复制起点适合于大肠杆菌， 因为大肠杆菌是基因工程中使用频率最高的宿主菌，另一个复制起点适合 于另一种细菌或真核生物细胞，那么这种克隆载体常称之为穿梭载体 （shuttle vector），换言之，穿梭载体可在两种生物内进行来回的穿梭； 另一种情况是同一个载体中的两个复制起点都是适合于一种细胞的，只不 过这两个复制起点分别是在一定遗传背景条件下起作用，这种类型的载体 多数是属于大肠杆菌的载体
克隆教体的克隆位点 分子克隆载体的目的就是要将外源基因通过体外重组，形成重组DNA分子，然 后再转移到某种宿主细胞内，那么克隆载体就应该有一个位点供外源DNA插入 ，这个位点就是克隆位点。克隆位点一定是一个限制酶切位点，而且必须是由 6个核苷酸或6个核苷酸以上的序列组成的限制酶识别位点。 克隆载体的标记基因 既指示外源DNA是否进入了宿主细胞，又指示载体DNA分子中是否插入了外 源DNA片段。 克隆戴体的种类 按照克隆载体的功能或用途来划分，则可将DNA载体分为以下两大类： 1)普通型载体：这类载体主要用于各种基因组文库和cDNA文库的建立，比 如常用的pBR322,由衍生的载体和COs质粒，以及一些大肠杆菌-酿酒酵母 穿梭载体，如YRp7,YEpl3等。 2)表达型载体(expression vector):这类载体主要用于研究基因的表达或是用 于大量生产一些有用的转录产物或蛋白质，有的也可用于cDNA文库的建立
克隆载体的克隆位点 分子克隆载体的目的就是要将外源基因通过体外重组，形成重组DNA分子，然 后再转移到某种宿主细胞内，那么克隆载体就应该有一个位点供外源DNA插入 ，这个位点就是克隆位点。克隆位点一定是一个限制酶切位点，而且必须是由 6个核苷酸或6个核苷酸以上的序列组成的限制酶识别位点。 克隆载体的标记基因 既指示外源DNA是否进入了宿主细胞，又指示载体DNA分子中是否插入了外 源DNA片段。 克隆载体的种类 按照克隆载体的功能或用途来划分，则可将DNA载体分为以下两大类： 1) 普通型载体：这类载体主要用于各种基因组文库和cDNA文库的建立，比 如常用的pBR322，由λ衍生的载体和COs质粒，以及一些大肠杆菌-酿酒酵母 穿梭载体，如YRp7，YEp13等。 2) 表达型载体(expression vector)：这类载体主要用于研究基因的表达或是用 于大量生产一些有用的转录产物或蛋白质，有的也可用于cDNA文库的建立
第二节基因文库的构建 一、基因文库南 基因文库：利用重组体DNA技术将某种生物细胞的基因组DNA的所有 片段随机连接到基因载体上，转入合适的宿主细胞中，通过细胞 增殖而使外源片段扩增。当克隆数目多到足以把某种生物基因组 的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体称为该生物 的基因文库（gene library)。基因文库与基因库在意义上完全 不同，基因库是指某一生物群体中基因的总称
第二节 基因文库的构建 基因文库:利用重组体DNA技术将某种生物细胞的基因组DNA的所有 片段随机连接到基因载体上，转入合适的宿主细胞中，通过细胞 增殖而使外源片段扩增。当克隆数目多到足以把某种生物基因组 的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体称为该生物 的基因文库（gene library）。基因文库与基因库在意义上完全 不同，基因库是指某一生物群体中基因的总称。 一、基因文库